冷休克蛋白质组合物和用于其用途的方法以及试剂盒

摘要

本发明提供了包含用于改进的DNA合成反应(具有改进的反应性)的冷休克蛋白质的组合物，使用这些组合物用于合成DNA的方法，在这些方法中使用的试剂盒，以及通过这些方法产生的DNA组合物。本发明进一步提供用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的包含冷休克蛋白质的组合物，使用这些组合物用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的方法，以及在这些方法中使用的试剂盒。

说明书

本申请是申请日为2009年3月2日、申请号为200980106857.9、发明名称为“冷休克蛋白质组合物和用于其用途的方法以及试剂盒”的发明专利申请的分案申请。

优先权声明 

本申请要求提交于2008年2月29日的美国临时申请号61/067,596，提交于2008年10月9日的美国临时申请号61/195,747，以及提交于2008年5月16日的日本申请号2008-129745的优先权，这些公开的内容在此处全部并入本文作为参考。

序列列表

随本文一并提交书写形式的及计算机可读形式的序列列表。计算机可读形式记录的信息与书写形式的序列列表是相同的。

发明背景

在研究领域，将DNA的合成用于多种目的。其中，除了化学合成短链DNA如寡聚核苷酸之外，通过使用了DNA聚合酶的酶促方法进行DNA合成中的大部分。PCR可在体外容易地扩增所需要的核酸片段，有极高的价值，并已经成为生物学、医学、农业和其他领域中不可缺少的工具。在由PCR扩增DNA的过程中，许多情况下都要求反应的高特异性。尽管开发了新型DNA聚合酶，也优化了反应混合物的组成以减少非-特异性扩增，但是仍然需要对PCR扩增特异性的改进。

除了使用DNA作为模板材料的传统PCR方法之外，还可使用RNA-依赖的DNA聚合酶逆转录酶实现DNA的合成。在研究领域中， 常常有必要分析衍生自多种基因的mRNA分子。逆转录酶使得用RNA作为模板合成cDNA的逆转录反应成为可能，并且因此，已经在对mRNA分子的分析上实现了卓越的进步。通过在克隆技术和PCR技术的应用，其中使用了逆转录酶的mRNA分子的分析现在在遗传学研究中是不可缺少的实验技术，并且已经成为多种领域如生物学、医学、农业中绝对必要的技术。

迄今已经产生了一些手段以改进逆转录反应的反应性，例如，已经研究了在高温下进行的逆转录反应过程；在其中使用了逆转录酶以及具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的cDNA合成过程(JP专利号3910015)；其中使用了核酸-结合蛋白质如Ncp7、recA、SSB及T4gp32的过程(WO 00/55307)；等等。尽管有一些对逆转录反应的反应性的改进，然而可能无法合成全长的cDNA，并且甚至在如今，有些情况下所合成的cDNA的量可能不足。因此，对逆转录反应的反应性的改进仍然是正进行的大事，必须要进一步改进。

除了对上文描述的两种DNA合成方法的改进之外，在科学领域还需要可以确定内切核糖核酸酶的切割位点特异性的技术。例如，mRNA干扰酶为存在于广泛的细菌基因组中的毒素-抗毒素系统编码的序列-特异性内切核糖核酸酶。这些内切核糖核酸酶通常具有单链RNA内的特异性切割位点：大肠杆菌(E.coli)MazF在ACA序列处特异性切割，ChpBK在ACY序列处(Y为U、A或G)特异性切割，来自质粒R100的PemK在UAH序列处(其中H为C、A或U)特异性切割，来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的MazF-mt1和MazF-mt6分别在UAC和U富含区域特异性切割。最近，有发现来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的MazF同源物在VUUV’处进行切割(其中V和V’为A、C或G，且可以相同或不相同)。然而确定分支结核杆菌的一些MazF同源物的切割特异性的之前尝试却失败了。尤其是对于确定其中识别长于三个碱基的特异性序列的切割特异性，使用足够长以覆盖所有可能的靶标序列的RNA底物是至关重要的。使用长RNA作为底物的一个主要问题在于尽管其为单链 RNA，却形成非常稳定的二级结构。为了使用这种或任何其他长RNA作为内切核糖核酸酶的底物，必须解折叠其二级结构。因此，还有对开发用以确定内切核糖核酸酶如mRNA干扰酶的切割-位点特异性的新技术的需要。

在多种微生物体内发现有冷休克蛋白质，人们认为其在对生长温度下移的适应中起到一些作用。其中，已经鉴定CspA为一种主要的冷休克蛋白质。从大肠杆菌(Escherichia coli)中分离出编码CspA的基因，并使用其基因产生了重组CspA(见WO 90/09444)。然而，冷休克蛋白质的常规提出的应用限于其作为冷冻保护蛋白质的用途，其保护农田中不受冷冻或霜冻损害。

本发明提供了用于改进的DNA合成反应(具有改进的反应性)的包含冷休克蛋白质的组合物，使用这些组合物用于合成DNA的方法，在这些方法中使用的试剂盒，以及通过这些方法产生的组合物。本发明进一步提供用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的包含冷休克蛋白质的组合物，使用这些组合物用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的方法，以及在这些方法中使用的试剂盒。

发明概述

根据本发明，提供了使用DNA聚合酶用于DNA合成的组合物，使用这种组合物用于合成DNA的方法，用于这种DNA合成方法的试剂盒，以及根据所提供这种方法合成的DNA组合物。本发明的一个目标是使得使用DNA聚合酶进行DNA合成成为可能，其中反应的反应性得到改进。

本发明的一个实施方式涉及用于DNA合成的组合物，其包含冷休克蛋白质和DNA聚合酶。在本发明的特定实施方式中，作为此冷休克蛋白质的示例为CspA或其同源物，优选地，为衍生自大肠杆菌的CspA或其同源物。组合物可包含超过0.5μg的CspA每25μL组合物。根据这种实施方式的组合物可包含两种或多种DNA聚合酶。进一步地，根据这种实施方式的组合物可包含至少一种引物和至少一种 脱氧核苷酸。这种组合物可进一步包括液体媒介物，如反应缓冲溶液。

本发明的一个进一步的实施方式包含A)冷休克蛋白质；B)至少一种选自DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸、和DNA的组分；以及C)液体媒介物。 

本发明的一个进一步的实施方式涉及合成DNA的方法，其包括步骤：A)制备包含冷休克蛋白质、DNA聚合酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷三磷酸、和DNA的混合物；以及B)孵育步骤A)中制备的混合物。

本发明的另一个实施方式涉及用于DNA合成的试剂盒，其包含冷休克蛋白质和DNA聚合酶。根据这种实施方式的试剂盒可进一步包含液体媒介物或关于如何使用试剂盒的纸质或电子形式的说明书。这种试剂盒的组分可单独地或分开地存在。

本发明还涉及由包括以下步骤的方法合成的DNA组合物：A)制备包含冷休克蛋白质、DNA聚合酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷的混合物、和DNA；以及B)孵育步骤A)中制备的混合物。

本发明还涉及有利地用于逆转录反应的组合物，使用所述组合物的cDNA合成方法，有利地用于逆转录反应的试剂盒，以及由此方法合成的cDNA组合物。根据本发明，可实现这种令人满意的逆转录反应，其在特异性、合成链的长度、合成量等等方面是出众的。

本发明的一个实施方式涉及用于逆转录反应的组合物，其包含冷休克蛋白质或其同源物；和逆转录酶。在根据本发明的这种实施方式中，冷休克蛋白质的实例是CspA或其同源物，CspA的一个实例为衍生自大肠杆菌的CspA。在一些实施方式中，CspA可以从大约0.5μg-大约20μg CspA每20μL的组合物的量存在。逆转录酶的实例为衍生自莫洛尼鼠类白血病病毒的逆转录酶和/或衍生自禽成髓细胞瘤病毒的逆转录病毒的逆转录酶和/或其组合。进一步地，根据本发明的此实施方式中的组合物可进一步包含至少一种引物和至少一种脱氧核苷酸。组合物的进一步的实施方式包含液体媒介物，如反应缓冲溶液。其他实施方式包含寡聚(dT)引物或具有随机序列的寡聚核苷酸引物 或其组合。

本发明的一个进一步的实施方式包含用于逆转录反应的组合物，其包含：A)冷休克蛋白质；B)至少一种选自逆转录酶、引物、脱氧核苷酸、和RNA的组分；以及C)液体媒介物。

本发明的一个进一步的实施方式涉及用于合成cDNA的方法，包括：A)制备包含冷休克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷、和RNA的混合物；以及B)孵育步骤A)中制备的混合物。

本发明的一个进一步的实施方式包含用于逆转录反应的试剂盒，包含：A)冷休克蛋白质；B)至少一种选自逆转录酶、引物、脱氧核苷酸、和RNA的组分；以及C)液体媒介物。根据这个实施方式的试剂盒可进一步包含液体媒介物或关于如何使用试剂盒的纸质或电子形式的说明书。这种试剂盒的组分可单独地或分开地存在。这个实施方式的试剂盒可进一步包含用于进行基因扩增反应的试剂。

本发明进一步涉及由包括以下步骤的方法合成的cDNA组合物：A)制备包含冷休克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷、和RNA的溶液；以及B)孵育步骤A)中制备的溶液。

本发明进一步涉及用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的组合物，使用这些组合物用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的方法以及用于这些方法的试剂盒。

本发明的一个实施方式涉及用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的组合物，A)冷休克蛋白质；以及B)至少一种选自RNA底物和内切核糖核酸酶的组分。在根据本发明的这种实施方式中，冷休克蛋白质的实例为CspA或其同源物，CspA的一个实例是衍生自大肠杆菌的CspA。在优选的实施方式中，RNA底物长于1024个碱基并含有大约相等数量的每种碱基。这种RNA底物的一个实例为细菌噬菌体MS2RNA。这种实施方式的组合物可进一步包含液体媒介物。

本发明的另一个实施方式涉及用于确定内切核糖核酸酶切割位点的方法，其包括步骤：A)制备包含冷休克蛋白质、RNA底物、和内 切核糖核酸酶的混合物；以及B)孵育步骤A)中制备的混合物。这种方法可进一步包括通过电泳分析混合物。

本发明的一个进一步的实施方式涉及用于确定内切核糖核酸酶切割位点的试剂盒，其包含冷休克蛋白质和RNA底物。此实施方式的试剂盒可进一步包含液体媒介物，如反应缓冲溶液。

此实施方式可进一步包含关于如何使用试剂盒的纸质或电子形式的说明书。在这种实施方式中，冷休克蛋白质和RNA底物可单独或组合存在。

如本文使用的，冷休克蛋白质为那些在暴露于生长温度下移引起的冷休克时在生物体，尤其是微生物体中表达的蛋白质的集体名称。当大肠杆菌的孵育温度从37℃降低到15℃时，会高水平地瞬时表达叫做CspA的冷休克蛋白质。已知大肠杆菌有八种不同的蛋白质，CspB-CspI，其与CspA具有高的氨基酸序列同一性。在这些蛋白质中，CspB、CspG和CspI为冷休克蛋白质。进一步地，通常已知这些冷休克蛋白质的同源物存在于其他微生物如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(CspB)、热溶芽孢杆菌(Bacillus caldolyticus)(CspB)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(CspB，CspL)和胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(CspL)。在本发明中，CspA的同源物指的是具有显示与衍生自大肠杆菌的CspA的氨基酸序列至少50％的序列同一性的氨基酸序列的冷休克蛋白质。在本发明中，可使用这些冷休克蛋白质。在本发明中使用的冷休克蛋白质的实例优选地为CspA，更优选地是衍生自革兰氏-阴性细菌的CspA，甚至更优选地是衍生自大肠杆菌的CspA。可通过重组DNA技术或从微生物体中分离而制备本发明中使用的CspA。

同源物指的是与目标蛋白质具有序列同源性的实体，优选地显示与另一种多肽的氨基酸序列有至少50％的序列同一性，并且在结构特征或生物学功能上具有相似性。

如本文使用的，脱氧核苷酸指的是通过磷酯键键合于脱氧核糖的磷酸基团，所述脱氧核糖键合于有机碱基。天然DNA包括四种不同 的核苷酸。这些核苷酸分别由可在天然DNA中找到的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶碱基构成。腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶碱基分别缩写为A、G、C和T。脱氧核苷酸包括游离的单磷酸、二磷酸和三磷酸(更具体地，磷酸基团的每种包含一个、两个或三个磷酸部分)。因此，脱氧核苷酸包括脱氧核苷酸三磷酸(例如，dATP、dCTP、dITP、dGTP和dTTP)及其衍生物。脱氧核苷酸衍生物包括[αS]dATP、7-deaza-dGTP、7-deaza-dATP以及显示出针对核酸分解的抗性的脱氧核苷酸衍生物。脱氧核苷酸衍生物包括例如，以这样的方式标记的脱氧核苷酸，可以通过放射性同位素如³²P或³⁵S、荧光部分、化学发光部分、生物发光部分或酶检测到。

如本文使用的，脱氧核苷酸三磷酸指的是这样的核苷酸，其糖部分由脱氧核糖组成，并具有三磷酸基团。天然DNA包括四种不同核苷酸，其分别具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和此胸腺嘧啶作为碱基部分。本发明组合物中包含的脱氧核苷酸三磷酸为四种脱氧核苷酸三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物。在本发明中，还可使用脱氧核苷酸三磷酸的衍生物。脱氧核苷酸三磷酸衍生物包括[·S]dATP，7-deaza-dGTP、7-deaza-dATP和显示了针对核酸消化的抗性的脱氧核苷酸衍生物。核苷酸衍生物还包括，例如，以这样的方式标记的脱氧核苷酸，可以通过放射性同位素如³²P或³⁵S、荧光分子、化学发光分子、生物发光分子或酶检测到。

如本文使用的，反应缓冲溶液指的是包括缓冲试剂或缓冲试剂混合物的溶液，可进一步包括二价阳离子和单价阳离子。

在本文使用的术语“或”(例如A或B)的范围内，意指“A或B或二者”。如本文使用的，术语“一个”或“一种”或“这个”的使用不旨在对量进行限制。例如，详述的说明书中参考的“一种冷休克蛋白质”不旨在指“单一冷休克蛋白质”，且这种参考可包含任何单一冷休克蛋白质或多个冷休克蛋白质。

附图简述

图1示例说明在CspA存在或不存在时，由Taq DNA聚合酶扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳结果。在以“M”标记的泳道电泳HindIII-消化的λDNA。

图2示例说明在CspA存在或不存在时，由用于LA-PCR的DNA聚合酶混合物扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳结果。在以“M”标记的泳道电泳HindIII-消化的λDNA。

图3示例说明在CspA存在或不存在时，由α-型DNA聚合酶扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳结果。在以“M”标记的泳道电泳HindIII-消化的λDNA。

图4示例说明在CspA存在或不存在时，从多种靶标序列扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳结果。在以“M”标记的泳道电泳100bp梯度标记物(ladder marker，由TAKARA BIO INC制造)。

图5示例说明在热-处理的或非热处理的CspA存在时，由用于LA-PCR的DNA聚合酶混合物扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳结果。在以“M”标记的泳道电泳100bp梯度标记物。

图6为示例说明CspA发挥的抑制非-特异性延伸产物的作用的附图。

图7为示例说明CspA发挥的抑制非-特异性延伸产物的作用的附图。

图8为示例说明CspA发挥的抑制非-特异性延伸产物的作用的附图。

图9为示例说明CspA发挥的改进逆转录反应反应性的作用的附图。

图10为示例说明CspA发挥的改进逆转录反应反应性的作用的附图。

图11为示例说明CspA发挥的改进逆转录反应反应性的作用的附图。

图12为示例说明CspA发挥的改进逆转录反应反应性的作用的附图。图6-12中M标注了将2.5μL的λ-HindIII消化产物(由TAKARA  BIO INC.制造)标记物进行电泳的泳道。

图13为示例说明CspA发挥的改进逆转录反应反应性的作用的附图。图13中M标注了将2.5μL的λ-HindIII消化产物(由TAKARA BIO INC.制造)标记物进行电泳的泳道。

图14描绘了MS2RNA的二级结构以及CspA的MazF-mt3的内切核糖核酸酶活性的增强。图14A描绘了由MFOLD(http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-simple.html)预测的MS2ssRNA的二级结构。37℃下的最小折叠能为-1460.69kcal/摩尔。箭头指示由引物延伸分析鉴定的MazF-mt3的切割位点，蓝点箭头指示引物延伸分析没有检测到的MazF-mt3的预测切割位点。图14B描绘了通过RNA伴侣分子CspA对内切核糖核酸酶活性的增强。在37℃下，使用(泳道3、4、5和6)或不使用(泳道1和2)纯化的N-末端加His-标签的MazF-mt3，使用(泳道2和5，32μg；泳道4，16μg；泳道6，64μg)或不使用(泳道1和3)纯化的CspA蛋白质，进行部分消化全长MS2mRNA。消化反应混合物(10μl)由1.6μg的MS2 RNA底物，1.6μg的MazF-mt3(His)₆，16、32或64μg的CspA及10mMTris-HCl(pH7.8)中0.5μl的RNase抑制剂(Roche)构成。反应产物在1.2％(1x TBE)琼脂糖凝胶上进行电泳。

图15A-H描绘了使用(His)₆MazF-mt3对MS2RNA的体外切割，显示MazF-mt3特异性地在UUCCU位点处进行切割。泳道1代表了对照反应，其中没有加入蛋白质；泳道2，其中只加入CspA蛋白质的对照反应；泳道3，MS2 RNA只与(His)₆MazF-mt3；泳道4，MS2 RNA与(His)₆MazF-mt3和CspA蛋白质一同孵育。在RNA序列上以箭头指示切割位点，并使用右边显示的RNA梯度(ladder)确定这些位点。在图15H中，将RNA梯度精简到C(碱基3390)和G(碱基3394)残基之间，但是通过比较上游和下游区域与标准序列阐明了序列。

图16A-D描绘了使用(His)₆MizF-mt3对MS2 RNA的体外切割，显示MazF-mt3特异性地在CUCCU位点处进行切割。泳道1，其中没有加入蛋白质的对照反应；泳道2，其中只加入CspA蛋白质的对 照反应；泳道3，MS2 RNA仅与(His)₆MazF-mt3一同孵育；泳道4，MS2RNA与(His)₆MazF-mt3和CspA蛋白质一同孵育。在RNA序列上以箭头指示强的和弱的切割位点，并且使用右边显示的RNA梯度确定这些位点。

图17A-R描绘了使用(His)₆MazF-mt7对MS2RNA的体外切割。泳道1，其中没有加入酶的对照反应；泳道2，其中只加入了CspA蛋白质的对照反应；泳道3，MS2RNA仅与(His)₆MazF-mt3一同孵育；泳道4，MS2RNA与(His)₆MazF-mt3和CspA蛋白质一同孵育。在RNA序列上以箭头指示强的和弱的切割位点，并且使用右边显示的RNA梯度确定这些位点。

发明详述

(1)根据本发明的、用于使用DNA聚合酶的改进的DNA合成的组合物 

本发明的组合物包含冷休克蛋白质或其同源物和DNA聚合酶。惊人地，与不存在冷休克蛋白质的DNA合成反应相比较，在使用包含冷休克蛋白质和DNA聚合酶的反应混合物的情况下，DNA合成反应的反应性有所改进。

在本发明中，尽管没有具体的限制，上文的DNA合成方式的反应性改进指的是减少非-特异性扩增，增加衍生自靶标序列的扩增产物的量，等等。可通过以常规方法分析反应混合物中合成的产物而对些改进进行定量，所述常规方法如在琼脂糖胶上进行电泳。

根据本发明的DNA合成方法，抑制了DNA的非-特异性合成。常规地，已经知道应当将DNA合成的反应混合物保持在低温直到反应开始，以防止非-特异性反应的发生。使用根据本发明的组合物使得可以直接使用置于室温的混合物进行DNA合成反应。

没有特别地限制可用于本发明的DNA聚合酶；然而，优选的是热稳定性DNA聚合酶。作为可用于本发明的DNA聚合酶，示例的是衍生自真细菌如属于栖热菌属(Thermus)或芽孢杆菌属(Bacillus) 的细菌的DNA聚合酶(衍生自粞热水生菌(Thermus aquaticus)，热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)等等的DNA聚合酶)，衍生自古细菌如属于种属火球菌属(Pyrococcus)或热球菌属(Thermococcus)的DNA聚合酶(衍生自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)，Thermococcus litralis，thermococcus kodakaraensis等的DNA聚合酶)。在本发明的DNA合成方法中，优选的是可用于PCR的热稳定DNA聚合酶。

在本发明的组合物中可包含两种或更多种DNA聚合酶。例如，可在本发明中使用具有3’->5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶和另一种基本上不具有3’->5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。使用这种DNA聚合酶组合的技术被称为LA-PCR(长而精确的PCR)。

除了冷休克蛋白质和DNA聚合酶之外，根据本发明的组合物可进一步包含至少一种引物、至少一种脱氧核苷酸三磷酸、和/或反应缓冲溶液。

引物是具有与模板DNA互补的核苷酸序列的寡聚核苷酸。只要其能在本发明使用的反应条件下与模板DNA退火，则关于引物没有特定的限制。

由于进行的是特异性退火过程，引物长度优选的为至少六个核苷酸，更优选地至少10个核苷酸。根据寡聚核苷酸的合成，引物长度优选地为至多100个核苷酸，更优选地至多30个核苷酸。可通过已知方法化学合成寡聚核苷酸。寡聚核苷酸可为衍生自天然来源的寡聚核苷酸，例如，可通过以限制性内切酶消化从天然来源制备的DNA而进行制备。

本发明的组合物可用于制备由DNA聚合酶进行的DNA合成的混合物。包括冷休克蛋白质的用于DNA合成反应的组合物或包含冷休克蛋白质的DNA合成反应加速剂也是本发明的实施方式。

(2)根据本发明的、用于使用DNA聚合酶的改进的DNA合成的方法 

本发明的用于合成DNA的方法包括步骤：

A)制备包含冷休克蛋白质或其同源物、DNA聚合酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷酸三磷酸、和作为模板的DNA的混合物；以及

B)孵育步骤A)中制备的混合物。

与不存在冷休克蛋白质时的DNA合成反应相比，通过本发明的方法，DNA合成反应的反应性有所改进。

作为模板的DNA指的是在引物与此DNA退火时，DNA可用作DNA延伸的模板。用于本发明方法的混合物可包含单一模板或具有不同序列的多种模板。分别使用特异性模板的引物对可同时获得对应于各自模板的产物。这种多种模板可以以相同DNA或不同DNA分子存在。作为模板的DNA可为双链DNA，单链DNA或DNA-RNA杂合体。

没有特别限制本发明使用的冷休克蛋白质的量，其可为每25μl的反应混合物超过0.5μg，优选地为2-15μg，更优选地为5-12μg。

没有特别限制本发明使用的DNA聚合酶的量。例如，其可与常规DNA合成中使用的量相同。用于PCR的DNA聚合酶的优选的量是本领域技术人员已知的。通常地，在使用衍生自粞热水生菌的DNA聚合酶的PCR情况下，使用每25μl反应混合物0.125-5U的DNA聚合酶。

在本发明中，根据每种DNA聚合酶产品的说明书提出商业可得的DNA聚合酶的活性。例如，通过使用具有50μl终体积的混合物(含有25mM TAPS(25℃下为pH9.3)，50mM氯化钾，2mM氯化镁，1mMβ-巯基乙醇，dATP、dGTP和dTTP各200μM，以及100μM的[α-32P]dCTP)确定DNA聚合酶的活性。将一单位(下文描述为“1U”)的DNA聚合酶活性定义为“能够在74℃下，30分钟内将10nmol的dNTP并入酸-不可溶性物质的酶量”。

没有特别限制本发明的方法中使用的各引物的量，其可以为0.05-2μM。

在本发明优选的实施方式中，通过DNA扩增方法，如PCR来进 行DNA合成。

(3)根据本发明的、用于使用DNA聚合酶的改进的DNA合成的试剂盒 

根据本发明的试剂盒包含冷休克蛋白质以及DNA聚合酶。只要其可用于上文的DNA合成方法，则不会特别地限制本发明试剂盒。可以为用于标记核酸的试剂盒，用于PCR的试剂盒，用于估计核酸的试剂盒，用于定点诱变的试剂盒等等。

除了热休克蛋白质和DNA聚合酶之外，本发明的试剂盒可进一步包含至少一种引物、至少一种脱氧核苷酸三磷酸、和/或反应缓冲溶液。可使用上文项目(1)中所描述的作为试剂盒的组分(热休克蛋白质、DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸三磷酸、和/或反应缓冲溶液)。

试剂盒可以以各组分作为独立的组分存在的状态或以其中一些组分结合的状态包含上述组分。在一个实施方式中，本发明的试剂盒包含上文(1)中描述的本发明的组合物。

(4)根据本发明的、用于使用逆转录酶的改进的cDNA合成的组合物 

根据本跟发明的组合物包含冷休克蛋白质和逆转录酶。惊人地，与单独使用逆转录酶的逆转录反应相比，其中使用含有冷休克蛋白质和逆转录酶的反应组合物的情况下，逆转录反应的反应性有所改进。

没有特别地限制在逆转录反应的反应性上所检测到的改进；然而，其选自反应特异性的改进、核酸合成的量的增加、和合成链的长度的增加。本发明对于合成长链cDNA的逆转录反应尤其有利，并使得所合成的cDNA的量增加。进一步地，可以减少非-特异性cDNA的合成。常规地，认为高温下使用热-抗性逆转录酶的逆转录反应对于长链cDNA的合成有效(例如，见WO 01/92500)。根据本发明，可以不进行高温的逆转录反应而有效地合成长链cDNA。本发明还对高温逆转录反应适用，且相应地改进了其中使用多种酶的逆转录反应。

在根据本发明的组合物中所期望的CspA的可能作用为改进反应特异性和通过抑制低温下的错误引发而增加扩增产物的量，以及通过 解开RNA二维结构而获得的延伸的改进和扩增产物量的增加。

只要其具有逆转录活性——即合成与用作模板的RNA互补的DNA的活性，则可在本发明中使用任何逆转录酶。逆转录酶的实例为衍生自病毒的逆转录酶，如衍生自莫洛尼鼠类白血病病毒的逆转录酶(衍生自MMLV的逆转录酶)，衍生自禽成髓细胞瘤病毒的逆转录酶(衍生自AMV的逆转录酶)，以及衍生自真细菌的逆转录酶如衍生自栖热菌属细菌的DNA聚合酶(Tth DNA聚合酶，等等)和衍生自芽孢杆菌属的嗜热细菌的DNA聚合酶(Bca DNA聚合酶，等等)。

优选地使用衍生自病毒的逆转录酶，在本发明中更优选地使用衍生自MMLV的逆转录酶。进一步地，只要其具有逆转录活性，本发明还可使用修饰成为天然-衍生氨基酸序列的逆转录酶。

除了热休克蛋白质和逆转录酶之外，根据本发明的组合物可包括至少一种引物、至少一种脱氧核苷酸、和/或反应缓冲溶液。

引物可为具有与模板RNA互补的核苷酸序列的寡聚核苷酸，只要其在所使用的反应条件下与模板RNA退火，就对其没有特别的限制。引物可为寡聚核苷酸如寡聚(dT)或具有随机序列的寡聚核苷酸(随机引物)。

由于进行的是特异性退火过程，则引物长度优选地为至少6个核苷酸，更优选地至少10个核苷酸。根据寡聚核苷酸的合成，引物长度优选地为至多100个核苷酸，更优选地至多30个核苷酸。例如，可根据亚磷酰胺方法由DNA合成仪394(由Applied Biosystems制造)合成此寡聚核苷酸。可根据任何其他过程，如三酯磷酸方法，H-膦酸方法，或硫代磷酸盐方法合成寡聚核苷酸。寡聚核苷酸可为衍生自生物学标本的寡聚核苷酸，例如，可从制备于天然标本的DNA的限制性内切核糖核酸酶消化物中分离而制备。

作为本发明的一个实施方式，还涉及到用于逆转录反应的包含冷休克蛋白质的组合物中的每种，以及用于逆转录反应的包含冷休克蛋白质的反应物加速剂。

(5)根据本发明的、用于使用逆转录酶的改进的cDNA合成的 过程

本发明提供了用于合成cDNA的过程，其中根据本发明的组合物包括步骤：

A)制备包含冷休克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷酸、和用作模板的RNA的溶液；以及

B)孵育步骤A)中制备的溶液。

与其中使用了不包含冷休克蛋白质的组合物的过程相比，根据本发明的此cDNA合成过程，逆转录反应的反应性有所改进。

可通过例如检查所合成的cDNA的量的链长度而估计逆转录反应的反应性的改进。

可由这样的方式检查通过逆转录反应获得的合成的cDNA的量，在逆转录反应后，对特定量的反应溶液进行实时PCR以定量所合成的靶标核酸的量。与逆转录反应中使用不包含冷休克蛋白质的组合物的情况相比，在使用根据本发明的组合物进行逆转录反应的情况下所合成的cDNA的量有所增加。

可通过确定PCR中获得的扩增产物的量而验证由逆转录反应获得的合成cDNA的长度，所述PCR中使用从逆转录反应中使用的引物引发区域下游附近产生不同扩增链长度的不同引物对中的一个引物对，以及逆转录反应后一定量的反应溶液。与逆转录反应中使用不包含冷休克蛋白质的组合物的情况相比，在使用了根据本发明的组合物的情况下，所合成的长链cDNA的量有所增加。

作为模板的RNA是这样的RNA，当引物与其杂交时可用作来自此引物的逆转录反应的模板。根据本发明的组合物包含一种模板或多种具有不同核苷酸序列的不同模板。当使用用于具体模板的特异性引物时，可从核酸混合物中多种的不同模板产生引物延伸产物。多种模板可存在于不同核酸或相同核酸中。

RNA是本发明可应用的一种模板，对其没有特别限制。RNA的实例为样本中所有RNA中的一组RNA分子，如mRNA、tRNA和rRNA的一组RNA分子，或RNA分子的特定组(例如，具有共同核 苷酸序列基序的一组RNA分子，RNA聚合酶的转录物，通过削减方法(subtraction process)浓缩的一组RNA分子),以及能够产生在逆转录反应中使用的引物的任意RNA。

在本发明中，用作模板的RNA可包括在衍生自生物体如细胞、组织或血液的样本，或如可能含有生物体的食物、土壤或废水的样本中。进一步地，RNA可包括在根据常规方法加工这样的样本或诸如此类而获得的包含核酸的制备物中。制备物的实例为均质化细胞，均质化细胞分级所获得的标本，样本中的所有RNA，或一组特定的RNA分子，例如，富含mRNA的标本，等等。

没有特别地限制要在根据本发明的方法中使用的冷休克蛋白质的量。在用20μL反应溶液进行逆转录反应的情况下，优选地，其量为0.5-20μg，更优选地1-10μg，甚至更优选地为2-5μg。

没有特别地限制要在根据本发明的方法中使用的逆转录酶的量。例如，可使用在常规逆转录反应中使用的量。例如，在其中使用衍生自MMLV的逆转录酶和20μL反应溶液的逆转录反应的情况下，反应溶液中逆转录酶的量在考虑cDNA合成效率时优选地为至少10U，更优选地至少100U，甚至更优选地为至少200U。在常规方法中，有必要根据模板RNA的量以及所合成cDNA的长度来调整逆转录酶的量，以避免多余量的逆转录酶产生任何可能的抑制作用，然而这种调整在根据本发明的方法中是不必要的。

本发明的说明书中列举的逆转录酶的活性是基于任何商业可得的逆转录酶的活性。例如，1U是以多聚(rA)·寡聚(dT)_12-18用作引物-模板时在37℃下10分钟之内并入1nmol的[³H]dTTP的活性。

没有特别限制根据本发明的方法中所使用的引物浓度。在逆转录反应中使用了特异性引物的情况下，浓度优选地为至少0.1μM，在逆转录反应中使用寡聚dT引物的情况下，浓度优选地为至少2.5μM，在逆转录反应中使用了随机引物的情况下，浓度优选地为至少5μM，以使从模板RNA合成cDNA最大化。在常规过程中，有必要根据模板RNA的量以及所合成cDNA长度来调整引物的量，以避免逆转录 反应中由引物过量太大所产生的任何可能的抑制作用，然而这种调整在根据本发明的方法中是不必要的。

合适地，根据本发明的cDNA合成方法包括：

A)通过将CspA、逆转录酶、至少一种核糖核苷酸、至少一种引物、和用作模板的RNA混合而制备反应组合物的步骤；以及

B)在适宜于合成与模板RNA互补的引物延伸链的条件下孵育步骤A)中制备的反应组合物。

没有特别限制适宜于合成与模板RNA互补的引物延伸链的条件。温度范围的实例为30℃-65℃，优选地为37-50℃，更优选地为42℃-45℃。优选的反应时间段的实例为5min-120min，更优选地为15min-60min。根据本发明的cDNA合成方法，可以控制或减少将反应溶液置于任何不满足前述温度范围的温度而产生的非-特异性引物延伸链的合成。因此，根据本发明的cDNA合成方法在例如由于处理大量的待检查样品而要求长的时间段以制备反应溶液的cDNA合成中尤其有利。

在进行其中将由根据本发明的方法所获得的cDNA用作模板的核酸扩增反应时，就能够扩增cDNA。没有特别限制核酸扩增反应。其一个优选的实例为聚合酶链式反应(PCR)。

(6)根据本发明的、用于使用逆转录酶的改进的cDNA合成的试剂盒 

根据本发明的试剂盒包含冷休克蛋白质和逆转录酶。根据本发明的试剂盒，可以实现能够达到高反应性的逆转录反应。只要其是为用于逆转录反应而设计的，就不会特别地限制根据本发明的试剂盒。一个优选的实例为用于进行体外逆转录反应的试剂盒。更特定的实例为用于核酸标记的试剂盒、用于RT-PCR的试剂盒、用于cDNA合成的试剂盒、用于引入定点诱变的试剂盒。

除了冷休克蛋白质和逆转录酶之外，根据本发明的试剂盒可包含至少一种引物、至少一种脱氧核糖核苷酸、作为模板的核酸和/或反应缓冲溶液。

关于冷休克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种脱氧核糖核苷酸、作为模板的核酸和/或反应缓冲溶液，其部分或全部可作为混合物包含在试剂盒中，或其各自可作为单一组分分开包含在试剂盒内。

根据本发明的试剂盒可进一步包含用于进行在其中将由逆转录反应所获得的cDNA用作模板的基因扩增(例如，PCR)的试剂。试剂的实例为热-抗性DNA聚合酶、反应缓冲溶液、至少一种脱氧核糖核苷酸、和至少一对引物。

根据本发明的试剂盒中包含的冷休克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种脱氧核糖核苷酸、作为模板的核酸和/或反应缓冲溶液的实例为如先前在上文所提到的。

(7)根据本发明的、用于鉴定内切核糖核酸酶切割-位点的组合物

根据本发明的组合物包含冷休克蛋白质、RNA底物、和内切核糖核酸酶。在确定识别长于三个碱基的特异性序列的内切核糖核酸酶的切割特异性时，关键的是要使用长足以覆盖所有可能的靶标序列的RNA底物；例如，假定RNA含有等量的每种碱基，RNA底物应当长于1024个碱基(＝4⁵)以包含所有可能的五碱基切割位点。优选地，可使用由3569个碱基构成并具有几乎平均的碱基含量(26％G、23％A、26％C和25％U)的噬菌体MS2RNA作为用于确定切割特异性的底物。

然而，在使用这些长RNA作为底物中的主要问题是，尽管其为单链RNA，却形成了极其稳定的二级结构(见图14A)，妨碍了切割。因此，为了使用这些长RNA作为内切核糖核酸酶底物，必须去折叠其二级结构。

本发明采用了冷休克蛋白质以去折叠这些长RNA底物的二级结构。通过去折叠这些二级结构，冷休克蛋白质增加了可切割的RNA的量，因此有助于确定内切核糖核酸酶切割位点。优选地，冷休克蛋白质的浓度为至少.43mM或否则足以完全饱和RNA底物。

mRNA干扰酶为本发明可采用的内切核糖核酸酶的一个实例，但是只要其能够切割单链RNA，就不会特别限制这些内切核糖核酸酶。

(8)根据本发明的、用于鉴定内切核糖核酸酶切割-位点的方法

根据本发明的、用于鉴定内切核糖核酸酶切割-位点的另一个方法包括步骤：

A)制备包含冷休克蛋白质、RNA底物、和内切核糖核酸酶的混合物；以及

B)孵育步骤A)中制备的混合物。

通过本发明的此方法，可确定内切核糖核酸酶的切割特异性。冷休克蛋白质通过阻止RNA中二级结构的形成而增强内切核糖核酸酶对RNA底物的切割。

优选地，将混合物在37℃下孵育15分钟。如实施例17中描述的，可通过引物延伸分析，对切割位点进行体外分析。

(9)根据本发明的、用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的试剂盒

根据本发明的试剂盒包含冷休克蛋白质和RNA底物。根据本发明的试剂盒，可通过将目的内切核糖核酸酶与试剂盒的组分一同孵育而确定内切核糖核酸酶的切割位点。只要其是为用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点而设计的，则不特别地限制根据本发明的试剂盒。

实施例

以下实施例更详细地示例说明本发明，但是并不解释为限制本发明的范围。分别基于各逆转录酶所附的说明书而示出以下实施例中列举的各逆转录酶的活性。

制备实施例 

制备CspA溶液和酶储存缓冲液

根据“S.Chatterjee等人，Journal of Biochemistry(J. Biochem.)，1993，114，663-669”中描述的方法表达并纯化CspA，然后制备2μg/μL CspA溶液(2μg/μL CspA，20mM的Tris-HCl(pH 7.8(4℃)，100mM的NaCl，1mM的EDTA，1mM的DTT，以及50％甘油)，5μg/μL CspA溶液(5μg/μL CspA，20mM的Tris-HCl(pH 7.8(4℃)，100mM的NaCl，1mM的EDTA，1mM的DTT，以及50％甘油)，以及14.8μg/μL CspA溶液(14.8μg/μL CspA，20mM的Tris-HCl(4℃时pH 7.8)，100mM的NaCl，1mM的EDTA，1mM的OTT，以及50％甘油)。

进一步地，制备不包括CspA的酶储存缓冲液(20mM的Tris-HCl(pH 7.8(4℃)，100mM的NaCl，1mM的EDTA，1mM的DTT，以及50％甘油)。

使用前述制备实施例中制备的酶储存缓冲液，作为以下实施例中提到的酶储存缓冲液。使用前述制备实施例中制备的2μg/μL CspA溶液作为实施例6-11中使用的CspA溶液，使用前述制备实施例中制备的5μg/μL CspA溶液作为实施例12-13中使用的CspA溶液，并使用前述制备实施例中制备的14.8μg/μL CspA溶液作为实施例1-5中使用的CspA溶液。

菌株和质粒 

使用大肠杆菌BL21(DE3)进行重组蛋白质表达。从pET-28a(Novagen)构建质粒pET-28a-MazF-mt3和-mt7以分别表达(His)₆MazF-mt3和-mt7。

在大肠杆菌中纯化加(His)₆标签的MazF-mt3和MazF-mt7

使用Ni-NTA树脂(Qiagen)从携带pET-28a-MazF-mt3和MazF-mt7的菌株BL21(DE3)中纯化在N-末端加(His)₆标签的MazF-mt3和MazF-mt7。

实施例1

使用TaKaRa Taq所附的反应缓冲溶液，根据TaKaRa Taq的说明书在冰上制备终体积为25微升的PCR混合物，其含有5ng或50ng 的人基因组DNA(由Clontech Laboratories，Inc.制造)、用于扩增p53基因的2kb DNA片断的正向引物(SEQ ID NO：1)和反向引物(SEQ ID NO：2)各10pmol、0.625U的TaKaRa Taq(Taq DNA聚合酶；由TAKARA BIO INC.制造)。分别向上述混合物中加入2、4、6、8、10、12或14μg的CspA。此外，制备不包含CspA的混合物作为对照。

将这样制备的每种混合物在25℃下孵育30min。然后进行30个循环的PCR，其中的一个循环包括由98℃，10秒－55℃，30秒－72℃，2分钟构成的过程。在反应终止后，在1％的琼脂糖凝胶上电泳3μl的每种样品，并测定每种混合物中扩增产物的长度和量。

如图1中显示的，在不包含CspA的混合物中没有发现长度为2kb的产物，并且观察到了由于非-特异性扩增产生的多种长度的产物。相反，分别在含有4-14μg CspA的混合物中清楚地观察到2kb产物。在含有6-14μg CspA的混合物中产物的量比其他混合物中大。结果证明了CspA减少了由在PCR前将混合物置于室温产生的非-特异性扩增。

实施例2

进一步地，进行与实施例1中所描述的相同的实验，除了DNA聚合酶由TaKaRa Taq换成了TaKaRa Ex Taq(用于LA-PCR的DNA聚合酶混合物：由TAKARA BIO INC.制造)。使用用于LA-PCR的DNA聚合酶混合物得到基本上相同的结果。在含有6μg CspA或更多的混合物中观察到产物的量有所增加(见图2)。

实施例3

使用Pyrobest DNA聚合酶所附的反应缓冲溶液，根据Pyrobest DNA聚合酶的说明书在冰上制备终体积为25μl的PCR混合物，其含有5ng或50ng的人基因组DNA(由Clontech Laboratories，Inc.制造)、用于扩增p53基因的2kb DNA片断的正向引物(SEQ ID NO：1)和反向引物(SEQ ID NO：2)各10pmol、0.625U的Pyrobest DNA聚 合酶(α-型DNA聚合酶；由TAKARA BIO INC.制造)。分别向上述混合物中加入0.5、1、2、4、6、8、10、12或14μg的CspA。此外，制备不包含CspA的混合物作为对照。

将这样制备的每种混合物在25℃下孵育30min。然后进行30个循环的PCR，其中的一个循环包括由98℃，10秒－60℃，30秒－72℃，2分钟构成的过程。在反应终止后，在1％的琼脂糖凝胶上电泳3μg的每种样品，并测定每种混合物中扩增产物的长度和量。结果显示于图3。

在不包含CspA的混合物中，除了长度为2kb的产物之外还观察到显著量的多种长度的产物。在含有2μg CspA或更多的混合物中，观察到的无CspA时的非-特异性扩增有所减少，2kb产物的量有所增加。

结果显示，CspA还减少了使用α-型DNA聚合酶的PCR中的非-特异性扩增。

实施例4

使用TaKaRa ExTaq所附的反应缓冲溶液，根据TaKaRa ExTaq的说明书在冰上制备终体积为25μg的PCR混合物，其分别含有50ng的人基因组DNA，0.625U的TaKaRa ExTaq，10μg的CspA以及用于扩增TP53基因的575bp片断的引物对(SEQ ID NO：3和4)、用于扩增Bcl2基因的591bp片断的引物对(SEQ ID NO：5和6)、用于扩增EGFR基因的521bp片断的引物对(SEQ ID NO：7和8)、用于扩增CDK9基因的380bp片断的引物对(SEQ ID NO：9和10)、用于扩增FFAR2基因的1010bp片断的引物对(SEQ ID NO：11和12)、用于扩增IRS1基因的520bp片断的引物对(SEQ ID NO：13和14)或用于扩增GAP基因的460bp片断的引物对(SEQ ID NO：15和16)的引物对。此外，制备不包含CspA的混合物作为对照。

将这样制备的每种混合物在两种不同条件下进行30个循环的PCR。在条件1下，一个循环包括由98℃，10秒－53℃，30秒－72℃， 30秒构成的过程。在条件2下，一个循环包括由98℃，10秒－60℃，30秒－72℃，30秒构成的过程。在反应终止后，在1％的琼脂糖凝胶上电泳3μg的10种样品的每种，并分析混合物中的扩增产物。

以上反应中使用的所有引物具有超过70℃的Tm值，因此，它们倾向于引起非-特异性扩增。事实上，在没有CspA时，条件1下扩增的特异性显著低。然而，在有CspA存在时，在条件1和2下扩增的各种混合物中只观察到所期待的产物(见图4)。

结果显示，CspA具有增加PCR扩增的特异性的能力，并可扩大用于核酸特异性扩增的退火温度的范围。

实施例5

制备两等份含有10μg/mlCspA的溶液，其中一份在98℃下处理5分钟。制备具有与实施例4中显示的相同组成，但含有10μg如此制备的热-处理或非热-处理的CspA的PCR混合物。在条件1下将每种如此制备的混合物进行30个循环的PCR。在反应终止后检查各种混合物中扩增产物时，在热-处理和非热-处理CspA之间没有观察到差异。结果显示于图5。此结果表示CspA的高的热稳定性。

实施例6

证实使用寡聚dT作为引物的逆转录反应中，来自PolyA以外的非-特异性延伸产物(背景)的量。

在冰上使用PrimeScript(注册商标)RTase(由TAKARA BIO INC.制造)制备用于合成cDNA的20μL逆转录反应溶液，其中使用1μg的人心脏总RNA(由Clontech制造)作为模板，以及寡聚dT(终浓度2.5μM)。除了PrimeScript(注册商标)RTase所附的说明书中列举的逆转录反应溶液组成之外，然后在所制备的逆转录反应组合物中包括2μg CspA。作为对照，还制备了不包含CspA的逆转录反应溶液，其中加入了1μL的酶储存缓冲液以代替CspA。下一步，将这些这样制备的逆转录反应溶液置于冰上0-20分钟，此后加热到95℃以 灭活逆转录酶。然后，为确定置于冰上0-20分钟的每种溶液产生的cDNA的量，用2μL各反应溶液进行实时PCR，靶标是距离肌营养不良蛋白基因(GenBank登记号NM_004006)的PolyA大约7kb远的区域的139个碱基(6529-6667)的链，以及PolyA附近长度为6,930个碱基(6529-13458)的链。

使用SYBR(注册商标)Premix Ex Taq(由TAKARABIO INC.制造)，根据其附的说明书中推荐的条件进行靶向139个碱基的实时PCR，其中使用具有SEQ ID NO：17中所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：18中所示核苷酸序列的引物作为引物。使用PrimeSTAR(注册商标)GXL(由TAKARABIO INC.制造)和SYBR(注册商标)Green I(由TAKARABIO INC.制造)，进行靶向6,930个碱基的长链实时PCR，其中使用具有SEQ ID NO：17中所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：19中所示核苷酸序列的引物作为引物。根据PrimeSTAR(注册商标)GXL所附说明书中列举的高速PCR操作流程的反应溶液组成来制备实时PCR的反应溶液，除了加入SYBR(注册商标)Green I使得终浓度为x 0.33。进一步地，在98℃下孵育10秒之后进行实时PCR，条件为40个循环，其中98℃5秒－68℃2分钟组成一个循环。在此说明书的任何逆转录实施例中，使用Thermal Cycler Dice(注册商标)Real time system TP 800(由TAKARABIO INC.制造)进行实时PCR。进一步地，通过序列稀释质粒的方式产生标准曲线，其中将包含前述区域的13,542个碱基(173-13714)的cDNA克隆于pUC118的HincII位点。

因此，不管CspA在逆转录反应中的存在或不存在，都没有检测到来自PolyA附近的6,930个碱基的长链cDNA产物。当将溶液置于冰上更久时，在不包含CspA的溶液中距离PolyA大约7kb远的区域中139bp cDNA的量有所增加。在包含CspA的逆转录溶液的情况下，相同区域中cDNA的量几乎没有增加，并且置于冰上20分钟的溶液中合成的cDNA的量为不包含CspA的反应溶液的1/40(图6)。由于未发现来自PolyA附近的6,930个碱基的长链cDNA产物，表示在 冰上制备并放置逆转录反应溶液时，距离PolyA大约7kb远的区域中139bp的cDNA产物不是延伸自PolyA的产物，而是来自PolyA以外的非-特异性延伸产物。这种非-特异性衍生产物可为获得具有全长的cDNA中的背景。非-特异性延伸产物抑制从RNA的PolyA到5’末端的延伸反应，并且增加不具有全长的cDNA合成产物。

在本实施例中，证实了在冰上制备并放置逆转录反应溶液时，逆转录反应溶液中的CspA可几乎完全抑制来自不同于PolyA的非-特异性延伸产物(背景)的合成。

实施例7

证实使用寡聚dT作为引物的逆转录反应中，来自PolyA以外的非-特异性延伸产物(背景)的量

根据类似于实施例6的方法确定CspA的作用，除了使用SuperScript III RTase(由Invitrogen Corporation制造)根据其所附的说明书代替了PrimeScript(注册商标)RTase，制备包含2μg CspA的20μL逆转录反应溶液和不包含CspA的20μL逆转录反应溶液。SuperScript III RTase为衍生自MMLV的逆转录酶的变体。

结果是，在SuperScript III RTase用作逆转录酶的情况下，不管CspA存在或不存在，都未检测到来自PolyA附近的6,930个碱基的长链cDNA产物。当将溶液置于冰上更久时，距离PolyA大约7kb远的区域中139bp的合成cDNA的量在不包含CspA的溶液中有所增加。在包含CspA的逆转录溶液的情况下，相同区域中的cDNA的量几乎没有增加，并且置于冰上20分钟的溶液中合成的cDNA的量为不包含CspA的反应溶液的1/87(图7)。因此，证实了在冰上制备并放置逆转录反应溶液时，尽管使用了SuperScript III RTase作为逆转录酶，逆转录反应溶液中的CspA可几乎完全抑制来自不同于PolyA的非-特异性延伸产物(背景)的合成。

实施例8

证实在使用寡聚dT作为引物的逆转录反应中，来自PolyA以外的非-特异性延伸产物(背景)的量

根据类似于实施例6的方法确定CspA的作用，除了使用Reverse Transcriptase XL(AMV)(由TAKARABIO INC.制造)代替了PrimeScript(注册商标)RTase制备包含1μL的1μg/μL人心脏总RNA(由Clontech制造)、1μL的50μM寡聚dT、1.6μL各2.5mM的dNTP混合物、2μL的Reverse Transcriptase XL(AMV)缓冲液、0.5μL的40U/μL核酸酶抑制剂、0.8μL的25U/μL Reverse Transcriptase XL(AMV)以及1μL的2μg/μL CspA的20μL逆转录反应溶液和不包含CspA的20μL逆转录反应溶液。逆转录酶XL(AMV)为衍生自AMV的逆转录酶。

结果是，在Reverse Transcriptase XL(AMV)用作逆转录酶的情况下，不管反应溶液中CspA存在或不存在，都未检测到来自PolyA附近的6,930个碱基的长链cDNA产物。当将溶液置于冰上更久时，距离PolyA大约7kb远的区域中139bp的cDNA的量在不包含CspA的溶液中有所增加。在包含CspA的逆转录溶液的情况下，相同区域内中的cDNA的量几乎没有增加，并且置于冰上20分钟的溶液中合成的cDNA的量为不包含CspA的反应溶液的1/84(图8)。因此，证实了在冰上制备并放置逆转录反应溶液时，尽管使用了衍生自AMV的逆转录酶，逆转录反应溶液中的CspA可几乎完全抑制来自PolyA以外的非-特异性延伸产物(背景)的合成。

实施例9

在使用寡聚dT作为引物的逆转录反应中，对长链cDNA合成反应的抑制

根据类似于实施例1的方法，使用PrimeScript(注册商标)RTase(由TAKARABIO INC.制造)制备包含2μg CspA的20μL逆转录反应溶液以及不包含CspA的20μL逆转录反应溶液。将所制备的溶液置于冰上0-20分钟，并在42℃下进行逆转录反应30分钟，然后在95℃ 加热5分钟，然后停止反应。根据类似于实施例6的方法，将2μL的分别的反应溶液进行靶向来自肌营养不良蛋白基因的PolyA附近的6,930个碱基的长链的实时PCR，这样对从逆转录反应合成的cDNA的量进行定量。

结果是，在不包含CspA的反应溶液中，与完全没有将溶液置于冰上相比，在溶液置于冰上20分钟的情况下来自PolyA附近的6,930个碱基的长链延伸产物的量减少到52％。在包含CspA的反应溶液中，尽管将其置于冰上20分钟，所合成的cDNA的量却完全没有减少(图9)。看起来是因为反应溶液中CspA几乎完全抑制了来自PolyA以外的非-特异性延伸反应，所以获得了CspA的作用，而且PolyA没有抑制延伸反应。

从获得的结果中证实了反应溶液中CspA使得对反应溶液制备后对逆转录反应必要的时间量的关注变得不必要，并可实现达到了高质量的cDNA合成反应，其中来自PolyA的cDNA合成的背景很少，而且非常可能具有全长。

实施例10

在其中使用寡聚dT作为引物的逆转录反应中，对长链cDNA合成反应的抑制2

根据类似于实施例9的方法进行测试，除了根据SuperScript III RTase所附的说明书使用SuperScript III RTase(由Invitrogen Corporation制造)代替PrimeScript(注册商标)RTase，制备包括2μg CspA的20μL逆转录反应溶液和不包括CspA的20μL逆转录反应溶液，在50℃下进行30分钟的逆转录反应，在70℃下对溶液加热15分钟，然后停止反应。对由逆转录反应合成的cDNA的量进行定量以证实CspA的作用。

结果是，在不包含CspA的反应溶液中，与完全没有将溶液置于冰上相比，在溶液置于冰上20分钟的情况下来自PolyA附近的长链延伸产物的量减少到11％。在包含CspA的反应溶液中，尽管将其置 于冰上20分钟，但与完全没有将溶液置于冰上相比，所合成的cDNA的量是80％(图10)。尽管使用SuperScript III RTase作为逆转录酶，证实了CspA可抑制对由在冰上制备并放置逆转录反应溶液产生的来自PolyA的长链cDNA合成反应的抑制。

实施例11

在其中使用寡聚dT作为引物的逆转录反应中，对长链cDNA合成反应的抑制

根据类似于实施例9的方法进行测试，除了使用Reverse Transcriptase XL(AMV)(由TAKARABIO INC.制造)代替了PrimeScript(注册商标)RTase制备包含1μL的1μg/μL人心脏总RNA(由Clontech制造)、1μL的50μM寡聚dT、1.6μL各2.5mM的dNTP混合物、2μL的Reverse Transcriptase XL(AMV)缓冲液、0.5μL的40U/μL Ribonuclease Inhibitor、0.8μL的25U/μL Reverse Transcriptase XL(AMV)以及1μL的2μg/μL CspA的20μL逆转录反应溶液和不包含CspA的20μL逆转录反应溶液。对逆转录反应合成的cDNA的量进行定量以证实CspA的作用。

结果是，在不包含CspA的反应溶液中，与完全没有将溶液置于冰上相比，在溶液置于冰上20分钟的情况下来自PolyA附近的长链延伸产物的量减少到33％。在包含CspA的反应溶液中，尽管将其置于冰上20分钟，与完全没有将溶液置于冰上相比，所合成的cDNA的量为75％(图11)。尽管使用衍生自AMV的逆转录酶作为逆转录酶，证实了CspA可抑制对由制备逆转录反应溶液产生的来自PolyA的长链cDNA合成反应的抑制。

实施例12

CspA对使用天然RNA作为模板的逆转录反应发挥的作用

用酶储存缓冲液稀释制备实施例中所制备的5μg/μL的CspA溶液以制备0.2μg/μL的CspA溶液、1μg/μL的CspA溶液和2μg/μL的CspA 溶液。下一步，以这样的方式分别制备总体积为10μL的各种混合物：将1μL的酶储存缓冲液，0.2μg/μL的CspA溶液，1μg/μL的CspA溶液、2μg/μL的CspA溶液或5μg/μL的CspA溶液分别加至1μL的1μg/μL人心脏总RNA(由Clontech制造)，1μL的50μM寡聚dT，1μL的各10mM的dNTP混合物，以及6μL的灭菌蒸馏水。关于不包含CspA并使用酶储存缓冲液制备的混合物，制备两种不同的混合物。这样的混合物之一进行RNA变性步骤，在65℃下五分钟，另一种不进行此步骤。对于包含CspA的混合物不进行RNA变性步骤。

将4μL包含于PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒(由TAKARABIO INC.制造)中的5x PrimeScript Buffer、0.5μL的40U/μL Ribonuclease Inhibitor、0.5μL的200U/μL PrimeScript RTase、和5μL的灭菌蒸馏水加至10μL的这些混合物中，以制备总共为20μL的反应溶液。然后将反应溶液进行逆转录反应，在42℃下30分钟，并在95℃下加热五分钟以停止反应。下一步，将2.5μL的这些反应溶液进行靶向肌营养不良蛋白基因中大约8kb的区域的PCR。将TaKaRa LA Taq(注册商标)热启动版本(由TAKARABIO INC.制造)用作PCR，并且以其所附的说明书中列举的反应组合物进行反应。作为引物使用的是具有SEQ ID NO:20中所示核苷酸序列的引物以及具有SEQ ID NO:21中所示核苷酸序列的引物。在PCR反应溶液中各种引物的浓度为200nM。进一步地，PCR由TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(注册商标)(由TAKARABIO INC.制造)在这样的条件下进行：30个循环，其中98℃10秒-68℃8分钟构成一个循环。在PCR反应完成后，将3μL的反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以证实扩增产物的链长度和量。根据证实的结果，估计所合成的cDNA的量以及每个逆转录反应中反应的特异性(图12)。

结果是，PCR后进行的分析显示在其中天然RNA用作模板的逆转录反应的反应溶液中包括CspA的情况下，扩增的大约8kb的长链cDNA的量有极大提高，而靶标以外的所扩增的DNA量有所减少(图12)。由结果显示，当将CspA加入反应溶液中时，可以以高效力及 高特异性进行cDNA合成，这使得RNA变性步骤不必要了。

实施例13

CspA对1-步RT-PCR发挥的作用

靶向肌营养不良蛋白质基因中大约2kb的区域的1-步RT-PCR，其中将5ng或50ng的人心脏总RNA(由Clontech制造)用作模板，使用PrimeScript(注册商标)One Step RT-PCR试剂盒(由TAKARABIO INC.制造)进行反应。使用具有SEQ ID NO：21中所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：22中所示核苷酸序列的引物作为引物。关于1-步RT-PCR中使用的溶液组成，将5μg CspA加至25μL的反应溶液，在PrimeScript(注册商标)One Step RT-PCR试剂盒所附的说明书中列举了此溶液的组成。进一步地，还制备了向其中加入了1μL酶储存缓冲液代替5μg CspA的不包含CspA的反应溶液，以及向其中加入了1μL单链DNA结合蛋白质(SSB)溶液(由USB公司制造)(5μg/μL SSB、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、200mM NaCl，0.1mM EDTA、1mM DTT、50％甘油)代替5μg CspA的反应溶液。对这些反应溶液进行逆转录反应，在42℃下30分钟，并在94℃下加热两分钟，然后使用TaKaRa PCR Thermal Cycler dice(注册商标)对其进行PCR反应，条件为30个循环，其中94℃30秒-55℃30秒-72℃2分钟构成一个循环。在反应完成后，对3μL的反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳以分析反应产物(图13)。

结果是，在含有CspA的溶液中除大约2kb的靶标大小以外的任何大小的非-特异性扩增产物有明显的减少。在加入SSB时，没有获得靶标大小的扩增产物。

实施例14

CspA在RT-PCR反应中改进反应的产量和特异性的作用

使用人心脏RNA作为用于反应的模板，RT-PCR靶标为肌营养不良蛋白2。PrimeScript RTase、RNase抑制剂、ExTaq HS或 PrimeStar Max、寡聚核苷酸的存在下进行反应。在有CspA或没有CspA时进行复制反应。还测试了不同温度如42℃或50℃。观察到在CspA存在下，非-特异性产物有所减少，而且随着CspA量的提高(多至2.5μg CspA每10μl反应)产物的产量有所改进。在更高的温度如42℃和50℃下CspA也是有活性的。发现有CspA的结果可与其中用热处理对RNA中二级结构去稳定化的反应相比较。

实施例15

使用Ni-氨三乙酸树脂纯化从pET-28a-MazF-mt3表达的(His)₆MazF-mt3蛋白质。当在不存在CspA时将纯化的MazF-mt3与MS2RNA一同孵育时，观察到RNA的部分切割(泳道3)(图14B)。随着增加量的CspA蛋白质加入反应混合物中，MS2 RNA底物的切割有所增强(泳道4-6)。在最高浓度的CspA下，没有检测到全长的MS2RNA(泳道6)。该浓度(0.86mM)是RNA结合的CspA的Kd值32倍高，表示CspA几乎完全饱和了MS2RNA，CspA结合RNA的每六个碱基。这些结果还证明了MazF-mt3是能够切割单链RNA的mRNA干扰酶，所述是单链RNA在CspA去折叠MS2二级结构时产生的。

实施例15

MazF-mt3在CUCCU和UUCCU处特异性切割RNA

在0.43mM CspA的存在下，使用反应混合物进行引物延伸实验以确定MazF-mt3在MS2RNA中的切割位点。为了覆盖整个MS2RNA序列，合成了总共22条引物用于引物延伸实验。如图15A-H所示，在大多数情况下加入CspA显著地增强了RNA的切割。值得注意地，只有在CspA存在下才可检测到对于图15F中所示切割位点的RNA切割。看上去在CspA存在下，碱基1028(图15B)处的RNA的切割有所减少，这是由于碱基1028的切割位点紧邻的下游的碱基1078位点切割的增强，所述切割位点位于引物结合位点和上游切割位 点之间。在图15C中显示了在CspA存在下碱基1078处的该高度增强的切割位点。通过这些实验，鉴定了八个切割位点，如表2中列出的。这些切割位点的共有序列为CUCCU，其中MazF-mt3在二号位置的U残基与三号位置的C残基之间进行切割。尽管我们鉴定了八个MazF-mt3切割位点，根据发表的MS2序列(NCBI网站)的MS2 RNA中有九个CUCCU序列。我们因此重新测序含有第九个CUCCU序列的区域，发现此区域中没有CUCCU序列。这些实验中使用的MS2 RNA(Roche)含有CCUCU(碱基2158-碱基2162)代替了CUCCU。因此，MazF-mt3切割了MS2 RNA中所有的CUCCU序列。

如图16A-D中显示的，检测到了与图15中发现的那些不同的四种其他的切割位点。来自这些引物延伸实验的共有序列为UUCCU，其中MazF-mt3在二号位置的U残基与三号位置的C残基之间进行切割。在MS2RNA中有五个UUCCU序列，这些都由RNA序列证实。图1A中用箭头显示了所有MazF-mt3的切割位点。 

实施例16

MazF-mt7还是一种序列-特异性mRNA干扰酶

用本文描述的MS2RNA-CspA系统鉴定MazF-mt7的特异性切割位点。使用纯化的N-端加His标签的MazF-mt7进行引物延伸实验，结果显示于图17A-R，并且总结于表3中。大多数切割位点含有序列UCGCU(图17A-K)，其中MazF-mt7在第一个U和第二个C之间进行切割。切割位点中有一些具有共有UCGCU的一碱基错配(图17C、D、H和L-P)，少数切割位点有二-碱基错配(图17G、N、Q、R)。然而，所有这些切割位点共享中央的G残基，并且其中大多数还具有紧跟着中央G残基的C残基。因此发现MazF-mt7为mRNA干扰酶，其识别五-碱基的U·CGCU序列；然而其似乎不如MazF-mt3严格。

实施例17

体外引物延伸分析

为进行体外的mRNA切割位点的引物延伸分析，使用或不使用纯化的毒素蛋白质(MazF-mt3或MazF-mt7)，并且使用或不使用纯化的CspA蛋白质，在37℃下部分消化全长的MS2mRNA以15min。消化反应混合物(10μl)由0.8μg的MS2RNA底物、0.0625μg的MazF-mt3(His)₆或MazF-mt7(His)₆、321μg CspA和10mM Tris-HCl(pH 7.8)中0.5μl的RNase抑制剂(Roche)构成。在20μl反应混合物中，在47℃进行引物延伸1小时。通过加入12μl的序列加样缓冲液(95％甲酰胺、20mM EDTA、0.05％溴酚蓝、和0.05％的二甲苯蓝EF)停止反应。在6％聚丙烯酰胺和36％尿素胶上进行电泳之前，将样品在90℃下孵育5min。用于MS2mRNA的引物延伸分析的引物列于表1中。使用T4多聚核苷酸激酶，用[·-³²P]ATP对引物进行5’标记。

表1：引物延伸中使用的引物

表2：MS2RNA中MazF-mt3的切割位点

a：表中的数字代表的MS2RNA的碱基数量 

表3：MS2RNA中的MazF-mt7的切割位点

*：共有序列