一种磷细菌及利用该细菌生产微生物肥料菌种剂的方法

摘要

本发明所述的技术方案属于生物肥料领域中的微生物肥料领域。最近几年，微生物肥料，据国家统检，抽查合格率不到60％，产品质量问题主要是有效菌数不达标，保质期过短。菌种在制备为微生物菌种剂后，在保藏过程中的存活能力下降、存活时间变短。在生产使用过程中表现为菌种活性下降，生产性能减弱，繁殖速度变慢，抗逆性差。菌种问题一直困扰微生物肥料的发展。本发明提供的新磷菌种和利用新技术方案生产的微生物菌种剂可以非常好的解决菌种数达标和保质期延长的问题，这使得本发明显得十分重要和有意义。

说明书

技术领域

本发明所述的技术方案属于农业肥料领域，具体的讲，是属于生物肥料领域中的微生物肥料领域，依据国际专利分类法，属于C05F 11/08领域。

背景技术

我国人口多、耕地少，且随着人口增长、工业和城市的发展耕地逐年递减。据有关部门统计，我国人口平均每年增加1600万，而耕地每年减少400万亩。1950年人口5.5亿，耕地16.5亿亩，人均耕地2.99亩，1980年人均耕地1.51亩，1990年人均耕地降到1.1亩，大大低于世界人均耕地4.03亩的水平，也低于亚洲人均耕地2.1亩的水平。为此，我国增加农产品产量的唯一可行途径是提高单位面积产量。才能满足工业发展和人口增加对农产品的需求，化肥也就顺理成章的得到了广泛应用。

长期以来不合理使用化学肥料带来的土壤板结、地力下降、生态破坏、环境污染以及农副产品品质下降问题，已经受到国家有关部门和农业科技界的高度重视。化肥的大量施用，造成了土壤肥力下降，土壤板结和农业生产成本不断提高的弊病。近几十年来，我国一直努力探索合理施肥、克服化肥的弊端及提高化肥利用率的有效途径。

农业肥料包括化学肥料和生物肥料，是我国农业生产不可替代的重要生产资料。其中，生物肥料作为农业生物工程学科的重要分支和土壤肥料学的重要组成部分，近十年无论在基础研究和应用研究方面都得到了迅速发展。而农业肥料中的微生物肥料(属于生物肥料的一种)作为一种重要的农业技术措施在发展高产、优质、高效农业中的作用越来越被人们所认识，这给它的开发、推广、应用提供了相当大的发展空间，特别是在发展有机农业、生产A级、AA级绿色食品中的不可替代性，充分体现了它潜在的魅力。

近几年来我国微生物肥料发展很快，有多家企业从事生产经营，品种不断增加，同时也有一些国外产品打入国内市场。由于菌种等原因，目前市场的产品质量参差不齐，生产应用上出现了一些问题。据最近几年农业部监督抽查、跟踪抽查，国家统检的情况看，抽查合格率不到60％，产品质量问题主要是有效菌数不达标，保质期过短。微生物肥料中有效活菌数是产品质量的重要指标，有效活菌数不达标，产品质量就得不到保证，反映出来的是应用效果不稳定，其中原因主要是菌种问题，菌种在制备为微生物菌种剂后，在保藏过程中的存活能力下降，存活时间变短。在生产使用过程中表现为菌种活性下降，生产性能减弱，繁殖速度变慢，抗逆性差。因此，菌种问题一直困扰我国微生物肥料的生产和发展。在这样的情况下，本发明提供的菌种和利用该菌种生产的微生物菌种剂可以非常好的解决菌数达标和保质期延长的问题，这使得本发明显得十分重要和有意义。

发明内容

微生物肥料是以微生物生命活动的作用导致得到特定肥料效应的一种制品，是农业生产中所使用肥料的一种，与传统化肥和有机肥在要领和内涵上有所不同。微生物肥料生产成本低，使用方便，应用效果好，不污染环境，施用后不仅增产，而且能提高农产品质量和减少传统化肥用量。微生物肥料是生产绿色食品的肥料，是保护绿色环境的肥料，是很有发展前途的肥料。目前该项目在我国正处于新的发展阶段。

要解决的技术问题

在国家有关部门充分重视使用化学肥料带来的土壤板结、地力下降、生态破坏、环境污染以及农副产品品质下降问题后，生物肥料中的微生物肥料得到了迅猛的发展，但是，由于菌种等原因，目前市场的产品质量参差不齐，在生产应用上出现了一些问题。据最近几年农业部监督抽查、跟踪抽查，国家统检的情况看，抽查合格率不到60％，产品质量问题主要是有效菌数不达标，保质期过短。微生物肥料中有效活菌数是产品质量的重要指标，有效活菌数不达标，产品质量就得不到保证，反映出来的是应用效果不稳定、保质期短，其中原因主要是菌种问题，菌种在制备为微生物菌种剂后，在保藏过程中的存活能力下降，存活时间变短。这个问题实际上是由于这些微生物菌种剂所使用的菌种要么不能产生芽孢，要么产生芽孢的能力比较弱，或者产生的芽孢萌发能力差，不能很好度过微生物菌种剂生产过程中的胁迫条件和库存、保藏过程，从而在生产使用过程中表现为菌种活性下降，生产性能减弱，繁殖速度变慢等等。菌种问题一直困扰我国微生物肥料的生产和发展。在这样的情况下，本发明提供的新菌种和利用新技术方案生产的微生物菌种剂可以非常好的解决菌数达标和保质期延长的问题，这使得本发明显得十分重要和有意义。

技术方案

首先，需要明确的是本发明中提到的百分比和比例均是指重量百分比和重量比例。

本发明提供了一种解决上述问题的技术方案，具体的，本发明提供了一种微生物(蜡状芽孢杆菌，Bacillus cereus)，具体的，菌种被命名为“新磷1号”(已于2004年4月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC1132)，该微生物从高产农田中分离，并经驯化，长期以来性状稳定。

该菌种的生物学特性为菌体杆状，大小0.6-0.8*2-3微米，革兰氏阳性，细胞原生质染色均匀，鞭毛侧生，芽孢中生或偏中生，形状柱形或椭圆形，不使菌体膨大，在牛肉蛋白胨培养基上菌落为乳白色，圆形，边缘不规则毛状突出，直径1-2毫米。能利用多种氮源、碳源，生长温度20-55℃最佳生长温度37℃最适PH7.1。在不良条件下，菌体转化为芽孢，芽孢对不良环境抗逆性强，可耐受100℃高温和干燥等恶劣条件。

申请人认为，因为菌种是新的，所以该菌种使用传统的微生物菌种剂生产方法生产微生物菌种剂的技术方案具有新颖性，如果生产出的微生物菌种剂能够克服上述的缺点(有效菌数不达标，保质期过短)，具有突出的特点和显著的进步，就具有了创造性和实用性，具有了被授予专利权的基本条件。

传统的微生物菌种剂生产中用到的培养基和培养方法在《磷细菌》(陈延伟等编，农业出版社，1959年，北京)一书中有详细的描述。

同时，申请人在本发明中，对新磷1号的发酵条件进行摸索，得出了1个非常适用于该菌种的培养基和发酵条件(该培养基和发酵条件也适用于其他部分菌种)。申请人认为，因为菌种是新的，本发明提供的培养基和发酵条件也是新的，所以该菌种使用本发明提供的新的微生物发酵条件生产微生物菌种剂的技术方案具有新颖性，如果生产出的微生物菌种剂能够克服上述的缺点(有效菌数不达标，保质期过短)，具有突出的特点和显著的进步，就具有了创造性和实用性，具有了被授予专利权的基本条件。

该新的培养方案所使用到的培养基有：

新磷1号培养基(斜面培养基)：蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，牛肉膏5g/L，琼脂1.5％-2.0％，PH调至6.5-7.8。

新磷1号液体培养基：该培养基不含琼脂，其他成分和含量与新1培养基相同，PH调至6.5-7.8。

新磷2号培养基：淀粉5g/L，蔗糖1g/L，酵母浸出汁0.2g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，硫酸氨1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钠5g/L，PH调至6.5-7.8。

新磷3号培养基：淀粉10g/L，蔗糖5g/L，酵母浸出汁0.1g/L，蛋白胨0.5g/L，豆饼粉10g/L，硫酸氨1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钠5g/L，PH调至6.5-7.8。

新磷4号培养基：淀粉10g/L，蔗糖2.5g/L，酵母浸出汁0.1g/L，蛋白胨0.5g/L，豆饼粉5g/L，硫酸氨1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钠5g/L，PH调至6.5-7.8。

以上所有培养基均在使用前经高压蒸汽灭菌(121℃，1.1kg/cm³，30分钟)，冷却。

微生物菌种剂的具体生产方式：

一、菌种保藏及活化培养

菌种以划线培养的方式在新磷1号培养基(斜面培养基)上保藏，短期保藏条件为4℃，每2月活化1次；长期保藏条件为-20℃，每6个月活化1次。

二、微生物培养

1、微生物培养(传统微生物发酵生产方法)

培养基：淀粉3％，豆饼粉1％，蛋白胨0.1％，硫酸铵0.2％，磷酸氢二钾0.2％，酵母粉0.1％，碳酸钙0.01％，PH7.2-7.4。

将菌种活化后接入1000ml上述培养基中，三角瓶摇瓶160RPM 30-38℃培养16小时，然后按1％接种量接种到200L种子发酵罐中(仍为同种培养基)，通气，30-38℃培养16小时，再按10％接种量接到2000L发酵罐中(仍为同种培养基)，30-38℃培养20小时后升温至40-45℃在培养10小时，待80％菌体产生芽孢后停止发酵。

2、微生物培养(本发明提供的方法)：

1)自保存斜面取种后，划线接入斜面培养基(新磷1号培养基)，30-38℃培养箱静置黑暗条件下培养36小时；

2)用无菌水冲洗斜面，形成菌悬液；

3)将1体积菌悬液接入约20体积的新磷1号液体培养基中，30-38℃有氧培养至菌体浓度为108个/ml数量级；

4)将步骤3)得到的菌悬液加入到约5-10倍体积的新磷2号培养基中，30-38℃有氧培养至菌体浓度为10⁸个/ml数量级；

5)将步骤4)得到的菌悬液加入到约100-200倍体积的新磷3号培养基中，35-38℃有氧培养至菌体浓度为10⁸个/ml数量级；

6)将步骤5)得到的菌悬液加入到约20-40倍体积的新磷4号培养基中，35-38℃培养有氧培养至菌体浓度为10⁹个/ml数量级。

三、微生物菌种剂的生产

将优质草炭粉(市售)进行干热灭菌后冷却，根据想要得到微生物菌种剂中微生物的含量加入到发酵结束(传统微生物发酵生产方法的或本发明提供的生产方法的)得到的发酵液中，进行充分搅拌，用造粒机造粒，低温烘干，包装入库成为微生物菌种剂产品，使用时根据需要与普通化肥或有机载体混合即可成为微生物肥料。

有益的效果

使用本发明所提供的菌种生产的微生物菌种剂有较高的有效菌数和较长的保质期。

在本菌种使用传统发酵方式进行发酵生产的菌种剂，入库时进行有效菌数检测，其结果明显优于市售其他微生物菌种剂中的有效菌数，有效菌数是国家标准的3.2倍。解决了菌种数不达标的问题。

在本菌种使用本发明提供的发酵方式进行发酵生产的菌种剂入库时进行有效菌数检测，其结果明显优于市售其他微生物菌种剂中的有效菌数，有效菌数是国家标准的3.7倍。也解决了菌种数不达标的问题。

本菌种使用传统发酵方式进行发酵生产的菌种剂在仓库中保存2年后，进行有效菌数检测，其结果明显优于市售其他微生物菌种剂中的有效菌数，有效菌数是国家标准的2.95倍。解决了保质期短的问题。

本菌种使用本发明提供的发酵方式进行发酵生产的菌种剂在仓库中保存2年后，进行有效菌数检测，其结果明显优于市售其他微生物菌种剂中的有效菌数，有效菌数是国家标准的3.4倍。解决了保质期短的问题。

具体实施方式

实施例1：利用传统方法对新磷1号进行发酵制备微生物菌种剂

培养基：淀粉3％，豆饼粉1％，蛋白胨0.1％，硫酸铵0.2％，磷酸氢二钾0.2％，酵母粉0.1％，碳酸钙0.01％，PH7.2-7.4。

将菌种活化后接入1000ml上述培养基中，三角瓶摇瓶160RPM 37℃培养16小时，然后按1％接种量接种到200L种子发酵罐中(仍为同种培养基)，通气，37℃培养16小时，再按10％接种量接到2000L发酵罐中(仍为同种培养基)，37℃培养20小时后升温至42℃在培养10小时，待80％菌体产生芽孢后停止发酵。检测菌体浓度，达到10⁹，然后按1∶4的重量百分比与进行干热灭菌后冷却的优质草炭粉(市售)混合，再进行造粒，低温烘干成为微生物菌种剂。

实施例2：利用本发明提供的方法对新磷1号进行发酵制备微生物菌种剂

先对菌种进行活化，再用5ml无菌水冲洗斜面，形成菌悬液，菌悬液接入500ml三角瓶，该三角瓶含100ml新磷1号液体培养基，使用摇床培养18小时，培养条件为37℃，180-200rpm，检测菌体浓度，在浓度达到10⁸数量级，进行下一步；

将500ml三角瓶中的100ml菌液转接入2000ml三角瓶中，该三角瓶含700ml新磷2号培养基，使用摇床培养20小时，培养条件为37℃，180-200rpm；检测菌体浓度，在浓度达到10⁸数量级，进行下一步；

将2000ml三角瓶中取出菌液接入1m3发酵罐中，接入量为3.5升，该发酵罐中含有500L新磷3号培养基，发酵条件为：温度36-38℃，罐压0.5kg/cm，通气量20m³/h，培养8小时；检测菌体浓度，在浓度达到10⁸数量级，进行下一步；

将1m³发酵罐中的菌液取出接入5m³发酵罐，接入量为130升，该发酵罐含有3m³新4培养基，发酵条件为：温度36-38℃，罐压0.5kg/cm，通气量120m³/h，培养15小时。检测菌体浓度，在浓度达到10⁹数量级，停止发酵。然后按1∶4的比例与进行干热灭菌后冷却的优质草炭粉(市售)混合，再进行造粒，低温烘干成为微生物菌种剂。

实施例3：对利用传统方法制备的微生物菌种剂在未长时间库存的条件下进行菌数检测

按照常规的稀释平板记数法检测微生物菌种剂中的活菌含量。称取微生物菌种剂1克(库存半个月)，用无菌水溶解，用无菌水稀释至菌体数为20-100个/ml，然后移取1ml稀释液到无菌培养皿中，加入适量新磷1号培养基(斜面培养基)，充分混合后凝固，在37℃保温箱中倒置培养48小时，统计平板上的菌落，重复三次以上，以平均值乘以该一克微生物菌种剂稀释为菌体浓度为20-100个/ml时的毫升数即为每克微生物菌种剂的菌种数。我们对利用传统方法制备的微生物菌种剂在未长时间库存的条件下进行菌数检测，检测结果为6.4*10⁸个/克，为国家标准的3.2倍(国家标准为2.0*10⁸个/克)。解决了菌种剂微生物数目不达标的问题。

实施例4：对利用本发明提供的方法制备的微生物菌种剂在未长时间库存的条件下进行菌数检测

按照常规的稀释平板记数法检测微生物菌种剂中的活菌含量。称取微生物菌种剂1克(库存半个月)，用无菌水溶解，用无菌水稀释至菌体数为20-100个/ml，然后移取1ml稀释液到无菌培养皿中，加入适量新磷1号培养基(斜面培养基)，充分混合后凝固，在37℃保温箱中倒置培养48小时，统计平板上的菌落，重复三次以上，以平均值乘以该一克微生物菌种剂稀释为菌体浓度为20-100个/ml时的毫升数即为每克微生物菌种剂的菌种数。我们对利用本发明提供的方法制备的微生物菌种剂在未长时间库存的条件下进行菌数检测，检测结果为7.4*10⁸个/克个/克，为国家标准的3.7倍。解决了菌种剂微生物数目不达标的问题。

实施例5：对利用传统方法制备的微生物菌种剂在长时间库存的条件下进行菌数检测

按照常规的稀释平板记数法检测微生物菌种剂中的活菌含量。称取微生物菌种剂1克(库存两年)，用无菌水溶解，用无菌水稀释至菌体数为20-100个/ml，然后移取1ml稀释液到无菌培养皿中，加入适量新磷1号培养基(斜面培养基)，充分混合后凝固，在37℃保温箱中倒置培养48小时，统计平板上的菌落，重复三次以上，以平均值乘以该一克微生物菌种剂稀释为菌体浓度为20-100个/ml时的毫升数即为每克微生物菌种剂的菌种数。我们对利用传统方法制备的微生物菌种剂在长时间库存(两年)的条件下进行菌数检测，检测结果为5.9*10⁸个/克，为国家标准的2.95倍。解决了菌种剂微生物数目不达标的问题和保藏期太短的问题。

实施例6：对利用本发明提供的方法制备的微生物菌种剂在长时间库存的条件下进行菌数检测

按照常规的稀释平板记数法检测微生物菌种剂中的活菌含量。称取微生物菌种剂1克(库存两年)，用无菌水溶解，用无菌水稀释至菌体数为20-100个/ml，然后移取1ml稀释液到无菌培养皿中，加入适量新磷1号培养基(斜面培养基)，充分混合后凝固，在37℃保温箱中倒置培养48小时，统计平板上的菌落，重复三次以上，以平均值乘以该一克微生物菌种剂稀释为菌体浓度为20-100个/ml时的毫升数即为每克微生物菌种剂的菌种数。我们对利用本发明提供的方法制备的微生物菌种剂在长时问库存(两年)的条件下进行菌数检测，检测结果为6.8*10⁸个/克，为国家标准的3.4倍。解决了菌种剂微生物数目不达标的问题和保藏期太短的问题。

实施例7：未长期库存的微生物菌种剂与肥料混合后使用的效果

将鸡粪、粉碎玉米芯、煤渣以1∶2∶3重量百分比混合均匀，调整含水量为30％，在温度大于30℃的条件下堆积7-10天，把库存半个月的微生物菌种剂与之以1∶9的重量百分比混合，制成微生物肥料。

将制成的微生物肥料在不同作物上进行与基质肥以及等价常规肥比较的小区肥效实验，小区面积0.16亩，实验设3个重复。实验时每亩施微生物肥料25公斤；基质肥(经由鸡粪、粉碎玉米芯、煤渣以1∶2∶3重量百分比混合均匀，调整含水量为30％后，在温度大于30℃的条件下堆积7-10天制成)每亩施25公斤；等价常规肥(磷酸二氨∶尿素∶氯化钾为3∶3∶2混合)每亩施25公斤。均作为基肥，一次施完，不追加。空白对照不施肥。

实验结果如下(数据均为各肥料相对于空白对照的增产百分比)

生菜丝瓜玉米水稻花生黄瓜微生物肥料14 25 15 14 17 30基质肥1 19 10 9 10 25等价常规肥3 18 8 5 11 17

结果表明，该微生物菌种剂能够很好发挥作用，具有良好的增产效果。

实施例8：长期库存(两年)的微生物菌种剂与肥料混合后使用的效果

将鸡粪、粉碎玉米芯、煤渣以1∶2∶3重量百分比混合均匀，调整含水量为30％，在温度大于30℃的条件下堆积7-10天，把库存两年的微生物菌种剂与之以1∶9的重量百分比混合，制成微生物肥料。

将制成的微生物肥料在不同作物上进行与基质肥以及等价常规肥比较的小区肥效实验，小区面积0.16亩，实验设3个重复。实验时每亩施微生物肥料25公斤；基质肥(经由鸡粪、粉碎玉米芯、煤渣以1∶2∶3重量百分比混合均匀，调整含水量为30％后，在温度大于30℃的条件下堆积7-10天制成)每亩施25公斤；等价常规施肥(磷酸二氨∶尿素∶氯化磷为3∶3∶2混合)每亩施25公斤。均作为基肥，一次施完，不追加。空白对照不施肥。

实验结果如下(数据均为各肥料相对于空白对照的增产百分比)

生菜丝瓜玉米水稻花生黄瓜微生物肥料13 24 13 13 16 30基质肥1 19 10 9 10 25等价常规肥3 18 8 5 11 17

结果表明，该微生物菌种剂能够很好的解决保质期问题，由它制备的肥料相对于未长期保存的微生物菌种剂制备的肥料在使用效果上没有显著差别，解决了本发明想要解决的问题。