人血清白蛋白与白细胞介素2的融合蛋白及其编码基因

摘要

本发明公开了一种人血清白蛋白与白细胞介素2的融合蛋白及其编码基因与应用，其目的是提供一种可延长人白细胞介素2的血浆半衰期的人血清白蛋白与白细胞介素2融合蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的人血清白蛋白与白细胞介素2的融合蛋白，包括与序列表中SEQ ID №：1具有至少85％序列同源性的氨基酸残基序列的第一区和与序列表中SEQ ID №：2具有至少85％序列同源性的氨基酸残基序列的第二区。实验证明，本发明的融合蛋白与rhIL－2相比，在小鼠血浆中的半衰期明显延长，可用于制备人白细胞介素2类药物和/或制备治疗与人白细胞介素2或其受体过量表达有关疾病的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种人血清白蛋白与白细胞介素2的融合蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

血清白蛋白是血浆的重要成份，也是许多内源因子和外源药物的载体，正常情况下不易透过肾小球。人血清白蛋白(HAS)是一种由585个氨基酸残基组成的蛋白质(序列表中序列1)(A.Dugaiczyk et al.，PNAS，1982 79：71-75)，其分子量约为66.5KD，血浆半衰期长达2周以上。

HSA在细胞中是以一种含18个氨基酸残基的信号肽和6个前肽的原肽形式合成的，信号肽和前肽在转运和分泌过程中被切除。人血清白蛋白已成功地在多种宿主中表达(EP330451和EP361991)。

白细胞介素2(IL-2)是T细胞和NK细胞产生的15.5kD糖蛋白，在机体的免疫应答中起重要作用。(人)白细胞介素2((h)IL-2)由133个氨基酸残基组成(序列表中序列2)，有一个链内二硫键，和一个位于成熟蛋白第125位氨基酸残基的半胱氨酸，这个半胱氨酸易与另两个半胱氨酸形成错配二硫键，二硫键异常配对的IL-2没有活性。将该半胱氨酸突变为丝氨酸或丙氨酸可以避免这个问题，而不改变其活性。IL-2主要作用于免疫细胞，包括T细胞、大颗粒淋巴细胞、单核细胞、B细胞和少突神经胶质细胞，促进细胞增殖和分泌细胞因子。在体内，IL-2有抗肿瘤、抗微生物感染及免疫调节等作用。单独使用或与IFN-α、单克隆抗体、LAK细胞等合用于临床，对肾细胞癌、转移性黑色素瘤和淋巴瘤等有一定的治疗作用，对结肠癌也有疗效，还能提高肿瘤病人对放、化疗的耐受性。目前临床上将其广泛用于肿瘤、病毒性肝炎等的治疗，疗效显著。但上述疾病一般病程较长，因而需长期使用IL-2，而IL-2的血浆半衰期仅为2小时左右，为维持药效需大剂量频繁注射，这不仅大大提高了治疗成本，而且增加了病人的痛苦，增加了副反应。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种可延长人白细胞介素2的血浆半衰期的人血清白蛋白与白细胞介素2融合蛋白及其编码基因。

本发明所提供的人血清白蛋白与白细胞介素2的融合蛋白，包括与序列表中SEQID №：1具有至少85％序列同源性的氨基酸残基序列的第一区和与序列表中SEQ ID №：2具有至少85％序列同源性的氨基酸残基序列的第二区。

序列表中SEQ ID №：1是由585个氨基酸残基组成的人血清白蛋白；序列表中SEQ ID №：2是由133个氨基酸残基组成的人白细胞介素2。

其中，人血清白蛋白与白细胞介素2的融合蛋白优选的是包括与序列表中SEQ ID№：1具有至少95％序列同源性的氨基酸残基序列的第一区和与序列表中SEQ ID №：2具有至少95％序列同源性的氨基酸残基序列的第二区；最优选的是包括序列表中SEQID №：1的氨基酸残基序列的第一区和序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的第二区，或上述二区的功能等同物，所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对所述融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或添加得到的多肽。

其中，所述取代可发生在序列表中SEQ ID №：2的自氨基端的第125位半胱氨酸，可被丝氨酸或丙氨酸取代。

在本发明的融合蛋白中，可以是与序列表中SEQ ID №：1同源的第一区位于融合蛋白的N-末端，与序列表中SEQ ID №：2同源的第二区位于融合蛋白的C-末端；也可以是与序列表中SEQ ID №：2同源的第二区位于融合蛋白的N-末端，与序列表中SEQ ID №：1同源的第一区位于融合蛋白的C-末端，但前一种情况的基因在酵母中的表达较高。

为了使融合蛋白两部分间有较大的间隔，使人白细胞介素2部分最大可能地与白细胞介素2受体结合，所述与序列表中SEQ ID №：1同源的第一区与序列表中SEQ ID№：2同源的第二区之间设有连接肽，所述连接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]_n，n为1-10的整数；其中，优选的是n为1-3的整数。

上述人血清白蛋白与白细胞介素2的融合蛋白最好为具有序列表中SEQ ID №：4氨基酸残基序列的蛋白质。

序列表中SEQ ID №：4是由723个氨基酸残基序列组成的蛋白质，其中自氨基端的第1位-第585位为人血清白蛋白的编码序列，自氨基端的第586位-第590位为连接肽的编码序列GlyGlyGlyGlySer，自氨基端的第591位-第723位为人白细胞介素2的编码序列。

上述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围，其中，优选的是由序列表中SEQ ID №：4的氨基酸残基序列组成的人血清白蛋白与白细胞介素2的融合蛋白的编码基因，它是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：4蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：3限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中SEQ ID №：3的DNA序列由2253个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第9到第2253位碱基。

含有上述编码基因的重组表达载体和细胞系均属于本发明的保护范围。所述重组表达载体可为pHIL-D2HSAIL-2、pHIL-D2HSAIL-20、pHIL-D2HSAIL-22、pHIL-D2HSAIL-23、pPIC9-IL-2-HSA质粒等；所细胞系可为含有上述编码基因的细菌、酵母、动物细胞或植物细胞；其中优选的是酵母，更优选的是毕赤酵母，最优选的是毕赤酵母GS115。

人血清白蛋白天然存在多态性，本发明融合蛋白中的人血清白蛋白部分也包括这些多态型。

编码HSA的多聚核苷酸和编码hIL-2的多聚核苷酸可以用本领域周知的方法，如PCR(Saiki等Science.239：487-491，1988)、RT-PCR方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA文库的方法等获得，用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞、及文库等，如从人肝胎cDNA文库(购自Clontech Laboratories Inc.USA)获得。也可以用人工合成的方法获得，人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，这样往往可以提高产物的表达。根据需要，可用本领域公知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入、和与其它多聚核苷酸连接等。编码HSA和编码hIL-2的多聚核苷酸的融合，在保持各自阅读框架不变的前提下，可以用本领域周知的各种方法，如通过PCR的方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点，通过酶切产生粘性末端，编码HSA和编码hIL-2的多聚核苷酸的粘性末端用DNA连接酶连接，从而获得编码融合蛋白的基因。如果需要，可在本发明的编码融合蛋白基因的两侧引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)。

表达载体和其对应的宿主可以从公司购得，如酵母表达载体pHIL-D₂，pPIC9，pHIL-S₁(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)，动物细胞表达载体pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。优选的方法是将编码本发明的融合蛋白或多肽的核酸克隆至酵母表达载体pHIL-D₂，pPIC9等，这些质粒为酵母整合型质粒，带有His4选择性标记。醇氧化酶操纵子(AOX1)5’序列和3’序列，用于方便编码基因整合至酵母染色体，和控制编码基因的表达。这些质粒及对应的宿主菌等可以从Invitrogen Corp.San Diego.California.USA构得，优选的启动子为AOX1。

表达本发明的融合蛋白的宿主可以是酵母、哺乳动物细胞、细菌、动物、植物等。表达的融合蛋白或多肽可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的表达方式是从宿主中分泌出来。分泌所用的信号肽，优选的是天然的人血清白蛋白的信号肽，或酵母MFα信号肽，或这两种信号肽的类似物。更优选的用天然的人血清白蛋白的信号肽，用该信号肽时融合蛋白表达水平较高。融合蛋白或多肽也可以不用信号肽，而在酵母中以胞内可溶形式表达。编码融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。

将所需核酸导入宿主细胞可用通常的方法，如：电穿孔，制备感受态的原生质球等。阳性细胞，即含有本发明DNA重组体的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴定；细胞培养上清液中或细胞破碎液中的蛋白可用抗HSA或抗IL-2的抗体检测。

可以通过培养含有本发明DNA重组载体的宿主，如重组酵母、重组哺乳动物细胞、重组细菌、转基因动植物等，生产本发明的融合蛋白。具体的培养方法可以用摇瓶或生物反应器等，生产时优选为生物反应器。所用培养基应能提供菌体(或细胞)生长和产物表达所需的营养物质，应包含氮源、碳源、pH缓冲成分等，培养基配方一般应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分为两个阶段，第一阶段主要用于菌体(或细胞)的生长，第二阶段主要用于合成产物。

可以用各种分离蛋白的方法分离、纯化本发明的融合蛋白，如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。

本发明的融合蛋白可以有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于其不同形式的盐、修饰产物等，如在多肽的氨基、羧基、羟基、巯基上再进行修饰；所用修饰剂可以但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。

本发明的融合蛋白及其衍生物可单独使用，优选的为与一个或多个药学上可接受的载体一起组成药物制剂。药物载体一般应与融合蛋白相容且不能对受体自身有害，典型的载体为水、盐水、糖类、醇类或氨基酸，它们需无菌且无致热原。药物制剂可以单位剂量的形式存在，优选的单元剂量包括有融合蛋白的日用剂量或单元日用剂量或其适当的亚分，并可通过任何本领域已知的方法制备。这些方法包括将融合蛋白与一种或多种辅助成分混合的步骤。优选的药物制剂包括含水的液体制剂和含水量低于10％或不含水的冻干制剂(冻干制剂是将液体制剂冷冻干燥制备的，使用前加入无菌、无热原的液态载体，如注射用水)。这些制剂可以含有缓冲剂，盐类，小分子糖类等，使药物的渗透性与受体血液中的渗透性相等或相似。药物制剂可存在于单元剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓶，西林瓶或小管中。

本发明的融合蛋白及其衍生物或其药物组合物可以通过任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、静脉输注、透皮、吸入、口服等方法给药。优选的方法为静脉输注或注射给药。治疗方式包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。

本发明的融合蛋白既可以保留激活人白细胞介素2受体的活性，作为该受体的激动剂，制成人白细胞介素2类药物，也可以仅保留与该受体结合的活性，作为该受体的抑制剂，制成治疗某些与人白细胞介素2或其受体过量表达有关疾病的药物。本发明的融合蛋白及其衍生物或其药物组合物，作为IL-2类药物可单独使用或与IFN-α、单克隆抗体、LAK细胞等合用用于治疗各种可用IL-2治疗的疾病，这些疾病可以是肿瘤、微生物感染等，如肾细胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤结肠癌、病毒性肝炎等的治疗。作为IL-2受体抑制剂可用于治疗某些与白细胞介素2或其受体过量表达有关的疾病，如某些白血病等。使用剂量可通过融合蛋白相对于人白细胞介素2(hIL-2)的效价计算出，同时考虑融合蛋白相对于天然hIL-2延长的半衰期。典型用量为6.25×10⁴-6×10⁵IU/kg。在由全长HSA和全长h IL-2形成的融合蛋白中，按照摩尔数相当即意味着使用较大重量的融合蛋白，但使用频率可降低，如一周三次、一周两次、一周一次或更少。

本发明将人血清白蛋白分子，或与其具有至少85％序列同源的类似物或片段与人白细胞介素2，或与其具有至少85％序列同源的类似物或片段融合，所形成的融合蛋白既保留了与人白细胞介素2受体结合的活性，同时与人白细胞介素2相比，其血浆半衰期又得到了延长。实验证明，本发明的融合蛋白与rhIL-2相比，在小鼠血浆中的半衰期明显延长。

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为pHIL-D2HSAIL-2质粒的构建过程示意图

图2为pD3HSAIL-20质粒的构建过程示意图

图3为pD3HSAIL-22质粒的构建过程示意图

图4为pPIC9-IL-2-HSA质粒构建过程示意图

图5为纯化的融合蛋白HSA/IL-2的SDS-PAGE分析

图6为融合蛋白HSA/IL-2酶联免疫分析

图7为融合蛋白HSA/IL-2对CTLL-2细胞的刺激活性

具体实施方式

实施例1、hIL-2cDNA的克隆和HSA cDNA的克隆

1、hIL-2cDNA的克隆

(1)人外周血白细胞总RNA的制备

静脉抽取正常成年人血液5mL，肝素钠抗凝。将血液用RPMI 1640培养基倍比稀释后，加入淋巴细胞分离液，以2000r/min离心20min。吸取白细胞层，用含100ml/L小牛血清的RPMI 1640培养基洗细胞3次并将细胞数调整为1×10⁹/L，加入终浓度为60mg/L的PHA，于37℃、50ml/L CO₂培养箱中活化5h。收集细胞，用总RNA提取试剂盒，从细胞中提取总RNA用于反转录反应。

(2)hIL-2cDNA的克隆

按照RT-PCR试剂盒的方法进行反转录反应。以获得的反转录产物作为模板进行PCR获得hIL-2cDNA，所用的引物IL-2a和IL-2b用寡聚核苷酸合成仪合成。

IL-2a：5’ATGGATCC GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA AC 3’

IL-2b：5’GAGAATTC TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT GCT TTG AGA AAA GGT AATCCA3’

PCR方法为：

100μl反应体系中加入1μl人淋巴细胞cDNA，20μmol/L的IL-2a、IL-2b引物各2μl，2mmol/L的dNTP 8μl，10×反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海生物工程技术服务有限公司产品)。用Perk-Elmer公司的9600 PCR仪，PCR条件为94℃变性30秒，52℃退火1分钟，72℃延伸30秒，循环32次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(0.4kb)的条带，PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。用BamH I和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化后，克隆到用BamH I/EcoR I酶解的pUC19质粒上(实验中的pfu酶、内切酶、连接酶、pUC19质粒、试剂盒等购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司)，形成pUC-IL-2。BamH I-EcoR I区DNA测序结果表明此PCR产物序列和hIL-2序列相同，只是在其5’端和3’端分别加入了BamHI位点和EcoR I位点。并在3’-端EcoR I位点前加入了终止密码子。

2、HSA cDNA的克隆

用PCR方法从人肝胎cDNA文库(购自Clontech Laboratories Inc.USA)获得带有信号肽和前肽编码序列的HSA cDNA，所用的引物HSA1和HSA2用寡聚核苷酸合成仪合成。

HSA1：5’GCTTCGAAACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCT3’(划线的碱基序列为酶切位点)

HSA2：5’TAGGATCCACCACCACCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC3’(划线的碱基序列为酶切位点)

PCR条件为：100μl反应体系中，加入1μl人肝胎cDNA文库，20umol/L的HSA1和HSA2引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反应缓冲液10μl，TaqplusI DNA聚合酶5U。用Perk-Elmer公司的9600 PCR仪，PCR条件为94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，35个循环后，再72℃延伸10分钟。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(1.8KD)的条带，PCR产物电泳纯化，用DNA片段回收试剂盒回收纯化约1.8KD的目标带(实验中的TaqplusI DNA聚合酶、内切酶、连接酶、试剂盒等购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司)。取纯化的HSA cDNA 6μl，加入1μl pGEM-T载体，8μl2×缓冲液，1μl T4DNA连接酶(pGEM-T载体、缓冲液和酶为Promega Corp.USA产品)，15℃反应过夜，转化JM109感受态细胞(细胞购自北京博大泰克生物基因技术有限公司)。转化菌于含x-gal和IPTG和氨苄青霉素(50ug/ml)的LB琼脂平皿上，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种至3ml含氨苄青霉素(50ug/ml)的LB培养基，37℃培养过夜，用常规方法抽提质粒，用PstI酶切，(在载体上和HSA cDNA上各有PstI酶切位点)，电泳分析鉴定阳性克隆。从pGEM-T载体的多克隆位点两端分别测序，并合成两个测序引物：

HSA3：5’GCCAGAAGACATCCTTAC3’

HSA4：5’AGTTGGAGTAGACACTTG3’

从两端中部接着测序，完成HSA cDNA全长测序。获得了含有与天然HSA cDNA序列一致的克隆，JM109(pGEMT-HSA)，这里克隆的HSA含有其天然的信号肽和前肽部分，以便于在表达时，直接利用其信号肽和前肽用于作为分泌信号。

实施例2、连接肽为GlyGlyGlyGlySer时，本发明融合蛋白的表达

为了将HSA与hIL-2以融合蛋白形式从毕赤酵母分泌表达，如图1所示，选择pHIL-D2质粒作为载体(Invitrogen Corp.USA)。在该载体AOX启动子下游NspV与EcoRI位点间插入HSA/IL-2基因，因pHIL-D2载体上有两个NspV位点，为了方便操作，首先pHIL-D2载体用ClaI/ScaI酶切成3段，回收4kb片段，自身连接后命名为pD3载体。pD3载体用NspV/EcoRI切，回收线性化载体，将实施例1构建的pUC-IL-2用BamHI/EcoRI切，回收约0.5kb的含IL-2cDNA的片段，将实施例1构建的pGEMT-HSA用NspV/BamHI切，回收约1.8kb的含HSAcDNA的片段，将线性化pD3载体与含HSAcDNA，IL-2cDNA的片段用T4连接酶催化连接，转化JM109，挑选阳性克隆，分别用NspV/EcoRI和NspV/BamHI酶切鉴定，获得结构正确，带有编码含GlyGlyGlyGlySer接头肽的HSA-IL-2融合蛋白基因的阳性克隆JM109(pD3HSAIL-2)。pD3HSA IL-2质粒，用ClaI/ScaI酶切，电泳回收线性化的6.3kb片段，pHIL-D2空载体用ClaI/ScaI切回收约4.2kb的片段。T₄连接酶催化连接pD3HSAIL-2的6.3kb片段与pHIL-D2的4.2kb片段，连接产物转化JM109后，铺于含氨苄青霉素(50ug/ml)的LB琼脂平皿，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定，获得克隆JM109(pHIL-D2HSAIL-2)。再抽提该质粒约10μg，用NotI酶切。线性化后转化毕赤酵母GS115(酵母表达试剂盒由InvitrogenCorp.USA提供)，转化后的GS115，铺于含山梨醇的RDB琼脂平皿(1mol/L山梨醇，1％葡萄糖，4×10^-5％生物素，1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Difco Corp.)，0.005％氨基酸混合液(谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸各0.005％))，37℃培养1-2周，挑取His⁺克隆。接种至装有25mlBMGY培养基(100mmol/L磷酸钾，pH6.0，4×10^-5％生物素，1.34％无氨基酸酵母氮源，1％甘油)的300ml三角瓶，250转/分钟30℃培养48小时，加甲醇0.5％/24h，诱导培养4天，离心取上清，过滤除菌。用CTLL-2测定培养上清中IL-2的活性。活性测定的方法参见《中国生物制品规程》2000版(中国生物制品标准化委员会编，化学工业出版社2000.6)P396-398。将CTLL-2细胞培养于含10％小牛血清和400-800IU/ml rhIL-2的1640培养基(Gibco BRL USA)中。每周传代3次，用前用含10％小牛血清的1640培养基洗细胞4次，稀释至5×10⁵细胞/ml。在96孔板上，样品用含10％小牛血清的1640培养基作适当稀释，每孔50μl，每孔再加细胞50μl，5％CO₂，37℃培养18-24小时后，加MTT溶液(噻唑蓝溶液，用磷酸盐缓冲液配成5.0mg/ml的溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌)20μl，继续培养4-6小时，加20％SDS(十二烷基磺酸钠)溶液，37℃孵育18-24小时，用酶联仪测定各样品孔的吸光度值，挑选吸光度值高的克隆即为高表达克隆。得到的产物经SDS-PAGE分析，分子量正确，酶联免疫分析证明其具有血清白蛋白和人白细胞介素2的特性。同时CTLL-2细胞测活结果表明产物具有hIL-2的生物活性。

实施例3、HSA/IL-2(Ser¹²⁵)融合蛋白的表达

本实施例提供一种IL-2成熟蛋白第125位半胱氨酸突变为丝氨酸的HSA/IL-2(Ser¹²⁵)融合蛋白的制备方法：用与实施例1和2相同的方法构建pHIL-D2HSAIL-2，以之为模板，用PCR获得hIL-2(Ser¹²⁵)cDNA，所用的引物IL-2a和IL-2(Ser125)：用寡聚核苷酸合成仪合成。

IL-2a：ATGGATCC GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA AC(划线的碱基序列为酶切位点)

IL-2(Ser125)：5’GAGAATTCTTATGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGACTAAAGGTAATCCATCTGTTCAG(划线的碱基序列为酶切位点)

PCR方法为：

100μl反应体系中加入1μl 100倍稀释的pD2HSA IL-2，20μmol/L的IL-2a、IL-2(Ser125)引物各3μl，2mmol/L的dNTP 10μl，10×反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海生物工程技术服务有限公司产品)。用Perk-Elmer公司的9600 PCR仪，PCR条件为94℃变性1分钟，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环25次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(0.4kb)的条带，PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。用BamH I和EcoRI酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，与BamHI/EcoRI酶解切除IL-2编码序列的pD2HSAIL-2质粒连接(实验中的pfu酶、内切酶、连接酶、pUC19质粒、试剂盒等购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司)，形成pD2HSAIL-2(Ser125)。DNA测序结果表明突变正确。pD2HSA IL-2(Ser125)用NotI酶切，线性化后，用与实施例2相同的方法构建转化毕赤酵母GS115，筛选高效表达pD2HSA/IL-2(Ser125)融合蛋白的工程酵母。

实施例4、IL-2/HSA融合蛋白的表达

pPIC9-IL-2-HSA质粒构建过程如图4所示，具体可包括以下过程：

用与实施例1相似的PCR方法从肝胎cDNA文库获得hIL-2cDNA，所用的引物改为IL-2c和IL-2d，引物用寡聚核苷酸合成仪合成。

IL2c：5’ATGAATTC CTCCGAG AAA AGA GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA AC3’(划线的碱基序列为酶切位点)

IL-2d：5’TAGGATCCACC ACC GCC AGT TAG TGT TGA GAT GAT GCT TTG AGA AAA GGTAAT CCA(划线的碱基序列为酶切位点)

PCR扩增后，在cDNA的5’-端引入一个EcorI位点和一个XhoI位点，同时在XhoI位点下游引人了KEX2酶切位点，用以切除表达的融合蛋白的信号肽，3’端引入BamHI位点。PCR产物电泳纯化后，克隆到用BamH I/ecoRI，酶解的pUC19(北京博大泰克生物基因技术有限公司)质粒上，形成pUC-IL-2。DNA测序结果表明此克隆序列和hIL-2序列相同，只是在其5’-端加入了EcoRI位点、XhoI位点、KEX2酶切位点，和3’端去除了终止密码子，加入了柔性接头GlyGlyGlyGlySer的编码序列GGTGGTGGTGGATCC。

用PCR的方法从人肝胎cDNA文库获得HSA cDNA，所用的引物HSA5和HSA6用寡聚核苷酸合成仪合成：

HSA5：5’-TAGGATCC GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT-3’

HSA6：5’-ATGAATTC TTAAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3’

PCR方法同实施例1，PCR产物电泳纯化后，克隆到用BamHI/SalI，酶解的pUC19(北京博大泰克生物基因技术有限公司)质粒上，形成pUCHSA2。DNA测序结果表明此克隆序列和HSA成熟肽的编码序列相同，只是在其5’-端加入了BamHI位点，和3’端终止密码子后加入SalI位点。

选择pPIC9质粒作为表达载体(Invitrogen Corp.USA)。在该载体AOX启动子下游XhoI与EcoRI位点间插入IL-2/HSA基因。将上面构建的pUC19-IL-2用BamHI/EcoRI酶切，回收约0.4kb的含IL-2cDNA的片段；将pUCHSA2用BamHI/SalI酶切，回收约1.8kb的含HSA cDNA的片段；将pPIC9质粒用SalI/EcoRI酶切，回收线性化片段，将这三个片段用T₄DNA连接酶连接，转化JM109，挑选阳性克隆，分别用SalI/BamHI和BamHI/EcoRI酶切鉴定，获得结构正确，带有接头肽GlyGlyGlyGlySer的融合蛋白IL-2-HSA基因的阳性克隆JM109(pPIC9 IL-2-HSA)。pPIC9 IL-2-HSA质粒用Bg/II酶切线性化后，转化毕赤酵母GS115(Invitrogen Corp.USA公司酵母表达试剂盒提供的方法)，转化后的GS115，铺于含山梨醇的RDB琼脂平皿(配方同实施例2)，37℃培养1-2周，挑取His⁺克隆。摇瓶培养和表达菌株筛选方法同实施例2，工程酵母的培养、产物纯化、IL-2活性测定、HSA抗原性测定方法同实施例2。结果表明表达的IL-2/HSA融合蛋白分子量正确，有刺激CTlL-2细胞增殖，即hIL-2的活性和HSA的抗原性，但表达水平低于实施例2的HSA/IL-2。

实施例5、带不同接头的融合蛋白的表达

质粒pD3HSAIL-20的构建过程如图2所示，将实施例2中构建的质粒pD3HSAIL-2，用BamHI/StuI双酶切，回收大片段，用绿豆芽核酸酶处理，切除突出末端，T4DNA连结酶平端连接，转化JM109菌，挑选阳性克隆，酶切鉴定，获得带有在HSAcDNA末端缺失CTT(亮氨酸)后与IL-2 cDNA直接融合基因的质粒pD3HSAIL-20。

同样，在HSA和IL-2可以加入多种柔性接头，如[GlyGlyGlyGlySer]_n，n可以是1-10。如当n＝2时，可合成寡聚核苷酸：

L2a：5’CCTTGGTGGTGGCGGTTCCGGCGGTGGTG 3’

L2b：5’GATCCACCACCGCCGGAACCGCCACCACCAAGG3’

pD3HSAIL-22质粒的构建过程如图3所示，将实施例2中构建的质粒pD3HSAIL-2，用BamHI/StuI双酶切，回收大片段，寡聚核苷酸L2a与L2b退火后与回收的大片段连接，转化JM109，挑取阳性克隆，酶切鉴定和序列分析，获得带有在HSAcDNA末端与IL-2cDNA间插入编码[GlyGlyGlyGlySer]₂(即GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)柔性接头的寡聚核苷酸的质粒pD3HSAIL-22。

当n＝3时，可合成寡聚核苷酸：

L3a：5’CCTTGGTGGTGGCGGTTCCGGCGGTGGTGGCTCCGGTGGCGGCG3’

L3b：5’GATCCGCCGCCACCGGAGCCACCACCGCCGGAACCGCCACCACCAAGG3’

将实施例2中构建的质粒D3HSAIL-2，用BamHI/StuI双酶切，回收大片段，寡聚核苷酸L3a与L3b退火后与回收的大片段连接，转化JM109，挑取阳性克隆，酶切鉴定，获得带有在HSAcDNA末端与GM-CSF cDNA间插入编码[GlyGlyGlyGlySer]₃(即GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)柔性接头的寡聚核苷酸的质粒pD3HSAIL-23。可用相似的方法改造实施例4构建的pPIC9 IL-2-HSA质粒，以在IL-2与HSA间插入不同的接头。

将以上构建的质粒，如pD3HSAIL-20、pD3HSAIL-22、pD3HSAIL-23分别用与实施例2相同的方法构建对应的质粒pHIL-D2HSAIL-20、pHIL-D2HSAIL-22、pHIL-D2HSAIL-23，并转化毕赤酵母GS115，获得表达HSA末端缺失亮氨酸后与IL-2直接融合的HSA/IL-20融合蛋白、HSA与IL-2间插入[GlyGlyGlyGlySer]₂柔性接头的融合蛋白HSA/IL-22、及HSA与IL-2插入[GlyGlyGlyGlySer]₃柔性接头的融合蛋白HSA/IL-23等。得到的产物SDS-PAGE分析，分子量正确，酶联免疫分析证明其具有血清白蛋白和人白细胞介素2的特性。同时CTLL-2细胞测活结果表明产物具有hIL-2的生物活性。

实施例6、工程酵母的发酵和融合蛋白的纯化

以实施例2构建的表达HSA/IL-2融合蛋白的工程酵母发酵和融合蛋白的纯化为例，其它工程酵母的发酵和融合蛋白的纯化可用相同或相似的方法。

工程酵母接种100mlYPD培养基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L)，摇床30℃，280转/分钟培养24h。接种至装有2.5L基础培养基的5L发酵罐(B.Braun Corp.Germany)，其中基础培养基的配制方法为：浓磷酸3.5ml/L，CaSO₄.2H₂O 0.15g/L，K₂SO₄ 2.4g/L，MgSO₄.7H₂O 1.95g/L，KOH 0.65g/L，121℃高压灭菌30分钟，再加入30ml/L甘油(单独121℃高压灭菌30分钟)，1ml/L PTM(配方为CuSO₄.5H₂O 6.0g/L，CoCl₂.6H₂O 3.0g/L、MnSO₄.H₂O 3.0g/L，H₃BO₃ 0.02g/L，FeSO₄.7H₂O 65.0g/L NaMoO₄.2H₂O 0.2g/L，ZnSO₄.7H₂O 20.0g/L，KI 0.1g/L，浓H₂SO₄5ml/L，121℃高压灭菌30分钟)，0.5ml/L 0.02％生物素(过滤除菌)。接种前用氨水将培养基pH调至5.8。发酵过程控制温度为30℃，溶氧始终大于20％饱和度，pH值不高于6.0，培养至甘油耗尽后，开始流加甘油(50％甘油，加12ml/LPTM，2ml/L0.02％生物素)，继续培养，至密度OD₆₀₀值约为150时，开始补加甲醇(分析纯甲醇，加12ml/LPTM，2ml/L 0.02％生物素)诱导。诱导培养48-72小时。50ml培养液离心取上清，加入硫酸铵至20％饱和度，混匀后4℃放置过夜，离心取沉淀，用3ml25mmol/LTris-HCl(pH7.0)溶解，用Supdex 200(Amersham Pharmacia Biotech UK)Φ1.6×100cm柱层析分离，流动相为25mmol/LTris-HCl(pH7.0)，150mmol/LNaCl，流速为1ml/L，紫外检测，收集第一峰(保留时间为70-85分钟)，即为纯化的融合蛋白，SDS-PAGE分析呈均一条带，如图5所示，其中1为分子量标准，自上而下分别为94，67，43，30KD；2为纯化前的HSA/IL-2样品；3-5为纯化的HSA/IL-2。用CTLL-2细胞测定HSA/IL-2的活性(《中国生物制品规程》2000版(中国生物制品标准化委员会编，化学工业出版社2000.6P396-398)。将CTLL-2细胞培养于含10％小牛血清和400-800IU/ml rhIL-2的1640培养基(Gibco BRL USA)中。每周传代3次，用前用含10％小牛血清的1640培养基洗细胞4次，稀释至5×10⁵细胞/ml。在96孔板上，样品HSA/IL-2用含10％小牛血清的1640培养基作适当稀释后在96孔板上作2倍稀释，每孔50μl，每孔再加细胞50μl，5％CO₂，37℃培养18-24小时后，加MTT溶液(噻唑蓝溶液，用磷酸盐缓冲液配成5.0mg/ml的溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌)20μl，继续培养4-6小时，加20％SDS(十二烷基磺酸钠)溶液，37℃孵育18-24小时，用酶联仪测定各样品孔的吸光度值，与标准品对照，计算样品HSA/IL-2的活性，如图7所示，横轴为2倍梯度稀释的孔数，纵轴是吸光度值，测得纯化样品HSA/IL-2的活性为3×10⁶U/mg。用样品HSA/IL-2稀释后包被酶联板，分别用兔抗人血清白蛋白抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为二抗，检测样品HSA/IL-2，结果如图6所示，从图中的结果可知，样品HSA/IL-2具有HSA的抗原性。

取相同活性剂量的融合蛋白HSA/IL-2和rhIL-2，小鼠尾静脉给药，不同时间取血清用CTLL-2细胞(方法同上)测定其中的IL-2活性。与rhIL-2相比，融合蛋白HSA/IL-2在小鼠血浆中的半衰期约为15h左右。

                            序列表

<160>4

<210>1

<211>585

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly

 1               5                   10                  15

Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr

                 20                  25                  30

Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu

                 35                  40                  45

Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu

                 50                  55                  60

Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys

                 65                  70                  75

Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu MET Ala Asp Cys

                 80                  85                  90

Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His

                 95                 100                 105

Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

                110                 115                 120

Asp Val MET Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu

                125                 130                 135

Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr

                140                 145                 150

Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe

                155                 160                 165

Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro

                170                 175                 180

Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys

                185                 190                 195

Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala

                200                 205                 210

Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys

                215                 220                 225

Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

                230                 235                 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp

                245                 250                 255

Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser

                260                 265                 270

Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu

                275                 280                 285

Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu MET Pro Ala

                290                 295                 300

Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val

                305                 310                 315

Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe

                320                 320                 330

Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu

                335                 340                 345

Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

                350                 355                 360

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp

                365                 370                 375

Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln

                380                 385                 390

Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn

                395                 400                 405

Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr

                410                 415                 420

Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser

                425                 430                 435

Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu

                440                 445                 450

Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu

                455                 460                 465

Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

                470                 475                 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

                485                 490                 495

Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His

                500                 505                 510

Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys

                515                 520                 525

Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr

                530                 535                 540

Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val

                545                 550                 555

Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu

                560                 565                 570

Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

                575                 580                 585

<210>2

<211>133

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

 1                   5              10                   15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn

                20                  25                   30

Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr

                35                  40                   45

Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

                50                  55                   60

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser

                65                  70                   75

Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn

                80                  85                   90

Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys

                95                  100                 105

Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg

                110                 115                 120

Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

                125                 130         133

<210>3

<211>2253

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ttcgaaacca tgaagtgggt aacctttatt tcccttcttt ttctctttag ctcggcttat    60

tccaggggtg tgtttcgtcg agatgcacac aagagtgagg ttgctcatcg gtttaaagat    120

ttgggagaag aaaatttcaa agccttggtg ttgattgcct ttgctcagta tcttcagcag    180

tgtccatttg aagatcatgt aaaattagtg aatgaagtaa ctgaatttgc aaaaacatgt    240

gtagctgatg agtcagctga aaattgtgac aaatcacttc ataccctttt tggagacaaa    300

ttatgcacag ttgcaactct tcgtgaaacc tatggtgaaa tggctgactg ctgtgcaaaa    360

caagaacctg agagaaatga atgcttcttg caacacaaag atgacaaccc aaacctcccc    420

cgattggtga gaccagaggt tgatgtgatg tgcactgctt ttcatgacaa tgaagagaca    480

tttttgaaaa aatacttata tgaaattgcc agaagacatc cttactttta tgccccggaa    540

ctccttttct ttgctaaaag gtataaagct gcttttacag aatgttgcca agctgctgat    600

aaagctgcct gcctgttgcc aaagctcgat gaacttcggg atgaagggaa ggcttcgtct    660

gccaaacaga gactcaaatg tgccagtctc caaaaatttg gagaaagagc tttcaaagca    720

tgggcagtgg ctcgcctgag ccagagattt cccaaagctg agtttgcaga agtttccaag    780

ttagtgacag atcttaccaa agtccacacg gaatgctgcc atggagatct gcttgaatgt    840

gctgatgaca gggcggacct tgccaagtat atctgtgaaa atcaggattc gatctccagt    900

aaactgaagg aatgctgtga aaaacctctg ttggaaaaat cccactgcat tgccgaagtg    960

gaaaatgatg agatgcctgc tgacttgcct tcattagctg ctgattttgt tgaaagtaag    1020

gatgtttgca aaaactatgc tgaggcaaag gatgtcttcc tgggcatgtt tttgtatgaa    1080

tatgcaagaa ggcatcctga ttactctgtc gtgctgctgc tgagacttgc caagacatat    1140

gaaaccactc tagagaagtg ctgtgccgct gcagatcctc atgaatgcta tgccaaagtg    1200

ttcgatgaat ttaaacctct tgtggaagag cctcagaatt taatcaaaca aaattgtgag    1260

ctttttgagc agcttggaga gtacaaattc cagaatgcgc tattagttcg ttacaccaag    1320

aaagtacccc aagtgtcaac tccaactctt gtagaggtct caagaaacct aggaaaagtg    1380

ggcagcaaat gttgtaaaca tcctgaagca aaaagaatgc cctgtgcaga agactatcta    1440

tccgtggtcc tgaaccagtt atgtgtgttg catgagaaaa cgccagtaag tgacagagtc    1500

acaaaatgct gcacagagtc cttggtgaac aggcgaccat gcttttcagc tctggaagtc    1560

gatgaaacat acgttcccaa agagtttaat gctgaaacat tcaccttcca tgcagatata    1620

tgcacacttt ctgagaagga gagacaaatc aagaaacaaa ctgcacttgt tgagcttgtg    1680

aaacacaagc ccaaggcaac aaaagagcaa ctgaaagctg ttatggatga tttcgcagct    1740

tttgtagaga agtgctgcaa ggctgacgat aaggagacct gctttgccga ggagggtaaa    1800

aaacttgttg ctgcaagtca agctgcctta ggccttggtg gtggtggatc cgcacctact    1860

tcaagttcta caaagaaaac acagctacaa ctggagcatt tactgctgga tttacagatg    1920

attttgaatg gaattaataa ttacaagaat cccaaactca ccaggatgct cacatttaag    1980

ttttacatgc ccaagaaggc cacagaactg aaacatcttc agtgtctaga agaagaactc    2040

aaacctctgg aggaagtgct aaatttagct caaagcaaaa actttcactt aagacccagg    2100

gacttaatca gcaatatcaa cgtaatagtt ctggaactaa agggacctga aacaacattc    2160

atgtgtgaat atgctgatga gacagcaacc attgtagaat ttctgaacag atggattacc    2220

ttttgtcaaa gcatcatctc aacactgact taa                               2253

<210>4

<211>723

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly

 1               5                   10                  15

Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr

                 20                  25                  30

Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu

                 35                  40                  45

Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu

                 50                  55                  60

Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys

                 65                  70                  75

Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu MET Ala Asp Cys

                80                  85                   90

Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His

                95                  100                 105

Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

                110                 115                 120

Asp Val MET Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu

                125                 130                 135

Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr

                140                 145                 150

Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe

                155                 160                 165

Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro

                170                 175                 180

Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys

                185                 190                 195

Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala

                200                 205                 210

Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys

                215                 220                 225

Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

                230                 235                 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp

                245                 250                 255

Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser

                260                 265                 270

Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu

                275                 280                 285

Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu MET Pro Ala

                290                 295                 300

Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val

                305                 310                 315

Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe

                320                 320                 330

Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu

                335                 340                 345

Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

                350                 355                 360

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp

                365                 370                 375

Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln

                380                 385                 390

Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn

                395                 400                 405

Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr

                410                 415                 420

Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser

                425                 430                 435

Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu

                440                 445                 450

Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu

                455                 460                 465

Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

                470                 475                 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

                485                 490                 495

Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His

                500                 505                 510

Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys

                515                 520                 525

Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr

                530                 535                 540

Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val

                545                 550                 555

Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu

                560                 565                 570

Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

                575                 580                 585

Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr

                590                 595                 600

Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu

                605                 610                 615

Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu

                620                 625                 630

Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His

                635                 640                 645

Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

                650                 655                 660

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

                665                 670                 675

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu

                680                 685                 690

Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val

                695                 700                 705

Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser

                710                 715                 720

Thr Leu Thr

        723