脐血间充质干细胞支持造血干/祖细胞体外扩增方法

摘要

本发明提供一种脐血间充质干细胞支持造血干/祖细胞体外扩增方法，是从脐血中培养出脐血间充质干细胞，并作为培养体系中的支持细胞，在结合外源生长因子的培养体系中体外扩增造血干/祖细胞，达到进一步提高造血干/祖细胞体外扩增效率的目的。采用脐血间充质干细胞共培养的方法有效地提高造血干/祖细胞体外扩增倍数，并保持了其扩增后的质量，扩增出的细胞具有更多的GEMM－CFC形成潜能。本发明的扩增方法具有明显的扩增优势。

说明书

所属技术领域

本发明属生物技术方法，主要涉及一种造血干/祖细胞在体外扩增培养的新生物技术方法，尤其是能有效地提高造血干/祖细胞体外扩增倍数和保持其质量的方法。

背景技术

已有的造血干/祖细胞体外扩增技术方法大致可归为两类：第一类方法是在培养体系中外加不同组合的重组细胞生长因子，目的是利用细胞生长因子对造血干/祖细胞增殖和分化进行适当的调控。第二类是近几年来发展起来的方法，即用骨髓基质细胞来模拟体内造血干/祖细胞生长和分化的环境，以促进其快速扩增和功能的激活。

目前上述两类技术方法中，第一类技术方法能在一定程度上提高造血干/组细胞的扩增倍数。但如果组合中的细胞因子种类太少，就难以达到理想的扩增效果，而太多的话则会因为费用昂贵而难以在临床移植中应用。同时，不管如何组合重组细胞因子，也难以模拟体内支持造血干/祖细胞生长和分化的环境，在一定程度上限制了造血干/祖细胞的体外扩增效率。第二类技术方法可以模拟体内造血干/祖细胞生长和分化环境，但是骨髓来源相对比较困难，并且骨髓间充质干细胞难以建系，所以难以满足培养造血干/祖细胞大批量扩增培养所需的支持细胞需求。

脐血来源丰富，采集简便，可以满足大批量支持细胞的需求。同时，脐血间充质干细胞和造血干/祖细胞可以来自于同一份样品，因此前者作为培养后者的支持细胞，具有最佳的相容性。目前未见有用脐血间充质干细胞建立滋养层支持造血干/祖细胞体外扩增技术的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种脐血间充质干细胞支持造血干/祖细胞体外扩增方法，可开辟造血干/祖细胞体外扩增中新的支持细胞来源，为造血干/祖细胞扩增和分化提供新的微环境，提高其体外扩增效率。

本发明的目的通过以下方案实现：从脐血中培养出脐血间充质干细胞，并作为培养体系中的支持细胞，在结合外源生长因子的培养体系中体外扩增造血干/祖细胞，达到进一步提高造血干/祖细胞体外扩增效率的目的。

本发明方法所述的脐血中培养出的脐血间充质干细胞，在培养体系中形成滋养层，体外支持造血干/祖细胞扩增。

本发明方法所述的外源生长因子主要包含：SCF、G-CSF和MGDF(每种细胞因子浓度为100ng/mL)。

本发明方法所述的从脐血中分离造血干/祖细胞，种植到上述含有脐血间充质干细胞层的培养体系中，在5％CO₂和37℃下培养14天。

本发明方法所述的从脐血中分离造血干/祖细胞，包含单个核细胞或纯化CD34⁺细胞。

本发明的有益效果是：

采用脐血间充质干细胞共培养的技术有效地提高造血干/祖细胞体外扩增倍数，并保持了其扩增后的质量。在单个核细胞扩增培养中，用脐血间充质干细胞滋养层结合外源细胞因子的扩增体系比仅用外源细胞因子的扩增体系提高了2.09倍，CD34⁺扩增培养中，用脐血间充质干细胞滋养层结合外源细胞因子的扩增体系比仅用外源细胞因子的扩增体系提高了2.94倍，用脐血间充质干细胞滋养层结合外源细胞因子的扩增体系扩增出的细胞比仅用外源细胞因子的扩增体系扩增出的细胞具有更多的GEMM-CFC形成潜能。新扩增技术具有明显的扩增优势。

附图说明

图1为人脐血间充质干细胞的形态和碱性磷酸酶染色。

图2为流式细胞仪检测脐血间充质干细胞表面标记物的结果。

图3两种培养体系下脐带血造血干/祖细胞的扩增动态。

图4两种培养体系中GEMM-CFC的扩增。

具体实施方式

实施例一  本发明方法的一种具体步骤

用IMDM培养液培养脐血间充质干细胞约7天，直至脐血间充质干细胞在培养瓶中铺层。然后在培养体系中加入三种细胞生长因子：SCF、G-CSF和MGDF(每种细胞因子浓度为100ng/mL)，建立新的造血干/祖细胞体外扩增培养体系。从脐血中分离造血干/祖细胞(单个核细胞或纯化CD34⁺细胞)，种植到上述含有脐血间充质干细胞层的新培养体系中，在5％CO₂和37℃下培养14天。

实施例二  脐血间充质干细胞形态学及其免疫组化特性：

从脐血分离到的间充质干细胞培养14天以后，可观测到一些纤维状似的细胞，随后它们形成克隆，并逐渐扩张。在30天后，一种纤维状细胞占据了整个培养瓶的表面(参见图1a)。

其中图1a为培养30天的脐血间充质干细胞，图1b为脐血间充质干细胞的碱性磷酸酶染色(×100)。

用流式细胞仪分别检测了脐血间充质干细胞的CD13、CD14、CD29、CD166四种抗原，发现CD14(单核细胞的标志性抗原)呈阴性，而CD13(髓系细胞、单核细胞表达的抗原)、CD166(内皮细胞、骨髓细胞、单核细胞表达的抗原)以及CD29(骨髓成纤维细胞的标志性抗原)呈阳性。贴壁细胞中每种抗原的表达率分别是：CD13为51.8％、CD166为35.6％、CD29为16.5％、CD14为3.8％。检测的数据用Veresion3.1软件分析的结果(参见图2)。用成纤维细胞的标志碱性磷酸酶染色，发现培养的细胞(参见图1b)都呈阳性，即胞浆呈灰色，内有很多黑色颗粒，甚至有的细胞黑色颗粒连成片。

实施例三  脐血造血干/祖细胞的体外扩增效果：

1.有核细胞的扩增：

从脐血分离单个核细胞，并进一步分选出CD34⁺细胞，然后按本扩增技术体系进行体外扩增。分别在第7、9和14天对单个核细胞和CD34⁺细胞扩增的细胞进行取样，并计细胞总数，由此计算扩增倍数。结果参见图1。

参见图3的扩增结果，其中(a)单个核细胞培养的有核细胞的扩增，(b)CD34+细胞培养的有核细胞扩增。在脐血间充质干细胞滋养层并结合外源细胞因子的共扩增培养体系中，有核细胞扩增的速度明显大于非共扩增培养体系(P＜0.01)：单个核细胞扩增培养中，共扩增培养体系比非共扩增培养体系提高了2.1倍；CD34⁺扩增培养体系中，共扩增培养体系比非共扩增培养体系提高了3.0倍(见表1)。通过对比可以看出，脐血间充质干细胞滋养层对CD34⁺细胞扩增的支持作用要大于对单个核细胞扩增的支持作用，同时也说明CD34⁺细胞具有非常高的扩增潜力。

表1  两种培养体系下脐血造血干/祖细胞的扩增(x±s)

               起始细胞×10    扩增细胞×10⁴   提高倍数

        A组    62.5±0.5       602.5±8.4       2.09±0.2

单个核         62.5±0.5       1257.5±13.

细胞    B组

                            0

CD34⁺  A组    7.4±0.7        98.8±7.0        2.94±0.1

细胞    B组    7.4±0.7        290.5±25.3

2.造血干/祖细胞总集落扩增分析：

用脐血间充质干细胞做滋养层并结合外源细胞因子的共扩增培养体系中，单个核细胞培养和CD34⁺细胞培养的GEMM-CFC扩增效率都比仅用外源细胞因子的非共扩增培养体系要高(P＜0.05)(见图4)。

单个核细胞和CD34⁺细胞培养中的起始GEMM-CFC分别是57±4.7×10⁴和23±2.1×10⁴。经过14d的扩增后，用脐血间充质干细胞做滋养层并结合外源细胞因子的共扩增培养体系(B组)中，单个核细胞扩增后的GEMM-CFC是2086±295.3×10⁴(扩增36.6±4.2倍)  CD34⁺细胞扩增后的GEMM-CFC是1807±155.9×10⁴(扩增78.8±3.3倍)。在仅用细胞因子的非共扩增培养体系(A组)中，单个核细胞扩增后的GEMM-CFC是1046±141.6×10⁴(扩增15.2±2.3倍)；CD34⁺细胞扩增后的GEMM-CFC是508±33.6×10⁴(扩增22.2±1.1倍)。所以，共扩增培养体系与非共扩增培养体系比较，在单个核细胞扩增后的GEMM-CFC相对提高扩增效率2.0±0.1倍；CD34⁺细胞扩增后的GEMM-CFC相对提高扩增效率3.5±0.1倍。

本发明涉及的部分参考文献：

1、韩军 徐激斌等，胎儿骨髓基质细胞与外源性细胞因子的协同造血支持作用，第二军医大学学报，2001，22(5)：439-442

2、张毅 毛宁等，脐带血中长期培养启动细胞在转染FL和/或TPO基因骨髓基质细胞层上的生长，中国实验血液学杂志，2001，9(2)：97-100

3、杨吉成 王晓东等，骨髓基质细胞的造血支持作用等生物学特性的研究，细胞与分子免疫学杂志，2001，17(1)：41-45

4、苏瑞军 黄绍良，含人胚胎骨髓基质细胞层体系对脐血造血干/祖细胞的扩增效果，中华儿科杂志，1999，37(7)：429-433

5、吴瑞琼 杨治华，骨髓基质细胞对人造血CD^+34细胞体外扩增及基因转导的作用，中国输血杂志，1999，12(2)：73-75

6、侯丽君 远藤一靖，人骨髓基质细胞株培养上清对造血干细胞增殖作用的研究，中国医科大学学报，1995，24(5)：477-479

7、梁辉 应大明，长期培养起始细胞在不同的基质细胞层上的培养，中华血液学杂志，1995，16(5)：241-243

8、赵柯，沈柏钧，侯怀水等，条件培养液对脐血CD34+细胞扩增效应的实验研究，河北医科大学学报，2002，23(1)：7-10.

9、徐黎，裴雪涛，王立生，吴祖泽，利用IL-3/GM-CSF融合蛋白(PIXY-321)扩增脐血造血细胞方法，中国应用生理学杂志，1996，12(3)：233-235

10、孙海英，徐开林，嵇月红等，FL与SCF、IL-3、GM-CSF及EPO协同调控脐血造血干/祖细胞的体外扩增，现代诊断与治疗，2001，12(6)：345-347.

11、韩军，王健民，居小平，徐激斌，周虹，闵碧荷，胎儿骨髓基质细胞与外源性细胞因子的协同造血支持作用，第二军医大学学报，2001，22(5)：439-442

12、杨吉成，盛伟华，李丽娥，童宁征，王红卫，郭春，王晓东，骨髓基质细胞的造血支持作用等生物学特性的研究，细胞与分子免疫学杂志，2001，17(1)：41-45

13、姜蓉，郑敏，王亚平，吴宏，王莎莉，戴勤，几种组织培养上清液对造血祖细胞体外增殖分化的比较，重庆医科大学学报，2001，26(1)：29-31

14、郭子宽，唐佩弦，刘晓丹，杨靖清，李秀森，陈小三，毛宁，人骨髓间充质干细胞支持体外造血，中国实验血液学杂志，2000，8(2)：93-96

15、王红卫，缪竞诚，张澜生，杨吉成，盛伟华，李丽娥，IL-3体外造血支持效应的初步研究，中国免疫学杂志，2000，16(6)：291-292

16、胡延红，唐军民，唐岩标，骨髓基质细胞层对红系造血祖细胞扩增的影响，解剖科学进展，1999，5(4)：372

17、苏瑞军，黄绍良，周敦华，李树浓，梁晓燕，含人胚胎骨髓基质细胞层体系对脐血造血干/祖细胞的扩增效果，中华儿科杂志，1999，37(7)：429-433

18、吴瑞琼，杨治华，石远凯，董志伟，骨髓基质细胞对人造血CD+34细胞体外扩增及基因转导的作用，中国输血杂志，1999，12(2)：73-75

19、秦凤华，张忠森，谢蜀生，骨髓基质细胞系QXMSC1体外促进造血及其作用机理的研究，实验血液学杂志，1997，5(4)：367-371

20、孙新，黄绍良，刘俊范，胎儿骨髓基质细胞培养上清对造血祖细胞集落生长的影响，实验血液学杂志，1997，5(2)：212-213

21、侯丽君，仇琳，远藤一靖，金田京子，古山和道，人骨髓基质细胞株培养上清对造血干细胞增殖作用的研究，中国医科大学学报，1995，24(5)：477-479

22、侯丽君，人骨髓基质细胞株培养上清对造血干细胞增殖作用的研究，沈阳医学杂志，1994，14(3)：3-4

23、吴萌，孙正义，王翠芳，张钦，人脐血中分离骨髓间充质干细胞成骨诱导前后的生物学特性，中国临床康复，2003，17：2414-2417

24、侯玲玲，曹华，魏国荣，白慈贤，张涌，吴祖泽，裴雪涛，人脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究，中华血液学杂志，2002，23(8)：415-419

25 Rosler E，Brandt J，Chut J，et al.Cocultivation of umbilical cord blood cells withendothelial cells leads to extensive amplification of competent CD34⁺CD38^- cells[J].Exp Hematol，2000，28：841-852.

26 Lweis LD，Graca AP，Du JB，et al Umbilical cord blood cells capable of engraftingin primary，secondary，and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivoculture in a noncontact system[J].Blood，2001，97：3441-3449.

27 Wang JF，Harrintong J，McNiece.Effects of bone marrow-derived mesenchymalstem cell layer on expansion and differentiation of hematopoietic stem cell fromcord blood[J].Journal of Zhejiang University(Science Edition)，2003，30：65-70.

28 Hauser SP，Waldron JA，Upuda KB，et al.Morphological characterizsaition ofstromal cell type in hematopoietically active long-term murine bone marrowculture[J].J Histochemi，1995，43：371-382.

29 Huang S，Terstappen LW.Formation of hematopoietic microenviroment andhematopoietic stem cells from single human bone marrow stem cells[J].Nature，1993，360：745-752.

30 Cardoso AA，Li ML，Batard P，et al.Release from quiescence of CD34⁺CD38^-human umbilical cord blood cells reveals their potentiality to engraft adults[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90：8707-8711.

31 Vilmer E，Sterkers G，Rahimy C，et al.HLA-mismatched cord-bloodtransplantation in a patient with advanced leukemia[J].Transplantation，1992，53：1155-1157.

32 Hows JM，Bradley BA，Marsh JC，et al.Growth of human umbilical-cord blood inlongterm haemopoietic cultures[J].Lancet，1992，340：73-74.

33 Strobel ES，Gay RE，Greenberg PL.Characterization of the in vitro stromalmicroenvironment of human bone marrow[J].Int.J.Cell Cloningt，1986，4：341-356.

34 Ye ZQ，Burkholder JK，Qiu P，et al.Establishment of an adherent cell feeder layerfrom human umbilical cord blood for support of long-term hematopoieticprogenitor cell growth[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91：12140-12144.

35 Gutierrez-Rodriguez M，Reyes-Maldonado E，Mayani H.Characterization of theadherent cells developed in Dexter-type long-term cultures from human umbilicalcord blood[J].Stem Cells，2000，18：46-52.