一种灭螺细菌及其制备生物灭螺剂的方法

摘要

本发明公开了一种灭螺细菌及其制备生物灭螺剂的方法，所述灭螺细菌Enterobacter cloacae，B2，其生物保藏号为CCTCC M 2014103，该灭螺细菌CCTCC M 2014103为阴沟肠杆菌，是从柏树枝叶中筛选获得的，能够快速有效地杀灭钉螺。与现有微生物相比较，本发明提供了一种可以杀灭钉螺的细菌，可以直接作为生物灭螺剂使用，用该灭螺细菌CCTCC M 2014103制备的生物灭螺剂与传统化学灭螺剂相比，制备方法简单，成本低，对环境友好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物，尤其涉及一种灭螺细菌及其制备生物灭螺剂的方法。

背景技术

钉螺作为血吸虫唯一的中间宿主，其繁衍和分布与血吸虫病的流行传播密切相关，所以抑螺灭螺被认为是阻止血吸虫病传播的重要途径。目前主要的灭螺剂是化学药物类，这类药物容易对环境造成不可逆破坏。近年来植物内微生物群落结构得到广泛的关注和研究，国内外学者经过研究发现植物体内存在大量的微生物，这些微生物在动物的生长、发育、健康等方面都起到重要作用，因此，本发明将研究的方向对准了植物内的微生物群落，希望能找到一种选择性强、对环境影响较小的生物灭螺剂，以替代传统化学灭螺剂，保护环境。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种解决上述问题，选择性强、对环境影响较小的灭螺细菌及其制备生物灭螺剂的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种灭螺细菌，分类命名为Enterobacter cloacae B2，所述灭螺细菌的生物保藏号为CCTCC M 2014103，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏日期为2014 年3月26日； 

一种构建CCTCC M 2014103的方法，所述方法包括以下步骤：

a.培养基的制备：

1)YEB液体培养基：牛肉浸膏为5.0g/L，酵母膏为1.0g/L，蛋白胨为5.0g/L，MgSO4·7H2O为4g/L，蔗糖为5.0g/L，pH7.0～7.5；

2)YEB固体培养基：将上述YEB液体培养基中加入15g/L的琼脂；

b.进行筛选： 

1)在无菌条件下，取新鲜柏树枝叶，用体积分数为75％的酒精浸泡1分钟，0.1％升汞浸泡12分钟，无菌生理盐水冲洗3遍后，将柏树枝叶研磨，获得组织碎末；

2)将上一步骤的组织碎末接种到100mL的YEB液体培养基中，37℃培养12～16小时，培养的转速为180rpm，获得培养液；

3)按体积计，将上一步骤的培养液用无菌生理盐水依次稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7，获得稀释液；

4)将上一步骤的稀释液涂于YEB固体培养基上，37℃培养12～16小时，挑取单菌落进行纯化，即获得所述灭螺细菌CCTCC M 2014103；

c.获取PCR扩增产物并检测；

作为优选，步骤c中，将上述纯化后的灭螺细菌CCTCC M 2014103接种到YEB固体培养基上，37℃培养12～16小时，挑取单菌落进行菌落PCR，所述菌落PCR的引物为细菌16SrRNA通用引物27F和R518，所述引物的序列为：

SEQ NO.2：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

SEQ NO.3：R518：ATTACCGCGGCTGCTGG；

所述菌落PCR的扩增程序为：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，55℃退 火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，72℃继续延伸7分钟，获得PCR扩增产物；

一种灭螺细菌制备生物灭螺剂的方法，

1)灭螺剂的制备 

将灭螺细菌CCTCC M 2014103接种于100mL的YEB液体培养基中，37℃下培养24小时，培养的转速为180rpm，得到种子液，将1mL种子液转移到100mL的YEB液体培养基中，37℃培养12～16小时，培养的转速为180rpm，获得发酵液，即为生物灭螺剂；

2)灭螺剂稀释液的配制

将灭螺剂用去氯水配制成体积分数为10％的溶液，即为灭螺剂稀释液。

与现有技术相比，本发明的优点在于：该灭螺细菌CCTCC M 2014103是从柏树枝叶中筛选获得的，能够作为生物灭螺剂快速有效地杀灭钉螺，可直接作为生物灭螺剂使用，用该灭螺细菌CCTCC M 2014103制备的生物灭螺剂与传统化学灭螺剂相比，制备方法简单，成本低，对环境友好。

具体实施方式

下面将对本发明作进一步说明。

实施例：一种灭螺细菌，Enterobacter cloacae，B2，所述灭螺细菌的生物保藏号为CCTCC M 2014103，为阴沟肠杆菌。

本发明的灭螺细菌CCTCC M 2014103是从柏树枝叶中筛选获得的，其生物学特征如下：

(1)形态学特征：该细菌革兰氏染色为阴性，在光学显微镜16×100油镜 下观察该细菌呈粗短杆状。

(2)培养特征：在YEB固体培养基中生长良好，菌落圆润，初期呈白色半透明，后期呈淡黄色，菌落大而湿润呈黏液状。

所述灭螺细菌CCTCC M 2014103的16SrRNA序列如SEQ ID NO.1所示，其中所述16srRNA序列有462个碱基，将序列输入GenBank数据库中进行BLAST比对处理，结果发现，该16srRNA序列与阴沟肠杆菌S9(Enterobacter cloacae，S9)的16srRNA序列(GenBank登录号：HG421017.1)同源性为99％，结合形态学特征和培养特征鉴定该灭螺细菌CCTCC M 2014103为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。

灭螺细菌CCTCC M 2014103菌株的筛选：

1、培养基的配制：

1)YEB液体培养基：牛肉浸膏为5.0g/L，酵母膏为1.0g/L，蛋白胨为5.0g/L，MgSO4·7H20为4g/L，蔗糖为5.0g/L，pH7.0～7.5；

2)YEB固体培养基：将上述YEB液体培养基中加入15g/L的琼脂。

2、筛选步骤： 

1)在无菌条件下，取新鲜柏树枝叶，用体积分数为75％的酒精浸泡1分钟，0.1％升汞浸泡12分钟，无菌生理盐水冲洗3遍后，将柏树枝叶研磨，获得组织碎末；

2)将步骤1)的组织碎末接种到100mL的YEB液体培养基中，37℃培养12～16小时，培养的转速为180rpm，获得培养液；

3)按体积计，将步骤2)的培养液用无菌生理盐水依次稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7，获得稀释液；

4)将步骤3)的稀释液涂于YEB固体培养基上，37℃培养12～16小时，挑 取单菌落进行纯化，即获得所述灭螺细菌CCTCC M 2014103。

3、获取PCR扩增产物并检测：

将上述纯化后的灭螺细菌CCTCC M 2014103接种到YEB固体培养基上，37℃培养12～16小时，挑取单菌落进行菌落PCR，所述菌落PCR的引物为细菌16SrRNA通用引物27F和R518，所述引物的序列为：

SEQ NO.2：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

SEQ NO.3：R518：ATTACCGCGGCTGCTGG

所述菌落PCR的扩增程序为：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，72℃继续延伸7分钟，获得PCR扩增产物； 

将PCR扩增产物用质量分数为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，用PCR纯化试剂盒进行纯化，获得灭螺细菌CCTCC M 2014103的16SrRNA，将16srRNA送至测序公司测序，结果如SEQ ID NO.1所示，将16SrRNA序列输入GenBank数据库，用BLAST软件进行比对处理，结果发现，该16srRNA序列与阴沟肠杆菌S9(Enterobacter cloacae，S9)的16srRNA序列(GenBank登录号：HG421017.1)同源性为99％，结合形态学特征和培养特征鉴定该灭螺细菌CCTCC M 2014103为阴沟肠杆菌。

所述灭螺细菌CCTCC M 2014103灭螺剂的制备及灭螺活性的测定：

1、灭螺剂的制备：

将灭螺细菌CCTCC M 2014103接种于100mL的YEB液体培养基中，37℃下培养24小时，培养的转速为180rpm，得到种子液，将1mL种子液转移到100mL的YEB液体培养基中，37℃培养12～16小时，培养的转速为180rpm，获得发酵 液，即为生物灭螺剂。

2、灭螺剂稀释液的配制：将灭螺剂用去氯水配制成体积分数为10％的溶液，即为灭螺剂稀释液。

3、灭螺活性的测定：

将野外采集的钉螺在25℃下培养3天后，选择活力好的钉螺用去氯水冲洗3遍，将钉螺分成三组，每组三袋，每袋20只钉螺，每组选择一袋置于配置好的灭螺剂稀释液中分别浸泡2天，3天，4天，取出后用去氯水冲洗干净，室温恢复饲养3天，清水浸泡2小时，取出观察钉螺有无软体伸出，若有软体伸出则为活钉螺，无软体伸出的用敲击法敲击钉螺壳体，判断死活，同时设置去氯水为阴性对照组。

4、结果：

灭螺细菌CCTCC M 2014103的灭螺活性测定结果如下表1所示：

表1：灭螺细菌CCTCC M 2014103的灭螺活性测定结果表

从表1中可以看出，该灭螺细菌CCTCC M 2014103杀灭钉螺的效率随着时间的增加而增加，在处理2天的情况下，钉螺的平均死亡率为55％，在处理3天的情况下，钉螺的平均死亡率达到了83.33％，在处理4天的情况下，钉螺的平均死亡率达到了95％，可以看出，该灭螺细菌CCTCC M 2014103具有很好的杀灭钉螺的效果，其杀灭钉螺的效率随着时间的延长而增加。

以上对本发明所提供的一种灭螺细菌及其制备生物灭螺剂的方法进行了详尽介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，对本发明的变更和改进将是可能的，而不会超出附加权利要求所规定的构思和范围，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。