四链体DNA和双链体探针系统

摘要

如核酸四链体的多链体结构包括：含有核碱基第一序列的第一链；含有核碱基第二序列的第二链，其中第二链与第一链通过沃森—克里克键合相连；含有核碱基第三序列的第三链；以及含有核碱基第四序列的第四链，其中第四链与第二链和第三链通过沃森—克里克键合相连。多链体结构的形成受到单价阳离子(例如钠和钾)、二价阳离子、多价阳离子、嵌入剂和/或已知在核酸小沟内结合的分子的促进。多链体结构及其形成方法具有诊断、治疗、预防和纳米工程的用途。

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及核酸多链体，更具体地说，涉及双链核酸探针和双链核酸靶序列之间特异性结合形成四链体的方法。

相关技术描述

虽然核酸双链体是多链核酸结构研究最广泛的类型，但是已经发现，这些核酸在某些条件下也形成三链体和四链体结构。

直到现在，人们仍普遍认为三条核酸链间杂交形成三链体是限制在非常有限物种的核酸(例如聚嘌呤或聚嘧啶序列)内的。参见例如Floris等，“在混合价盐溶液中阳离子对嘌呤—嘌呤—嘧啶三螺旋形成的影响”，260 Eur.J.Biochem.，801-809(1999)。另外，人们还认为三链体的形成或杂交是基于有限种类的相邻核碱基间的Hoogsteen结合，而不是沃森—克里克碱基配对。参见例如Floris等和授予Dervan等的美国专利号5,874,555。但是，本发明人最近已经公开了几个专利申请，其中基于沃森—克里克碱基配对可产生三链体核酸，并作为高度准确和灵敏的特异性结合测定的基础。参见美国专利申请号09/613,263和09/468,679，两者分别于2000年7月10日和1999年12月21日提交。

正如三链体核酸的情形，对四链体核酸的传统看法是，这样特殊的结构只是相对窄类型的核酸在相对极端的条件下存在。具体而言，Sen等(Nature 334：364-366(1988))公开了富含鸟嘌呤的寡核苷酸可以自发地在体外自组装成四链螺旋。Sen等(Biochemistry 31：65-70(1992))公开了这些四链复合物可以进一步结合成由8、12或16个寡聚物组成的超级结构。

Marsh等(Biochemistry 33：10718-10724(1994)和Nucleic AcidResearch 23：696-700(1995))公开了一些富含鸟嘌呤的寡核苷酸也可以偏置、平行的排列组装，形成长的“G-线”。这些更高级别的结构是通过G-四联体(G-quartet)稳定的，G-四联体是由四个以平面方式排列并通过Hoogsteen碱基配对结合在一起的鸟苷残基组成的。根据Sen等(Biochemistry 31：65-70(1992))，寡聚物内的至少三个邻接的鸟嘌呤对形成这些更高级别的结构是至关重要的。

有人已经提出，四链DNA在许多生物学过程中起作用，如抑制HIV-1整合酶(Mazumder等，Biochemistry 35：13762-13771(1996))、在减数分裂过程中形成联会(Sen等，Nature 334：364-366(1988))，以及维持端粒(Williamson等，Cell 59：871-880(1989))；Baran等，Nucleic AcidsResearch 25：297-303(1997))。

有人还已提出，控制富含鸟嘌呤四链体的产生可能是控制这些生物学过程的关键。例如授予Hardin等的美国专利号6,017,709暗示，端粒酶活性可以通过抑制鸟嘌呤四联体的药物来控制。

授予Pitner等的美国专利号5,888,739公开了基于G-四联体的四链体可以在检测核酸的试验中使用。在与互补寡核苷酸杂交后，G-四联体结构未折叠或线性化，从而增加了G-四联体结构的不同部分上供体和受体之间的距离，导致它们相互作用降低以及可检测从该结构中所发射信号(例如荧光)的变化。

授予Agrawal等的美国专利号5,912,332公开了纯化合成的寡核苷酸的方法，其中合成的寡核苷酸特异地与所需的全长寡核苷酸杂交，并且伴随形成了多聚体聚合物，如四链体DNA。然后，利用大小排阻层析技术分离了含有待纯化的寡核苷酸的多聚体聚合物。

尽管有前面的进展，但四链体核酸的全部潜力既没有被完全认识也没有被充分开发。

所有本文引证的参考以其全文引作参考。

发明概要

本发明提供多链体结构，其包括：含有核碱基第一序列的第一链；含有核碱基第二序列的第二链，其中第二链与第一链以沃森—克里克键合相连；含有核碱基第三序列的第三链；和含有核碱基第四序列的第四链，其中第四链与第二链和第三链通过沃森—克里克键合相连。

本发明还提供用于提供本发明的多链体结构的方法。该方法包括：提供含有第一链、第二链、第三链、第四链、水、缓冲液和至少一种促进剂的杂交介质；温育杂交介质，温育时间能有效将第二链与第四链杂交以提供多链体结构。

另外提供的是利用双链探针对单链和双链靶进行分析。

附图的简要说明

本发明将结合附图来说明，其中同样的参考标号表示同样的元件，以及其中：

图1、2、3、4和5是对各分析样品以波长为函数制作的荧光强度的复合图。

优选实施方案的详细说明

不象在上文背景部分中所讨论的四链体，本发明优选的多链体结构至少含有根据传统的沃森—克里克结合法则结合在一起的四条核酸链。

如本文所用，术语“沃森—克里克键合”意要定义在相对的核酸(和/或核酸类似物)链对之间通过匹配的相对碱基的特异结合。本文有时将沃森—克里克四链体的形成称为杂交事件，对于沃森—克里克四链体的形成如何可以最好地表征，那仅仅为了方便，并不意谓着限制本发明的范围。

本发明的多链体结构优选四链体。多链体的每条链独立地含有核酸或核酸类似物。适当的核酸包括例如DNA或RNA。优选的核酸类似物含有不带电荷或部分带电荷的主链(即带有电荷的主链，所述电荷不是如天然DNA主链那样阴性的)。

在某些实施方案中，四链体第二和第四链中的一个含有DNA，而第二和第四链中的另一个含有RNA、mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA或cDNA。

在某些实施方案中，第二链和第四链是相互反平行的。将这些实施方案定义为具有镜像互补性。在这些实施方案中，将第一和第二链的大沟放置在第三和第四链的大沟中。

在其它实施方案中，第二和第四链是相互平行的。在这些实施方案中，具有“嵌套互补性”，将第一和第二链的大沟放置在第三和第四链的小沟中。

在某些实施方案中，每个核碱基结合了不超过两个的其它核碱基。在一些其中的实施方案中，第二链的碱基特异地(通过沃森—克里克法则)结合第一链的匹配的碱基，和结合第四链的匹配的碱基，以及第四链的碱基特异地结合(通过沃森—克里克法则)第三链的匹配的碱基，和结合第二链的匹配的碱基，其中第一和第三链的碱基结合不超过一个其它的各个碱基。所以，除了传统的沃森—克里克碱基对以外，这样的实施方案包括下面的沃森—克里克碱基三联体：A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G，和/或C-G-C(包括C+G-C，和/或其它离子化的碱基物种)。

在某些实施方案中，相信第一和第三链的相对碱基也相互结合，除了下列结合以外：(a)在第一和第二链的相对碱基之间的结合；(b)在第三和第四链的相对碱基之间的结合；和(c)在第二和第四链的相对碱基之间的结合。

在本发明的多链体结构的某些实施方案中，没有链是与另一条链邻接的。也就是说，至少存在四条独立的链。虽然折叠的构型等(例如发夹转角等)是在本发明的范围内的，但是单链的折叠部分不使链计数一次以上，接近四个单独的链的最小值。

本发明的多链体优选地不依赖于Hoogsteen键合或G-G四联体来维持多链体结构，尽管可能存在不显著量的Hoogsteen键合和/或G-G四联体。即，本发明的多链体结构优选地基本上无Hoogsteen键合，并且基本上无G-G四联体。

在某些实施方案中，多链体的第一和第二链长度为5-50个碱基(更优选地是5-30个碱基)，以及第三和第四链长度为8-3.3×10⁹碱基对。例如，第一和第二链可以构成双链探针，第三和第四链可以构成双链靶，如基因组DNA，其可以含有单元型。

在实施方案中，第三链和第四链是PCR扩增产物。

本发明的多链体可以在体外或体内存在于溶液中，存在于固相支持物上。固相支持物可以是电传导(例如电极)或非传导的。

根据本发明的四链体形成适用于各种用途。例如，共价地结合双链核酸切割剂的双链探针可以用于特异性切割双链核酸的靶序列。共价地结合化疗剂的双链探针可以用于特异性治疗双链核酸的靶序列。所以，本发明包括多链体结构，其进一步包括与第一、第二、第三和第四链中的至少一个结合的治疗剂、预防剂或诊断剂。

另外，本发明的多链体适用于纳米工程，如提供分子水平(即纳米级)上的电路。关于纳米工程与核酸的其它细节可以在授予Sen等的美国专利号5,948,897中找到，文献在此引入参考。

本发明的多链体可以通过一个方法来提供，该方法包括：提供含有第一链、第二链、第三链、第四链、水、缓冲液和促进剂的杂交介质，并且温育杂交介质，温育时间能有效使第二链与第四链杂交。

杂交介质可以包括任何已知适用于保护核苷酸的常规介质。参见例如Sambrook等，“分子克隆：实验室手册”，第二卷(1989)。例如，介质可以包括核苷酸、水、缓冲液和标准的盐浓度。当二价阳离子专门用于促进四链体的形成时，螯合剂如EDTA或EGTA不应该包括在反应混合物中。

互补碱基间的特异性结合发生在温度、盐浓度、静电强度和缓冲液组成变化的各种条件下。这些条件和利用它们的方法的例子是本领域已知的。

不象许多Hoogsteen类型的多链体，它们在pH值约7.6以上时是不稳定或不存在的，本发明的沃森—克里克多链体在大范围的pH水平下是稳定的，优选从约pH5到约pH9。

另外，本发明的多链体不需要同型嘧啶序列或同型嘌呤序列的存在，如同在某些现有技术的四链体中。例如，靶序列可以含有任何顺序的25％-75％的嘌呤碱基和75％-25％的嘧啶碱基。

优选地，多链体是在约5℃到约25℃的温度下反应约2小时或更少的时间形成的。即使在室温下温育时间优选少于5分钟。更长的反应时间是不需要的，但在大多数情况中，温育长达24小时不会对四链体有不利影响。本发明的沃森—克里克四链体的快速结合时间与Hoogsteen四链体的更长的结合时间形成对照。

在杂交介质中的促进剂优选地是嵌入剂或阳离子。嵌入剂可以是例如荧光团，如选自YOYO-1、TOTO-1、溴化乙锭、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2和吖啶。

合适的阳离子包括例如，单价阳离子，如Na⁺(优选浓度在50mM-125mM)、K⁺和其它碱金属离子；二价阳离子，如碱土金属离子(例如Mg⁺²和Ca⁺²)和二价过渡金属离子(例如Mn²⁺、Ni⁺²、Cd⁺²、Co⁺²和Zn⁺²)；和具有至少三价正电荷的阳离子，如Co(NH₃)₆⁺³，三价亚精胺和四价精胺。Mn⁺²优选地提供的浓度是10mM-30mM。Mg⁺²优选地提供的浓度15mM-20mM。Ni⁺²优选地提供的浓度是约20mM。在实施方案中，Mg⁺²和Mn⁺²提供的组合浓度各为10mM、15mM、20mM、25mM或30mM(即各10-30mM)。

阳离子向其中形成多链体的介质中的加入量依赖于许多因素，包括阳离子的性质、探针的浓度、靶的浓度、其他阳离子的存在和探针和靶的碱基含量。优选的阳离子浓度和混合物通常可通过实验找到。

虽然不需要，其它促进剂包括例如，单链结合蛋白质如Rec A蛋白质、T4基因32蛋白质、大肠杆菌单链结合蛋白质、大或小核酸沟结合蛋白质、紫罗碱和其它嵌入物质如放线菌素D、补骨脂内酯和当归根素。这样的促进试剂可以证明在极端操作条件下是有用的，例如在异常pH水平或极端高温下。

本发明也实现一个方法，其中第二链与第四链的杂交使与第三链和第四链中的至少一种相关的活性失活。所以，第一链和第二链中的至少一种进一步包括药剂，其中第二链与第四链的杂交将药剂放置于第三链、第四链或与第三链和第四链中的至少一种相关的另一种分子上的靶的有效距离内。药剂优选地选自设计成与临床相关基因启动子序列结合的核酸、设计成与临床相关基因结合的核酸或设计成与病原体的复制位点的起点结合的核酸。

在优选的实施方案中，本发明提供了快速、灵敏、环保和安全的方法，用于测定单链或双链靶和双链探针之间的结合，其中该靶包括核酸序列或核酸类似物序列，以及该探针包括核酸序列或核酸类似物序列。

本发明的分析可以用于例如鉴定折叠的核苷酸序列中可达到的区域、确定杂交复合物中错配碱基对的数目，以及对基因组作图。

本发明不仅检测特异性探针—靶结合的存在，而且提供关于探针和靶之间相互作用性质的定性和定量的信息。所以，本发明能够使试验员区别完全匹配、一个碱基对的错配、两个碱基对的错配、三个碱基对的错配、一个碱基对的缺失、两个碱基对的缺失和三个碱基对的缺失，这些错配和缺失是在双链探针中的序列和在双链靶中的序列之间发生的。    

本发明的实施方案包括以与相同的靶结合的其它探针所显示的相同类型的信号来校准第一探针—靶混合物的测定信号(例如荧光、化学发光、电化学发光或电特性)，其中其它各个探针与第一探针至少有一个碱基的不同。

可以产生校准曲线，其中测量信号大小(例如荧光强度)是靶和探针之间的结合亲合力的函数。当靶和多个不同探针之间的结合亲合力随着错配碱基的数目、错配的性质(A-G对A-C对T-G对T-C等)、四链体内错配的位置等而变化时，本发明的分析可以用于对靶测序。

在实施方案中，测量的信号可以是测试样品中包括的荧光团的荧光强度。在这样的实施方案中，根据是否通过信号猝灭或信号扩增进行荧光团信号杂交，在探针和靶之间的结合亲合力可以与强度正相关或负相关。在选定的条件下，嵌入剂产生的荧光强度可以与探针—靶结合亲合力正相关，然而利用与探针共价结合的非嵌入荧光团的优选的实施方案的强度可以与探针—靶结合亲合力负相关。优选地在0-2(含)个错配和/或缺失的范围内，更优选地在0-3(含)个错配和/或缺失的范围内，随着探针和靶之间错配的程度提高，非嵌入荧光团的荧光强度下降。

本发明能够定量测定探针和靶之间的结合亲合力。这样的信息可能在各种用途中有价值，包括设计具有最佳结合特性的反义药物。

本发明的分析是优选均一的。在检测测量的信号的量值之前，无需从游离的探针和游离的靶中分离探针—靶复合物，就可以进行分析。分析不需要凝胶分离步骤，从而允许大大增加测试流通量。定量分析是简单而准确的。结果，结合测定节省了许多时间和费用，并可以容易地自动化。另外，它能使结合变量如缓冲液、pH、离子浓度、温度、温育时间、探针和靶序列的相关浓度、嵌入剂浓度、靶序列的长度、探针序列的长度和可能的辅因子(即促进剂)的要求得到快速地确定。

分析可以在例如不可渗透的表面或在生物芯片上的孔或微型通道内的溶液中进行。在某些实施方案中，在第一和第二链之前将第三和第四链提供在杂交介质中，第一和第二链在通过与杂交介质接触再水合之前以去水化形式提供。

另外，本发明的分析优选地是无需在靶或探针上提供信号猝灭剂而进行的。

虽然本发明人已经在前面公开了杂交的荧光强度测定的优点(参见例如，1998年12月31日递交的美国专利申请号09/224,505)，本发明分析的某些实施方案检测了探针和双链靶的四链体，所以排除变性靶的需要。令人惊奇的是，本发明人已经能够特异性测定在双链探针和双链靶之间形成的四链体，其中探针和靶之间的相互作用是基于沃森—克里克碱基配对的(至少在A结合T(或U，在RNA的情况中)和G结合C的意义上)，而不是非常有限的四链体杂交的Hoogsteen模型，如Pitner等，同上。

用于本发明分析中的合适的探针包括例如dsDNA、dsRNA、DNA:RNA杂合体、dsPNA、PNA:DNA杂合体，和具有不带电荷或带部分电荷的主链的其它双链核酸类似物。具有8-20个碱基长度的探针序列是优选的，因为这是发现原核生物和真核生物最小的独特的DNA序列的范围。在实施方案中，5-30个碱基的探针是最优选的。但是，可以利用多个更短的探针来检测其中具有多个非独特的靶序列的核苷酸序列，将它们组合来独特地鉴定该核苷酸序列。可选择探针的长度来匹配靶的长度。

本发明不需要使用放射性探针，它们在使用中是危险、麻烦和耗时的，并需要不断地再生。本发明的探针优选使用时是安全的，并且长年稳定。因此，探针可以大量制造或定购和储存。

在实施方案中，用多分子的发信号复合物或氧化还原对，或用引发化学发光或电化学发光特性的标记来标记探针。

当荧光嵌入剂不存在于杂交介质中时，优选地，探针或靶(优选探针)具有与其共价结合的荧光标记。该标记优选地是非嵌入荧光团或嵌入荧光团。在这样的实施方案中，荧光团优选地在任意末端与探针结合。优选的荧光标记包括生物素、罗丹明、吖啶和荧光素，和其它当用激发能辐射时发荧光的标记。

选择激发波长(通过常规实验和/或常识)，以对应于使用荧光团的激发最大值，优选地是200-1000nm。优选地，选择荧光团具有200-1000nm的发射波长。在优选的实施方案中，利用氩离子激光器辐射荧光团，光的波长范围是400-540nm，在500-750nm的范围内检测荧光的发射。

本发明分析可以在各种温度下进行，如5-85℃。现有技术的一些分析需要提高的温度、增加成本和延迟测定。另一方面，本发明在室温或低于室温(例如低于25℃)下进行。

本发明的可靠性不依赖于所述靶中的鸟嘌呤和胞嘧啶的含量。因为G-C碱基对形成了三个氢键，而A-T碱基对仅形成了两个氢键，具有更高的G或C含量的靶和探针序列更稳定，具有更高的熔化温度。结果，提高存在于完全匹配的杂合体中的杂交探针和靶区域的GC含量的碱基对错配可以抵销与错配探针相关的结合减弱。

本发明分析是非常灵敏的，从而排除了对靶进行PCR扩增的需要。例如，分析具有约20微升体积的测试样品是可能的，其含有约10fmol的靶和约10fmol的探针。本发明的实施方案是足够灵敏的，可测定浓度为5×10^-9M、优选不超过5×10^-10M的靶。本发明的实施方案是灵敏的，足以利用浓度为5×10^-9M、优选不超过5×10^-10M的探针。不用说，前面的值并非暗示该方法不能检测更高的浓度。

探针(例如第一和第二链)与靶(例如第三和第四链)的比例是30∶1到1∶1，优选地是约10∶1。

参考下面的实施例，本发明将以更详细的方式来说明，但应该理解，本发明并不局限于此。

实施例

实施例1

有义和反义50-聚体ssDNA靶序列从人囊性纤维化基因的外显子10派生(Nature 380，207(1996))，并经修饰使GC含量从30％变为52％，这样的靶序列在DNA合成仪(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)上合成，然后通过HPLC纯化。将等摩尔量的互补寡核苷酸在95℃下变性10分钟，并且随着温度冷却到21℃，允许退火1.5小时以上。在双蒸馏水中溶解dsDNA寡核苷酸，浓度为1pmol/l。

野生型dsDNA靶A的有义链的序列(SEQ ID NO：1)为：5’-GAGCAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTC CTA CGATGA CTC TG-3’。

野生型dsDNA靶A的反义链的序列(SEQ ID NO：2)为：5’-CAGAGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAG TGT CTG TCATGG TGC TC-3’。

除了在有义和反义链上有一个碱基对突变(下划线)外，靶B是与野生型靶DNA相同的50聚体的突变dsDNA靶，其中野生型碱基CAT和ATG分别被碱基CGT和ACG取代。

突变体靶B的有义链的序列(SEQ ID NO：3)为：5’-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT CGT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTCTG-3’。

突变体靶B的反义链的序列(SEQ ID NO：4)为：5’-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAG AGA CGA CAG TGT CTG TCA TGG TGCTC-3’。

除了在有义和反义链上有一个碱基对的突变(下划线)外，靶C是与野生型靶DNA相同的50聚体的突变dsDNA靶，其中野生型碱基CAT和ATG分别被CTT和AAG取代。

突变体靶C的有义链的序列(SEQ ID NO：5)为：5’-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT CTT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTCTG-3’。

突变体靶C的反义链的序列(SEQ ID NO：6)为：5’-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAG AGA AGA CAG TGT CTG TCA TGG TGCTC-3’。

除了在有义和反义链上有一个碱基对突变(下划线)外，靶D是与野生型DNA相同的50聚体的突变dsDNA靶，其中野生型碱基CTC和GAG分别被碱基CTT和AAG取代。

突变体靶D的有义链的序列(SEQ ID NO：7)为：5’-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT CAT CTT TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTCTG-3’。

突变体靶D的反义链的序列(SEQ ID NO：8)为：5’-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAA AGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGCTC-3’。

除了在有义和反义链上有一个碱基对的突变(下划线)外，靶E是与野生型DNA相同的50聚体的突变dsDNA靶，其中野生型碱基CTC和GAG分别被碱基CCC和GGG取代。

突变体靶E的有义链的序列(SEQ ID NO：9)为：5’-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT CAT CCC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTCTG-3’。

突变体E的反义链的序列(SEQ ID NO：10)为：5’-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAG GGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGCTC-3’。

探针A是在每个5’位置具有附带的荧光素部分的15聚体dsDNA探针，并且设计成与靠近50聚体野生型靶A的中心的有义链和反义链的15个核苷酸区段镜像互补。探针的链是在前面提到的DNA合成仪上合成的，并且通过HPLC纯化。在95℃下变性等摩尔量的探针链10分钟，随着温度冷却到21℃，允许退火1.5小时以上。在双蒸馏水中溶解ds DNA探针，浓度为1pmol/μl。

探针A的有义链的序列(SEQ ID NO：11)为：5’-Flu-CTG TCA TCTCTG GTG-3’。

探针A的反义链的序列(SEQ ID NO：12)为：5’-Flu-CAC CAG AGATGA CAG-3’。

各个杂交反应混合物(40μl)含有下面的成分：0.4pmol靶dsDNA、4pmol 5’荧光素标记的dsDNA探针、10mM Tris-HCl、pH7.5和100mMKCl。在室温下(21℃)温育反应混合物1小时，预先不变性。在石英杯中放置样品，用具有波长488nm的氩离子激光束辐射，检测荧光的发射。在荧光素的发射波长525nm处，出现最大的荧光强度。图1表示对各个分析样品以波长为函数作图的荧光强度。

在没有KCl时，没有检测到dsDNA靶和探针A之间的杂交，导致当野生型dsDNA靶A或突变dsDNA靶D与dsDNA探针A混合或只有dsDNA探针A存在时，观察到了相似的荧光强度(数据没有显示)。

在存在100mM KCl时，在21℃温育1小时后，由dsDNA靶A和dsDNA探针A上的完全互补序列组成的dsDNA靶：dsDNA-F四链体很容易地形成，导致与只由dsDNA探针A所发射(标记dsDNA-F)的相比，荧光发射的强度下降62％(图1)。相反，在这些反应条件下，不完全互补dsDNA靶D:dsDNA-F探针A四链体含有1个碱基对G-T错配，是较不稳定的，与只由dsDNA探针A所表现的相比，仅产生18％的荧光强度的下降。

在特定浓度下，单价阳离子如K⁺的存在足以允许在没有预变性时，dsDNA靶和标记有荧光素的dsDNA探针之间形成四链体。在沃森—克里克碱基对亲合力的基础上发生四链体的形成，在完全互补的同源双链体链之间形成了可测量的和显著更大量的四链体。另外，反应是在1小时的温育时间内、室温下、探针与靶的比例为10-1、利用天然dsDNA时发生的。在本实施例中利用的dsDNA靶和dsDNA探针是同源的，含有53％的GC含量，并且在任何DNA链上都不含有同型嘌呤或同型嘧啶延伸。尽管有推论认为这种形成需要双链体探针放弃它的右手手性，但DNA四链体还是容易形成的。利用dsDNA探针，本发明分析能够鉴定完全互补的dsDNA序列和含有错配碱基对的那些序列。

实施例2

在实施例1中进行的四链体DNA分析是通过在反应混合物中加入单价阳离子来促进的。利用二价阳离子来促进具有53％GC含量的dsDNA靶和dsDNA-F探针的四链体DNA的形成，进一步检测分析的特异性。

各个杂交反应混合物(40μl)含有下面的成分：0.4pmol靶dsDNA、4pmol 5’-荧光素标记的dsDNA探针、10mM Tris-HCl、pH 7.5和20mMMnCl₂和20mM MgCl₂。在室温(21℃)下温育反应混合物1小时，无需预变性。在石英杯中放置样品，用具有波长488nm的氩离子激光束辐射，并且检测荧光发射。图2表示对各个分析样品以波长为函数作图的荧光强度。

在存在20mM MnCl₂和20mM MgCl₂时，当将dsDNA-F探针A(具有53％的GC含量)与50聚体的野生型dsDNA靶A或突变体dsDNA靶D一起温育时，在室温以及非变性条件下形成四链体。当完全匹配的DNA四链体的荧光强度最大下降34％时，较不好的含有1bp T-G错配的dsDNA:dsDNA-F四链体(dsDNA靶D+dsDNA探针A)产生的荧光强度与只由dsDNA探针A所观察到的大致相同(图2)。

二价阳离子如Mn⁺²和Mg⁺²的存在，在非变性条件下促进了四链体的形成，从而允许准确区别镜像互补的同源dsDNA靶和dsDNA探针四链体，和含有错配的碱基对的四链体序列。

二价阳离子促进了镜像互补的沃森—克里克四链体的形成，尽管有推论认为这一形成需要双链体探针放弃它的右手手性。

实施例3

在实施例1和2中进行的四链体DNA分析是通过在反应混合物中加入单价阳离子或二价阳离子来促进的。下面的实施例证明，当利用DNA嵌入剂时，四链体DNA分析具有特异性。

探针B是与探针A相同的15聚体dsDNA探针，其不附带荧光素标记，并可以相似方式制备。

各个杂交反应混合物(40μl)含有下面的成分：0.4pmol dsDNA靶、4pmol dsDNA探针B、0.5×TBE和100nM DNA嵌入剂YOYO-1(分子探针，Eugene，OR，USA)。在21℃温育反应混合物5分钟，然后测定。在石英杯中放置样品，用具有波长488nm的氩离子激光束辐射。在波长535nm处存在最大的荧光强度，表明嵌入了YOYO-1。

当没有靶或探针存在时(只有YOYO-1存在)观察到的荧光强度显示在图3中。图3还表明，当反应混合物组合了dsDNA探针B与含有同源序列的野生型50聚体dsDNA靶A，或与其他四个dsDNA靶时所观察到的荧光强度，所述其他四个dsDNA靶除了有一个错配碱基对外，含有同源于dsDNA探针B中碱基序列的序列。同源即镜像互补的野生型靶dsDNA当其与dsDNA探针B存在于反应混合物中时产生了最大的荧光强度。与由完全匹配的四链体所取得的荧光强度比较，错配的dsDNA靶当与dsDNA探针B在反应混合物中温育时产生了更小的荧光强度值，其范围从dsDNA靶C的少20％到dsDNA靶E的少80％(图3)。

据观察，当探针含有完全匹配即镜像互补序列时比当有单个碱基对不同源即不镜像互补于dsDNA靶中的序列时，在dsDNA靶和dsDNA探针之间更易形成由YOYO-1嵌入所稳定的沃森—克里克四链体。尽管推测的结论是四链体形成要求双链体探针放弃其右手的手性，但沃森—克里克四链体容易形成。

实施例4

在该实施例中，将50-聚体dsDNA靶与53％GC 15聚体dsDNA探针C接触，当将双链体探针的大沟放置于双链体靶的小沟中时，它们的沃森—克里克互补性存在于探针链的碱基以及靶链的碱基之间，本文称为嵌套互补。双链体探针中的碱基序列是不同源的，但与双链靶中的那些是反向的关系。

将探针链在上述的DNA合成仪上合成，并通过HPLC纯化。等摩尔量的探针链在95℃下变性10分钟，并随着温度冷却至21℃，允许退火1.5小时以上。将dsDNA探针溶解于双蒸馏水中，浓度为1pmol/μl。

dsDNA探针C的有义链的序列(SEQ ID NO：13)为：5’-GAC AGTAGA GAC CAC-3’。

dsDNA探针C的反义链的序列(SEQ ID NO：14)为：5’-GTG GTCTCT ACT GTC-3’。

各个杂交反应混合物(40μl)含有如下成分：0.4pmol靶dsDNA、4pmol dsDNA探针、0.5×TBE和100nM的DNA嵌入剂YOYO-1。反应混合物室温(21℃)下温育5分钟，放置于石英杯中，并用波长488nm的氩离子激光束辐射。最大荧光强度出现在波长535nm处，这是YOYO-1嵌入的表征。

图4说明在缺乏预变性的情况下，当野生型50聚体dsDNA靶A与15聚体dsDNA探针C反应时，获得了最高的荧光强度，这是在嵌套互补基础上与dsDNA靶A的完全匹配。荧光强度是DNA结合发生的表征，在此情形下，是dsDNA靶和嵌套互补dsDNA探针之间的四链体形成。

当匹配在嵌套互补的反向同源性基础上进行评价时，突变dsDNA靶与双链体探针通过单个碱基错配，其与dsDNA探针形成可测定的四链体复合体比完全互补的野生型dsDNA靶与dsDNA探针形成的四链体复合体更少。将在实施例3中以镜像互补为基础分析的各种错配在本实施例中以嵌套互补为基础进行分析。

如图4所示，由1bp错配的dsDNA靶加dsDNA探针C形成的四链体所产生的荧光强度比由完全匹配四链体(dsDNA靶A+dsDNA探针C)所获得的要少8-16％。

在实施例3中完全匹配和错配的四链体之间观察到荧光更大的区别。这提示完全互补或1bp错配的dsDNA探针更喜欢以嵌套互补方向而非以镜像互补方向与dsDNA靶结合。

该实施例表明在有YOYO-1存在下，在嵌套互补双链DNA之间的沃森—克里克四链体结合容易发生。这种便利的出现部分是由于下列事实：嵌套互补四链体结合使各个相互作用双链体的右手手性得以维持。

实施例5

50聚体ssDNA靶序列衍生自人囊性纤维化基因外显子10(Nature380，207(1996))，并通过修饰使GC含量从30％变为52％，将其在DNA合成仪(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)上进行合成并通过HPLC纯化。

50聚体野生型ssDNA靶F的链的序列(SEQ ID NO：2)为：5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAG TGT CTGTCA TGG TGC TC-3’。

除一个碱基突变(下划线)以外，靶G是与野生型ssDNA靶F相同的50聚体突变ssDNA靶。

突变ssDNA靶G的链的序列(SEQ ID NO：4)为：5’-CAG AGTCAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA CGA CAG TGT CTG TCA TGGTGC TC-3’。

除一个碱基突变(下划线)以外，靶H是与野生型ssDNA靶F相同的50聚体突变ssDNA靶。

突变ssDNA靶H的链的序列(SEQ ID NO：6)为：5’-CAG AGTCAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA AGA CAG TGT CTG TCA TGGTGC TC-3’。

除一个碱基突变(下划线)以外，靶I是与野生型ssDNA靶F相同的50聚体突变ssDNA靶。

突变ssDNA靶I的链的序列(SEQ ID NO：8)为：5’-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAA AGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGCTC-3’。

除一个碱基突变(下划线)以外，靶J是与野生型ssDNA靶F相同的50聚体突变ssDNA靶。

突变ssDNA靶J的链的序列(SEQ ID NO：10)为：5’-CAG AGTCAT CGT AGG ACA CAC CAG GGA TGA CAG TGT CTG TCA TGGTGC TC-3’。

除一个碱基突变(下划线)以外，靶K是与野生型ssDNA靶F相同的50聚体突变ssDNA靶。

突变ssDNA靶K的链的序列(SEQ ID NO：15)为：5’-CAG AGTCAT CGT AGG ACA CAC CAG CGA TGA CAG TGT CTG TCA TGGTGC TC-3’。

探针B是15聚体dsDNA探针，除了没有荧光素标记外，与探针A相同，其被相应地制备。探针B的一条链(即SEQ ID NO：11)互补于靠近50聚体野生型ssDNA靶F中心的15个核苷酸区段。

各个杂交反应混合物(40μl)含有下列成分：0.4pmol靶ssDNA、4pmol dsDNA探针、0.5×TBE和100nM YOYO-1。反应混合物室温(21℃)下温育5分钟，无需预变性。样品置于石英杯中，用具有波长488nm的氩离子激光束辐射，并对荧光发射进行监测。所有激光辐射的累积时间为80毫秒。最大荧光强度出现在波长535nm处，这是YOYO-1嵌入的表征。图5表示了对各个分析样品以波长为函数作图的荧光强度。

在靶ssDNA缺乏下，一些dsDNA探针之间的杂交在镜像互补的基础上出现(图5)。这种同源双链DNA之间的结合公开在此前的例子中。只与YOYO-1温育的ssDNA靶导致强度发射值降低，其少于只与YOYO-1温育的dsDNA探针的强度发射值的一半(数据未显示)。

在有100mM YOYO-1存在下，21℃温育5分钟后，ssDNA靶F与dsDNA探针B上的完全互补序列容易形成结合复合体，导致与只由dsDNA探针B所发射的比较荧光发射强度增加79％(图5)。与之相反，含有多种一个碱基对错配的不完全互补的ssDNA靶在这些反应条件下是较不稳定的，与只由dsDNA探针B所表现的比较，荧光强度仅产生19-31％的增加(图5)。

在没有预变性情况下，嵌入剂YOYO-1的存在足够使得dsDNA探针和ssDNA靶之间的结合。结合发生在沃森—克里克碱基对亲合力基础之上，在完全互补的链之间具有可测定的、显著更大量的结合。利用天然DNA，以探针和靶的比例10∶1，室温下在仅仅温育5分钟之内就发生了反应。本实施例所用的ssDNA靶和dsDNA探针含有53％GC含量，并在任何DNA链上都不含有同型嘌呤或同型嘧啶延伸。利用dsDNA探针，本发明分析能够鉴别完全互补的ssDNA序列以及那些含有错配碱基的序列。

虽然在实质程度上完全自我互补即同源链序列以及相互之间以镜像互补方式即大沟与大沟结合的双链体探针之间结合发生，本发明的分析仍起作用。

当本发明已详细描述以及参照其特定实施例，对本领域专业技术人员来说，在不背离本发明实质和范围的情形下可进行各种变化和修饰将是明显的。

                                序列表

<110>英詹尼斯公司(INGENEUS CORPORATION)

<120>四链体DNA和双链体探针系统(QUADRUPLEX DNA SYSTEM AND DUPLEX PROBE SYSTEMS)

<130>SCT030685-47

<140>US 09/664,827

<141>2000-09-19

<160>15

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>1

gagcaccatg acagacactg tcatctctgg tgtgtcctac gatgactctg                50

<210>2

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>2

cagagtcatc gtaggacaca ccagagatga cagtgtctgt catggtgctc                50

<210>3

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>3

gagcaccatg acagacactg tcgtctctgg tgtgtcctac gatgactctg                50

<210>4

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>4

cagagtcatc gtaggacaca ccagagacga cagtgtctgt catggtgctc                50

<210>5

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>5

gagcaccatg acagacactg tcttctctgg tgtgtcctac gatgactctg                50

<210>6

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>6

cagagtcatc gtaggacaca ccagagaaga cagtgtctgt catggtgctc                50

<210>7

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>7

gagcaccatg acagacactg tcatctttgg tgtgtcctac gatgactctg                50

<210>8

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>8

cagagtcatc gtaggacaca ccaaagatga cagtgtctgt catggtgctc                50

<210>9

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<213>人工序列

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<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>9

gagcaccatg acagacactg tcatccctgg tgtgtcctac gatgactctg                50

<210>10

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>10

cagagtcatc gtaggacaca ccagggatga cagtgtctgt catggtgctc                50

<210>11

<211>15

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<213>人工序列

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<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>11

ctgtcatctc tggtg                                                      15

<210>12

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>12

caccagagat gacag                                                      15

<210>13

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>13

gacagtagag accac                                                      15

<210>14

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>14

gtggtctcta ctgtc                                                      15

<210>15

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>衍生自人囊性纤维化基因的外显子10

    (derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)

<400>15

cagagtcatc gtaggacaca ccagcgatga cagtgtctgt catggtgctc                50