生脉散在抑制ras原癌基因过表达中的应用

摘要

本发明属中药领域，涉及生脉散在抑制ras原癌基因过表达中的应用，具体涉及在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物中的应用。研究表明约90%胰腺、50%结肠癌、30%-40%肺腺癌及5%-40%的白血病是由于ras基因过表达造成的，Ras蛋白已成为公认的筛选抗相关恶性肿瘤药物的靶标。动物实验表明生脉散可特异性下调ras原癌基因突变后所致的过表达，而不作用于野生型ras原癌基因，因此毒性低，且无致畸作用。本发明提供了一种生脉散的新用途，可在制备由ras原癌基因过表达导致的肿瘤药物中应用，有望开发成新一代的抗肿瘤药物。

说明书

技术领域

  本发明涉及生脉散在抑制ras原癌基因过表达中的应用，具体涉及在制备抑制ras原癌基因突变后过表达的抗肿瘤药物中的应用，属于中药领域。

背景技术

生脉散是中医千古名方，首载于金代医家张元素所著《医学启源 ·卷下》“麦门冬”条内；内外伤辨惑论及医方考中也有记载。由人参、麦冬、五味子组成，意在取“人参之甘补气，麦门（即麦冬）苦寒泻热补水之源，五味子之酸清肃燥金”。

生脉散最早用于治疗暑热汗多，气阴两伤之证，表现为汗多、身疲、体倦、气短、咽干、脉虚等症状。古代医家也用于金叶耗伤，脉微欲绝等症状，又用作气阴两虚病人的补益剂。此方经过几百年的长期使用，安全有效，经久不衰。随着现代医学的发展，生脉散的临床应用不断扩大，其剂型除散剂外，还有生脉饮、生脉注射液；该方剂经加减变化后还发展了参麦饮和生脉散党参方等。现在主要用于治疗心血管病中的抗休克、抗心衰、抗心肌缺血等症状、糖尿病、慢性支气管炎，各类心源性休克、冠心病、心律失常等。

汤铭新等发现生脉散可显著抑制肺癌的自发转移，但是实验证明这种抗肿瘤作用并非生脉散直接作用于癌细胞，而是通过提高机体免疫功能间接实现抗肿瘤。中国专利201010148044.0公开了一种具有抗肿瘤作用的组合物及其在制备治疗肿瘤药物中的应用，该专利将生脉散与其他中药复方添加到以含主药蟾酥的抗肿瘤药物组合物中，生脉散减少了蟾酥所带来的心脏毒性问题；中国专利200510053562.9公开了生脉注射液在制备治疗肿瘤减毒药物中的用途，在对荷瘤小鼠化疗过程中，同时应用生脉散可保护肝肾功能。中国专利03142266.7公开了生脉注射液在制备治疗肿瘤增效药物中的用途。该专利中应用生脉散注射液处理结肠癌、乳腺癌、肝癌和胰腺癌细胞株，证明生脉注射液单独应用时的抗肿瘤作用效果时有时无，生脉散仅具较稳定的协同增效作用。上述发明专利中涉及生脉散的抗肿瘤应用，均局限于将生脉散作为肿瘤治疗过程中的辅助用药应用。

约30%的人类肿瘤是由于ras原癌基因突变后激活导致Ras蛋白表达水平增高造成的。若Ras蛋白持续处于活化状态，可与下游的效应蛋白结合，将信号传递到下游信号元件，引起细胞的异常增殖，导致肿瘤的发生。因此，Ras原癌基因已成为公认的筛选抗相关恶性肿瘤药物的靶标。

研究表明组成生脉散的单味药人参、五味子和麦冬均具有抗肿瘤作用，但将它们组方成为生脉散后，人们对其在抗肿瘤应用方面却只发现了它具较稳定的协同增效作用，因此只能将该方剂作为治疗肿瘤的辅助用药。本发明公开了生脉散对Ras原癌基因突变后所致的过表达具有显著的抑制作用，而不作用于野生型ras原癌基因，因此毒性低，且无致畸作用。本发明摆脱了传统观念的束缚，证明生脉散方剂具有显著下调ras原癌基因过表达活性，可在制备抑制ras原癌基因过表达的抗相关恶性肿瘤的药物中应用，而不仅仅是辅助用途。

发明内容

本发明的目的是提供中药复方生脉散在制药中的新用途，涉及生脉散在抑制ras原癌基因过表达中的应用，具体涉及在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物中的应用，以期提供一种抗肿瘤活性高，毒性小，廉价的抗肿瘤药物。

本发明中药复方生脉散的配方为：

配方1：人参、麦冬、五味子的质量比为9：9：6。

配方2：人参、麦冬、五味子的质量比为9：18：9。

配方3：人参、麦冬、五味子的质量比为9：5.4：5.4。

本发明所述的生脉散方剂，其组方比例可以根据中药组方原则合理改动，而不改变该方剂在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物中的用途，这是本领域技术人员可以理解的。

本发明所述的中药复方生脉散在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，可以将中药复方生脉散添加药学上可接受的载体如填充剂、润滑剂、湿润剂、促进吸收剂、吸附载体、稀释剂、赋形剂等，必要时可加入甜味剂、香味剂等，制备成注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、片剂等药物的多种剂型，这是本领域技术人员可以理解的。

本发明提供一种生脉散方剂在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物的新用途。本发明公开的生脉散方剂的应用具有以下的优势：

（1）    生脉散方剂可以显著抑制ras原癌基因过表达，可在制备治疗由ras原癌基因过表达导致的肿瘤药物中应用。

（2）    生脉散方剂中人参、麦冬和五味子之间的组方配比可以根据中药组方原则合理改动，其仍然可以显著下调ras原癌基因过度激活，具有抗肿瘤活性。

（3）    生脉散方剂仅仅作用于过表达的突变体Ras蛋白，而对野生型Ras蛋白无影响。提示生脉散在应用上安全，它仅作用于癌细胞，而不会作用于正常细胞。今后，我们有望将生脉散应用在抗相关恶性肿瘤药物的制备中，其中，所述肿瘤是由ras原癌基因的过表达导致的，从而为此类肿瘤患者提供更好的治疗，为一些疑难癌症的治疗提供新的途径。

（4）    生脉散方剂显著下调ras原癌基因过表达，并不是致突变引起的，不致畸。

（5）    由于ras信号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中let-60基因编码保守的Ras蛋白，它与人类的Ras蛋白相比具有83%的同源性。如果ras突变，在秀丽隐杆线虫中会引起线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶性增殖，导致肿瘤的发生。因此，模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）Ras/MAPK信号通路过度激活型突变体被作为受试群体广泛应用于筛选抑制ras原癌基因通路过度激活的抗肿瘤药物。因此，本实验采用了秀丽隐杆线虫突变株作为评估抑制ras原癌基因通路过度激活药物的模型，并得出了生脉散对ras原癌基因过表达有明显下调作用、具有抑制ras原癌基因通路过度激活的结论。

以下提供具体实施例以实现本发明所述的生脉散方剂在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物中应用，但不限于这些实施例。 

具体实施方式 

实施例一生脉散方剂的制备

材料：人参、麦冬、五味子购自兰州黄河药市。

选用的不同的配方的生脉散，如下：

配方1 人参：麦冬：五味子= 9:9:6 (3:3:2)     

配方2 人参：麦冬：五味子= 9:18:9 (1:2:1)    

配方3 人参：麦冬：五味子= 9:5.4:5.4 (5:3:3)   

先用蒸馏水浸泡20分钟，然后文火煮沸，煎煮30min，定容，离心，弃去沉淀，将上清无菌过滤，置4℃冰箱待用，使用时稀释不同的浓度。

实施例二中药复方生脉散对秀丽隐杆线虫MT2124（let-60过度激活突变）的作用

Ras是一种小分子蛋白，参与调控动物发育过程中的很多重要环节。ras信号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中let-60基因编码保守的Ras蛋白，它与人类的Ras蛋白相比具有83%的同源性。如果ras突变，在秀丽隐杆线虫中会引起线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶性增殖，导致肿瘤的发生。因此，模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）Ras/MAPK信号通路过度激活型突变体被作为受试群体广泛应用于筛选抑制原癌基因ras通路过度激活的抗肿瘤药物。

MT2124是let-60/ras过度激活的秀丽隐杆线虫，会产生多阴门的表型。将中药复方稀释一定的浓度，作用于秀丽隐杆线虫MT2124，如果能够抑制受试线虫群体多阴门产生个体的比例，而只有一个真阴门的野生型线虫个体比例上升，则说明药物作用于ras通路，下调了该通路的过度激活，具有抗肿瘤活性。群体中野生型线虫的比例越高，则药物作用效果越显著。如以突变体比例表示则相反，其中，野生型比例（%）=100%-突变体比例（%）

实验材料：秀丽隐杆线虫MT2124，基因型：let-60(n1046) IV, 购自CGC（Caenorhabditis Genetics Center）；大肠杆菌OP50，尿嘧啶渗漏突变株，作为秀丽隐杆线虫的食物，购自CGC。

试剂：固体NGM培养基成分与制作（以1升为例）：

成分含量NaCl3.00gK₂HPO₄2.34gKH₂PO₄17.23g蛋白胨2.50g琼脂17.00gH₂O1000ml

固体NGM培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min,在无菌操作台下加入5mg/ml胆固醇1ml，1M MgSO₄ 1ml,1M CaCl₂ 1ml,摇匀，趁热倒入已灭菌的9cm培养板，约20ml/板。静置等待培养基凝固，备用。

 

具体实验步骤：

线虫的培养：将线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上，然后将放在20℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。

线虫同步化：用M9缓冲液将平板上的线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管；4000rpm/ min离心3min，去除上清；加入裂解液（终浓度：3.2% NaClO和1M NaOH）；在涡旋仪上震荡7min，使线虫的虫体破裂释放卵；4000rpm/ min离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的线虫卵；M9缓冲液冲洗两次，加入1ml M9缓冲液，置于20℃培养箱中孵化48小时。

药物作用：将中药复方原液稀释一定的浓度，同步化后的线虫稀释到80条/20μl左右，在96孔板中，每个孔中加S液120μl，虫液20μl，10mg/ml的大肠杆菌OP50 20μl，5mg/ml的胆固醇20μl，合适稀释的药液20μl，每个浓度设置五个平行。空白对照组不加药液，将药液换成S液。20℃恒温培养至线虫成熟，在显微镜下检测线虫的野生型比例。结果如下表所示：

表1  生脉散配方1不同浓度下对秀丽隐杆线虫MT2124野生型比例的影响

表2  生脉散配方2、3不同浓度下对秀丽隐杆线虫MT2124野生型比例的影响

注：* 与空白组比较 P＜0.05

从上表可以看出，生脉散使秀丽隐杆线虫MT2124的野生型比例显著增加，并呈浓度依赖关系，说明在生脉散作用于ras通路，对ras原癌基因过度激活有明显下调作用，使突变体变为野生型。同时在实验过程中，秀丽隐杆线虫的数量并未减少，说明生脉散的毒性小，并不会引起秀丽隐杆线虫的死亡。

实施例三中药复方生脉散对秀丽隐杆线虫MT8189（lin-15突变失活）的作用

实验材料：秀丽隐杆线虫MT8189，多阴门表型，基因型: lin-15b(n765) X，购自CGC（Caenorhabditis Genetics Center）；大肠杆菌OP50，尿嘧啶渗漏突变株，作为秀丽隐杆线虫的食物，购自CGC。

具体实验步骤：同实施例二。

表3 生脉散对秀丽隐杆线虫MT8189（lin-15突变失活）的作用

在lin-15(n765)X位于ras的上游，正常情况下抑制ras基因的表达，MT8189线虫株系中该基因失活导致线虫呈多产卵器表型。

如表所示，生脉散不能抑制lin-15(n765)X的多阴门表型，根据遗传上位的原则，生脉散既然可逆转其下游的let60/ras原癌基因过度激活导致的多阴门表型，那么也抑制MT8189的多阴门表型，但本实验中未观察到预期结果，即生脉散不能抑制let60/ras上游基因lin-15(n765)X的多阴门表型。这可能是由于lin-15(n765)X线虫中包含的是野生型let60/ras拷贝，生脉散仅仅对过表达的let60/ras起作用，对野生型let60/ras不敏感，即生脉散仅仅作用于过度激活的Ras蛋白，对野生型Ras蛋白不敏感，这说明该中药组合物仅仅作用于ras过度激活的引起肿瘤细胞，而不作用于正常的细胞。

此外，生脉配方2和3也同样不能抑制let60/ras上游基因lin-15(n765)X的多阴门表型。

实施例四中药复方生脉散对秀丽隐杆线虫CB1275（lin-1突变失活）的作用

实验材料：秀丽隐杆线虫 基因型：lin-1(e1275) IV，购自CGC（Caenorhabditis Genetics Center）；大肠杆菌OP50，尿嘧啶渗漏突变株，作为秀丽隐杆线虫的食物，购自CGC。

具体实验步骤：同实施例二。

表4 生脉散对秀丽隐杆线虫CB1275（lin-1突变失活）的作用

lin-1是ras下游的一个基因，是可被MAPK磷酸化的核转录因子，是阴门发育的负调节因子，调节let-60下游的阴门发育的信号通路。lin-1突变失活后，线虫为多阴门表型。由于lin-1为核转录因子，调节阴门细胞发育的过程。若药物对该基因失活突变的多阴门表型具显著的抑制作用，则说明药物可直接抑制阴门前体细胞的发育，阻止其形成多阴门而呈非特异的细胞毒作用。

本实施例的结果是CB1275株系线虫的多阴门表型未受到生脉散的影响，这表明药物作用于ras信号通路可抑制ras过度激活形成的假阴门，不能抑制lin-1突变失活形成的假阴门表型，说明生脉散作用于ras而不作用于lin-1，证明药物下调了ras的过度激活而不是直接抑制了细胞的增殖起作用的，即生脉配方1起作用是 ras通路机制依赖，而非广泛的细胞毒作用。

生脉配方2和3也同样不能抑制CB1275株系线虫的多阴门表型。

实施例五中药复方生脉散对秀丽隐杆线虫MT2124（let-60过度激活突变）作用后对野生型线虫后代的影响

实验材料：同实施例二

实验步骤：按实施例三的方法，将药物作用于秀丽隐杆线虫MT2124，待线虫成熟后，挑取野生型的秀丽隐杆线虫于不加药物条件下培养，从每个药物处理浓度挑取5条，设置三个平行。20℃，130rpm恒温振荡培养至挑取线虫产生的后代发育成熟，在显微镜下检测其后代线虫群体野生型比例。

实验结果表明，药物处理所致的野生型线虫转移到新鲜的不加药物的条件培养，其后代野生型比例（17.5±2.4）%下降至空白水平（15.2±1.5）%（P<0.05），说明生脉散抑制多阴门表型并不是由于致突变产生的，表明生脉散不是在基因水平起作用，不具有致畸作用。

以上实施例的动物实验表明，本发明所涉及的具有抗肿瘤活性的中药复方生脉散对ras原癌基因突变所致的过度激活具有明显的下调作用，而不作用于野生型ras原癌基因，因此毒性低，且无致畸作用，说明生脉散适于在制备抗相关恶性肿瘤药物中应用，有望开发成新一代的治疗ras原癌基因突变引起的相关恶性肿瘤的药物制剂。