一种依特卡肽中间体及依特卡肽的合成方法

摘要

本发明公开了一种依特卡肽中间体及依特卡肽的合成方法。其中，该依特卡肽中间体为Fmoc‑D‑Cys(S‑S‑(N‑Boc)‑L‑Cys(OtBu))‑OH，依特卡肽中间体的合成方法包括以下步骤：以N‑Boc‑L‑Cys‑OtBu为起始原料，通过取代反应生成初级产物，其中，R为S‑Py或Cl，初级产物与Fmoc‑D‑Cys‑OH氨基酸进行偶联反应得到Fmoc‑D‑Cys(S‑S‑(N‑Boc)‑L‑Cys(OtBu))‑OH。该关键中间体用于合成依特卡肽可以提高纯度和收率，重要的是，合成此关键中间体的原料廉价易得，工艺简单。

说明书

技术领域

本发明涉及化学合成技术领域，具体而言，涉及一种依特卡肽中间体及依特卡肽的合成方法。

背景技术

依特卡肽是由KaiPharmaceuticals,Inc.开发的一种新颖的拟钙剂，能够抑制甲状旁腺激素的分泌。依特卡肽可结合并激活甲状旁腺上的钙敏感受体，实现甲状旁腺激素水平的降低。

依特卡肽有3个D构型的精氨酸、2个D构型的丙氨酸、1个D构型的精氨酰胺、1个L构型半胱氨酸与1个D构型半胱氨酸（N端被乙酰基封闭）构成，其中D构型半胱氨酸与L构型半胱氨酸以二硫键连接在一起（N-acetyl-D-cysteinyl-D-alanyl-D-arginyl-D-arginyl-D-arginyl>D-alanyl-D-Argininamide>

目前报道的专利中，都是固相链接至7肽，然后再选择不同的方法链接二硫键，特别是在脱除MMT过程中，需要使用1%~2%TFA/DCM反复操作15次以上，操作相当繁琐。

专利2017/114238 A1：采用的液相合成方法，路线较长，且总收率仅11%；专利WO2017/114240 A1：依照专利，粗肽纯度为81.0%, 杂质较多，纯化后总收率30.5%；专利US2019/0100554 A1：依照专利，粗肽纯度较低，需要多次纯化，总收率50%；中国专利CN201811277081中，粗肽纯度88.2%，纯化后总收率57.8%。也就是说，目前固相合成7肽连接半胱氨酸及衍生物这种方法，均存在粗肽纯度低，杂质多，难纯化等问题。

发明内容

本发明旨在提供一种依特卡肽中间体及依特卡肽的合成方法，该中间体用于合成伊特卡肽，以解决现有技术中依特卡肽合成步骤复杂的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种依特卡肽中间体的合成方法。该依特卡肽中间体为Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH，其结构式I所示：

结构式I

依特卡肽中间体的合成方法包括以下步骤：以N-Boc-L-Cys-OtBu为起始原料，通过取代反应生成初级产物，其中，R为S-Py或Cl，初级产物与Fmoc->-Cys-OH氨基酸进行偶联反应得到Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH。

进一步地，初级产物为Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu，Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))->N-Boc-L-Cys-OtBu与二硫二吡啶取代反应合成得到初级产物Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu；以及将Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu与Fmoc-D-Cys-OH偶联得到Fmoc-D-Cys-（S-S->N-Boc)-L>-Cys-OtBu)-OH。

进一步地，Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))->N-Boc-L-Cys-OtBu和二硫二吡啶加入溶剂A中，搅拌6~12>N-Boc)-L-Cys>D-Cys-OH和Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu，控温15~30^oC搅拌反应0.5~2>D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))->

进一步地，N-Boc-L-Cys-OtBu与二硫二吡啶反应中，N-Boc-L-Cys-OtBu和二硫二吡啶的摩尔比为1:1.2~1:6.4；N-Boc-L-Cys-OtBu在溶剂A>D-Cys-OH的浓度为0.01~0.3>D-Cys-OH与Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu的摩尔比为1:0.8~1.4。

进一步地，初级产物为(N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu，Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))->N-Boc-L-Cys-OtBu与NCS反应合成(N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu；以及将(N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu与Fmoc-D-Cys-OH反应得到Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L->

进一步地，Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))->N-Boc-L-Cys-OtBu溶解在溶剂C中，控温0~10^oC，加入DIPEA，分批加入NCS，搅拌4~5>oC，将Fmoc-D-Cys-OH加入滤液中，加入DIPEA，反应控温10~30^oC，搅拌0.5~2>D-Cys(S-S->N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH；优选的，溶剂C选自DCM、THF、DMF>

进一步地，步骤A中，N-Boc-L-Cys-OtBu溶解在溶剂C中得到浓度为0.01~0.3>D-Cys-OH的加入量为1.1~1.5>

根据本发明的另一个方面，提供一种依特卡肽的合成方法。该合成方法包括以下步骤：S1，上述任一种的依特卡肽中间体的合成方法合成Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH；以及S2，将NH₂-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg与Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L->

进一步地，S2中，NH₂-D-Ala-D-Arg-D->D-Arg-D-Ala-D-Arg为NH₂-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-树脂六肽。

进一步地，S2包括：使用氨基树脂依照固相合成的方法链接NH₂-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-树脂六肽，将Fmoc-D-Cys>N-Boc)-L-Cys(>oC活化0-10min，控温20~30^oC反应2~6>

进一步地，Fmoc-D-Cys>N-Boc)-L-Cys(>

应用本发明的技术方案，通过合成关键中间体Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH，进而再合成依特卡肽，避免了肽链构建二硫键时的副反应，简化了操作，用于合成依特卡肽可以提高纯度和收率，重要的是，合成此中间体的原料廉价易得，工艺简单。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1示出了实施例1中 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH的纯度图谱；

图2示出了实施例1的中间体Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH的>LC-MS：>

图3示出了实施例3中制备纯化后的伊特卡肽纯度图谱。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本发明中所涉及的缩写解释如下：

Fmoc：9-芴甲氧基羰基。

Boc：叔丁基羰基。

tBu：叔丁基。

Arg：精氨酸。

Cys：半胱氨酸。

Ala：丙氨酸。

PyBop：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。

DIPEA：N,N-二异丙基乙胺。

DCM：二氯甲烷。

NCS：N-氯代丁二酰亚胺。

DMF：N，N-二甲基甲酰胺。

NMP：N-甲基吡咯烷酮。

DMAc：N,N-二甲基乙酰胺。

THF：四氢呋喃。

OtBu：叔丁氧基。

EtOAc: 乙酸乙酯。

依特卡肽的合成中，最关键的就是二硫键的合成。该步骤的收率的好坏直接影响到最终整条路线的收率。本申请的发明人发现，关键中间体Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH，(N-芴甲酰基-D-半胱氨酸-S-S-(N-叔丁氧羰基-L-半胱氨酸叔丁酯))的合成预先合成出二硫键从而可以完美的避开固相反应效率低收率差的问题。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种依特卡肽中间体的合成方法，依特卡肽中间体为Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH，依特卡肽中间体的合成方法包括以下步骤：以N-Boc-L-Cys-OtBu为起始原料，通过取代反应生成初级产物，其中，R为S-Py或Cl，初级产物与Fmoc->-Cys-OH氨基酸进行偶联反应得到Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH。

应用本发明的技术方案，通过合成关键中间体Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH，进而再合成依特卡肽，避免了肽链构建二硫键时的副反应，简化了操作，用于合成依特卡肽可以提高纯度和收率，重要的是，合成此关键中间体的原料廉价易得，工艺简单。

根据本发明一种典型的实施方式，初级产物为Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu，Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH通过以下步骤制得：将N-Boc-L-Cys-OtBu与二硫二吡啶反应合成得到Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu；以及将Py-S-S->N-Boc)-L-Cys-OtBu与Fmoc-D-Cys-OH偶联得到Fmoc-D-Cys-(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH，重要的是，合成此中间体的原料廉价易得，工艺简单。

优选的，Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH通过以下步骤制得：室温下，将(N-Boc)-L->N-Boc)-L-Cys-OtBu；溶剂B中加入Fmoc-D-Cys-OH和Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu，控温15~30^oC搅拌反应0.5~2>D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH。优选的，溶剂A选自DMF、NMP和DMAc中的一种或多种；优选的，萃取剂选自EtOAc、MTBE和DCM中的一种或多种；优选的，所述溶剂B选自DCM、DMF、THF、NMP和DMAc中的一种或多种。

为了提高原料的利用率，保证反应的快速有效进行，进一步优选的，N-Boc-L-Cys-OtBu与二硫二吡啶反应中，N-Boc-L-Cys-OtBu和二硫二吡啶的摩尔比为1:1.2~1:6.4，(N-Boc)-L->D-Cys-OH的浓度为0.01~0.3>D-Cys-OH与Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu的摩尔比为1:>

根据本发明一种典型的实施方式，初级产物为(N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu，Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH通过以下步骤制得：将N-Boc-L-Cys-OtBu与NCS反应合成(N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu；以及将(N-Boc)-L->D-Cys-OH反应得到Fmoc-D-Cys-(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH。

优选的，Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH通过以下步骤制得：A.>N-Boc)-Cys-OtBu溶解在溶剂C中，控温0~10^oC，加入DIPEA，分批加入NCS，搅拌4~5>oC，将Fmoc-D-Cys-OH加入滤液中，加入DIPEA，反应控温10~30^{>，搅拌0.5~2>D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys (OtBu))-OH。优选的，所述溶剂C选自DCM、THF、DMF>}

为了提高原料的利用率，保证反应的快速有效进行，进一步优选的，步骤A中，>N-Boc)-L-Cys>D-Cys-OH的加入量为1.1~1.5eq。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种依特卡肽的合成方法。该合成方法包括以下步骤：S1，按照上述任一种依特卡肽中间体的合成方法合成Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH；以及S2，将NH₂-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg与所述Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L->

由于关键中间体Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH的原料廉价易得，工艺简单，也直接使得本发明中依特卡肽的合成方法原料廉价易得，工艺简单。

优选地，S2中，NH₂-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg为NH₂-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-树脂六肽。优选的，S2包括：使用氨基树脂依照固相合成的方法链接NH₂-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-树脂六肽，将Fmoc-D-Cys>N-Boc)-L-Cys(>oC活化0-10>oC反应2~6>D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH:PyBop:DIPEA=3:>

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

具体实施方式合成路线：

实施例1

R=S-Py

以N-Boc-L-Cys-OtBu>N-Boc)-L-Cys>N-Boc)-L-Cys-OtBu(Cpd>D-Cys-OH偶联得到Fmoc-D-Cys->N-Boc)-L-Cys-OtBu)-OH(Cpd>

步骤 1

室温下，将Cpd 1 (1.6 g, 1.0 eq)和2,2-dithiodipyridne (5.1 g, 4.0 eq)加入DMF(16 mL，10 vol.)中。反应室温搅拌6~12 h；然后体系中加入水；使用乙酸乙酯(100 mL*3)萃取；有机相合并后使用MgSO₄干燥，过滤；有机相浓缩得到Cpd>N-Boc)-L>

步骤2

15~30^oC下，DCM>D-Cys-OH>oC下搅拌反应0.5~2>D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys-(OtBu))-OH(Cpd>

图1示出了纯化后的Cpd 3纯度图谱；图2示出了纯化后的Cpd 3的LCMS图谱。

实施例2

R=Cl

以N-Boc-L-Cys-OtBu>N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu>N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu(Cpd>D-Cys-OH反应得到Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L- Cys-(OtBu))-OH(Cpd>

步骤 1

(N-Boc)-Cys-OtBu（0.28>oC，加入DIPEA（0.19>oC分批加入NCS（0.15>

步骤2

控温0-10^oC，将Fmoc-D-Cys-OH(0.34>oC，搅拌0.5~2>D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys-(OtBu))-OH (Cpd>

纯化后的Cpd 3的LCMS图谱同图2。

实施例 3

使用关键中间体合成依特卡肽：

使用氨基树脂（包括但不限于Sieber树脂，Rink Amide MBHA，Rink Amide 树脂）依照固相合成的方法链接NH₂-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-树脂六肽，用关键中间体按照Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu>>活化0~5>oC反应2~6>

参照新开发的依特卡肽关键中间体Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu>

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请中先合成了一种依特卡肽的关键中间体Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH，使用该中间体合成依特卡肽，制备后纯度可以达到99.51%（图3）,>

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。