一种提取小牛血去蛋白提取物的方法

摘要

一种提取小牛血去蛋白提取物的方法,其中包括:采幼牛静脉血,分离出血清,用乙醇去蛋白,减压去除乙醇,加入复合蛋白酶水解,离心分离留上清,将上清液中的乙醇浓缩,除菌,冻干;其中所述的用乙醇去蛋白时乙醇的用量为96%两倍于血清体积的乙醇;其中所述的减压去除乙醇为利用真空旋转蒸发仪,37℃,1个大气压减压除乙醇;其中所述的加入复合蛋白酶水解为加入复合蛋白酶水解24小时;其中所述的加入复合蛋白酶水解后离心分离为在10000rpm、4℃,离心30分钟,留上清。

说明书

本发明涉及医学生化药物领域，具体地说是指一种提取小牛血去蛋白提取物的方法。

小牛血去蛋白提取物含有无机离子(K⁺、Na⁺、Cl^-、Ca²⁺等)及一些小分子有机物(如氨基酸、核苷酸，小分子肽等)，它们能增加组织细胞对氧的摄入和利用，促进葡萄糖向脑组织转运，并能促进葡萄糖在脑内进行有氧代谢，尤其在缺血、缺氧的条件下，“小牛血去蛋白提取物”能使脑组织产生更多的高能化合物(ATP)，以维护脑组织的正常生理功能，它主要用于脑血管性疾病，脑缺血，脑外伤，脑痴呆等脑功能障碍性疾病的治疗。然而现在还没有很合适的提取方法。

本发明的目的在于提供一种“提取小牛血去蛋白提取物”的方法，从幼牛血液中提取“小牛血去蛋白提取物”这一生物活性物质，检测其生物活性，进行质量控制，然后制成生化药物，用于临床。

本发明所提供的“提取小牛血去蛋白提取物”的方法包括：采幼牛静脉血，分离出血清，用乙醇去蛋白，减压去除乙醇，加入复合蛋白酶水解，离心分离留上清，将上清液中的乙醇浓缩，除菌，冻干。

其中所述的用乙醇去蛋白中乙醇的用量为96％两倍于血清体积的乙醇；

其中所述的减压去除乙醇为利用真空旋转蒸发仪，37℃，1个大气压减压除乙醇；

其中所述的加入复合蛋白酶水解为加入复合蛋白酶水解24小时(水解一些核酸及蛋白质)

其中所述的加入复合蛋白酶水解后离心分离为在10000rpm、4℃，离心30分钟，留上清。

使用本发明所提供提取小牛血去蛋白提取物的方法得到的产品的成分分析结果表明：

离子，k⁺Na⁺Ca²⁺               60％

核苷酸，氨基酸，小分子肽，酮酸，40％。

实施例1：

在无菌条件下采6个月以内小牛静脉血(细胞污染可溶血)，放于4℃冰箱中过夜，使其自然分离出一部分血清，剩余部分在无菌条件下，4000rpm，4℃离心15分钟，分离血清，加入96％两倍于血清体积的乙醇，不断搅拌，静止60分钟，使蛋白质变性沉淀，然后经20000rpm4℃离心30分钟，留上清，利用真空旋转蒸发仪，37℃，1个大气压减压除乙醇，在余下液体中加入复合蛋白酶水解24小时(水解一些核酸及蛋白质)，然后10000rpm、4℃，离心30分钟，留上清(加入乙醇的目的是为了溶解更多的物质)，上清用真空旋转蒸发仪去除乙醇，余下液体用5000道尔顿中空纤维柱截面留分子量。然后除菌，分装(每只2ml)，冻干，得到“小牛血去蛋白提取物”成品。

使用本发明所提供的方法提取得到的小牛血去蛋白提取物的质量标准为：提取物为去蛋白的小牛血衍生物的无菌冻干制剂，含牛血衍生物应为标示量的90.0-110.0％；性状为白色或微黄色疏松状冻干粉，在水中易溶解；相对密度(中国药典1990年版二部附录13页)为1.0211.025。产品的检测情况为：

[鉴别]

氨基酸分析：用自动采样器和注射装置将标准液和供试品稀释液(取供试品1支，加水溶解，然后稀释6倍)，各100ul注入色谱分离柱，根据标准色谱图确定各种氨基酸的保留时间，然后比较保留时间，鉴别各种氨基酸。此外，通过贮存液在积分仪中的标准曲线，可根据峰面积确定氨基酸的浓度(mg/ml)。结果见附录。

[检查]

澄明度：取本品与对照液水(离子交换和渗透水)和乳浊液I(取硫酸肼1.0g，加水使溶解并稀释至1000ml，放置4-6小时，另取乌洛托品2.5g，置100ml具塞烧瓶中，加水25.0ml使溶解，加硫酸肼24ml，加水稀释到1000.0ml，量取5ml，加水稀释至100.ml即得)，分别置内径为15mm的中性玻璃管中，供试品的澄明度应与水相同，如呈混浊，是不得较浮浊液I更浓，本品符合规定。

水份：7％(中国药内1990年版二部附录55页费体压法)

蛋白质：阳性

PH值：6.5-7.5(中国药典1990年版二部附录44页)

无菌：符合规定(中国药典1990年版二部附录109页)

热源：符合规定(中国药典1990年版二部附录106页)(生物活性测定)

用华学力压呼吸器测定该品促进肠鼠肝匀浆耗氧量的呼吸活性。从测得的耗量计算出本品呼吸活力CO₂及刺激指数SI，CO₂就大于1.0于mgh，SI应大于2.0。

[含量测定]

干物质测定：称取烧灼过的海砂约1.5g，铺在一称量瓶的底部，称定称量瓶的皮重，然后量取适量本品，置称量瓶中，先在约2.7kpa和53±2℃的真空干燥器中干燥1.5小时，然后在＜0.7kpa和相同温度下干燥至恒重。待供试品冷至室温，称定内含干燥供试品的称量瓶的重量。

按下式计算牛血衍生物的干重

本品为9-11mg/ml

(规格)20mg/支

(贮存)25℃以下避光

(有效期)1年

本发明所提供一种提取小牛血去蛋白提取物的方法简单，产品结果可靠，检测其生物活性，进行质量控制，然后制成生化药物，可用于临床。