可促进植物扦插生根及顶端优势的植物表达载体及其应用

摘要

本发明涉及一种植物表达载体及其应用，该植物表达载体由质粒pBin19中插入pttGA20ox和rolB两个基因构建而成，其中pttGA20ox、rolB两个基因分别由35S和GH3启动子驱动。将该载体转化到植物中后得到的转化植株的扦插生根能力大大提高，顶端优势明显加强，并且没有明显的形态变异。因此，本发明构建的植物表达载体可用于转化扦插生根困难的树种，以增强该树种的扦插生根能力，并且加强其顶端优势。

说明书

【技术领域】

本发明涉及DNA重组载体，特别是涉及一种可促进植物扦插生根及顶端优势的双价基因植物表达载体及其应用。

【背景技术】

国内外在利用基因工程技术提高植物的扦插生根能力方面已经进行了很多研究。其中利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri(Root inducing)质粒中的rolB基因(在农杆碱型Ri质粒的TL-DNA区域分布有4个rol基因位点，分别命名为rolA基因、rolB基因、rolC基因和rolD基因。其中rolB基因是最主要的诱根因子)来促进植物生根能力研究的最多，但是有些转基因植物同时也产生了表型变异，如顶端优势削弱、节间缩短等。激素含量测定的结果表明，在矮化的突变体内具有生物活性的赤霉素含量呈下降趋势。已有的研究结果也表明GA20ox(GA20-氧化酶)是赤霉素代谢途径中最主要的代谢调控中心(赤霉素(Gibberellins，GAs)是植物生长发育过程中一类重要的调节激素，GA20ox是调控赤霉素生物合成的最主要的氧化酶。目前国外利用GA20ox促进植物的顶端优势也有成功的报道。例如，Hedden等指出拟南芥中的GA20ox(GA20ox1，ox2，ox3)基因表达具有组织特异性，但这些基因的任何一个超表达都会增加活性GAs(赤霉素(Gibberellins)的简称)的浓度，产生长的下胚轴。瑞典Thomas等在杨树幼苗中超表达GA20ox基因，结果杨树的顶端优势增强，次生木质部生长增加，产生了较长的纤维，增加了树木生物产量。

 【发明内容】

为了利用基因工程技术在提高植物扦插生根能力的同时恢复或提高由于转化rolB基因所导致的削弱的顶端优势，本发明构建了包含有35S/pttGA20ox、GH3/rolB两个基因(瑞典农业大学从杂交杨(Populus tremula L.×P.tremuloides Michx.)中克隆了PttGA20ox基因)的双价基因植物表达载体。rolB基因由农杆碱型Ri质粒克隆，rolB基因是最主要的诱根因子。利用本双价植物表达载体转化植物材料能够同时获得所转化的GA20ox、rolB两个基因的特征，即能够同时促进植物的扦插生根和顶端优势，而且转化植株不发生形态变异。

本发明首先利用DNA酶切的方法将rolB基因(rolB基因存在于PUC19克隆载体上)插入到pBin19质粒载体，其中pBin19质粒为11.7KB，是常用的基本质粒。然后利用Pfu DNA聚合酶通过PCR来扩增GA20ox基因，使用的引物为：

5′端引物：5’-GCCGGGATCCATGGCAATAGATTGCATC-3’(GCCG为保护碱基，GGATCC为BamH I酶切位点)；

3′端引物：5’-CACAGAGCTCGCTAATCCAACTCTTTATTGGTC-3’(CACA为保护碱基，GAGCTC为Sac I酶切位点)。将GA20ox基因插入到pBI121质粒载体的BamH I酶切位点和Sac I酶切位点之间(pBI121质粒大小为14.7KB，是常用的基本质粒中，在此基础上利用PyrobestDNA聚合酶克隆含有35S启动子及终止子的GA20ox基因(引物为：up：5’-AGAGGGTACCAAGCTTGCATGCCTGCAGG-3(含Kpn I酶切位点)；down：5’-ACACGCATGCCAGTGAATTCCCGATCTAG-3’(含Sal I酶切位点))插入到含有rolB基因的pBin19质粒载体中的Kpn I酶切位点和Sal I酶切位点之间，构建含有35S/pttGA20ox、GH3/rolB两个基因的双价基因植物表达载体。

本发明利用基因枪法将所构建的双价植物载体转化植物材料，或者将所构建的双价植物载体导入农杆菌中转化植物材料，获得的转化35S/pttGA20ox、GH3/rolB双价基因植物能够同时具备较高的生根能力和促进的顶端优势。

【附图说明】

图1为本发明构建的含有35S/pttGA20ox、GH3/rolB两个基因的双价基因植物表达载体的物理图谱。

图2为GH3/rolB基因表达载体的构建策略。

图3为35S/GA20ox基因表达载体的构建策略。

图4为双价基因表达载体的构建策略。

图5为转双价基因烟草与对照烟草的高生长比较的照片。

图6为转双价基因烟草与对照烟草的生根能力的比较的照片。

【具体实施方式】

实施例1  GH3/rolB基因表达载体的构建策略

GH3/rolB基因克隆在PUC19质粒载体中，通过测序在GH3/rolB两端含有EcoR I酶切位点，在表达载体pBin19的β-半乳糖苷酶基因中间也含有一个EcoR I酶切位点。因此选择EcoR I酶，利用酶切方法把GH3/rolB基因插入到pBin19质粒中去。重组质粒的筛选可以利用蓝白斑法、PCR法及EcoR I酶切法。

实施例2  35S/GA20ox基因表达载体的构建策略

pttGA20ox基因克隆在pGEX-4T-2质粒中，考虑到pttGA20ox基因的表达由35S驱动，选择了pBI121做为植物表达载体构建的质粒，在GUS基因片段的两端有Xbal I、BamH I与Sac I酶切位点可以利用。通过pttGA20ox基因序列分析后，确定利用PCR方法克隆pttGA20ox基因，在5’及3’端引物中分别加入Xbal I和Sac I酶切位点。pttGA20ox基因片段的大小在1.55KB左右，因此选择高保真性的pfu进行PCR扩增。

实施例3  双价基因表达载体的构建策略

在构建好pBin19rolB和pBI121GA植物表达载体的基础上，构建这两个基因的双价植物表达载体。通过对pBin19rolB和pBI121GA质粒进行酶切位点分析，pBin19rolB中的Kpn I和Sal I位点构建双价载体合适，但在pBI121GA质粒中没有此位点，因此又选择利用PCR方法进行构建。整个35S/GA/nos的大小在2.6KB左右，pfu无法扩增大于2.0KB的片段，因此又选择了另一个高保真的DNA聚合酶，PyrobestTM DNA聚合酶。此DNA聚合酶与pfu具有相同的保真性，并且与Taq DNA聚合酶具有相同的扩增效率，能够很好的扩增8KBp的DNA片段

实施例4  将本发明中构建的双价载体导入植物中获得转化植株

1、将本发明构建的含有35S/pttGA20ox、GH3/rolB两个基因的双价载体通过液氮法导入到农杆菌中；

2、预培养：取生长健壮的植物叶片，去主脉，用剪刀剪成1×1cm的方块，接种于不定芽诱导培养基上，预培养2天；

3、菌液浸染：将活化的农杆菌液稀释到OD值为0.5时的浓度，将叶片在菌液中浸染5分钟；

4、共培养：取出叶片，用无菌滤纸吸干，放回原来的培养基上，25℃暗培养2天；

5、脱菌培养：将叶片转移到只含有200mg/L的Cef(头孢霉素)的不定芽诱导培养基上，光照培养5-7天左右；

6、筛选培养：转移叶片至含50mg/L Kan(卡那霉素)和200mg/LCef的不定芽诱导培养基中，25℃、2000lux、光/暗周期16-18小时条件下选择培养；

7、继代培养：将获得的抗性芽在200mg/L Kam和200mg/L的Cef的生根培养基中进一步筛选。

实施例5  将本发明构建的双价载体导入烟草后的效果

利用实施例3所述的方法将本发明所构建的双价载体导入烟草后得到的转双价基因烟草的生根能力及顶端优势得到了明显的提高(见附图5和6)。主要表现为转基因烟草试管苗生根所需要的时间比对照提前3-5天，主根上出现大量的毛根，主根生长的速度比对照快；pttGA20ox基因对于促进植物的顶端优势具有十分明显的作用，转基因烟草的节间距一般为3-6cm，大大高于对照组，是对照组烟草的3-6倍。