特异性调控下丘脑中间神经元活性的光照调控组合物及其应用

摘要

本发明提供了一种特异性调控下丘脑中间神经元活性的光照调控组合物及其应用，通过光感基因调控技术特异性调控下丘脑中间神经元活性以影响焦虑行为。一种特异性调控下丘脑中间神经元活性的光照调控组合物，该组合物包括：用于感染中间神经元细胞或其前体细胞的携带光感基因的病毒载体；该载体中包括启动子、光感基因、绿色荧光标记基因，其中，所述启动子为VGAT启动子；能产生蓝光的光照装置，用于对感染后的中间神经元细胞或其前体细胞进行光照调控以改变其活性。本发明的技术可以精确地特异性调控下丘脑的中间神经元，可以有效的影响焦虑样行为。

说明书

技术领域

本发明涉及一种特异性调控下丘脑中间神经元活性的光照调控组合物及其应用， 通过光感基因调控技术特异性调控下丘脑中间神经元活性以影响焦虑行为。

背景技术

在我国一些大中城市，随着经济的发展，行业竞争越来越激烈，导致居民精神疾 病总患病率升高，以深圳为例，居民精神疾病总患病率已达21.19％，高居全国首位， 且在疾病总负担中已高居首位，超过了恶性肿瘤、心脑血管等疾病。精神疾病中抑郁 症发病率逐渐上升，目前深圳市抑郁病患者不少于10万人；同时精神分裂症发病率 居高不下，多发生于青壮年。焦虑症是高速发展社会下人们常见的情感障碍，多在压 力下产生，如果焦虑处理不当将会严重影响人们的工作学习，也给社会造成严重的经 济负担。焦虑样情感的产生多和大脑异常的神经活动相关，目前已有研究表明情感功 能障碍在发病机制上多由相关脑区和神经核团中神经元的异常放电和功能活动改变 导致，兴奋性神经元在执行功能方面受到中间神经元的调节。

中间神经元(interneuron)是大脑中非常重要的一类神经元，包括parvalbumin神经 元、somatostatin神经元等若干亚类，对于调控兴奋性神经元活性和功能发挥重要作 用，也在下丘脑的发育成熟和执行功能过程中扮演重要角色。中间神经元是近年来科 学研究的热点，其功能异常已被发现与多种情感功能障碍相关，如抑郁、自闭症和焦 虑样行为等。对中间神经元进行特异性调控，对于情感功能障碍发病机制的研究、实 现真正治疗等具有重要意义。

目前对下丘脑中间神经元进行的调控的主要手段是通过基因操作或化学药物的 方法来实现。化学药物的方法缺乏空间和组织的特异性，在调控中间神经元的同时也 会刺激到其他正常细胞，如兴奋性神经元、胶质细胞等，这样会导致一些对正常细胞 不利的副作用或损伤作用；另外通过基因敲入或敲除后，对中间神经元的调控在时间 上不具有精确的可操控性。

光感基因调控技术是近几年快速发展的一种新兴技术，其原理是基于基因治疗的 方法给哺乳动物细胞转入不同的对光敏感的基因，通过不同波长的光对特定细胞类型 活性进行调控。Channelrhodopsin-2(ChR2)编码阳离子通道蛋白，493nm波长的蓝光 光照后使阳离子进入细胞，而兴奋细胞活性。另外halorhodopsin(NpHR)编码氯离子 泵，592nm的黄光可以使带有负电荷的氯离子进入细胞而抑制细胞的活性；在Volvox  carteri(团藻)中分离的新光感蛋白VChR1的激发波长为589nm，使光调控的波长进行 红移，可以方便结合钙离子成像技术应用；ChETA把ChR2的E123突变为苏氨酸或 丙氨酸，提高了对频率较高的光照的敏感性和稳定性；利用光感基因ChETA的电传 导性和快速动力学特性，不仅可以实现通过光来诱导神经元产生动作电位；还可以调 控神经系统的兴奋性和突触的传递性。

然而，目前并没有利用光感基因调控技术对中间神经元进行特异性调控的研究报 道。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种能够特异性调控下丘脑中间神经元活性的技术。

为实现对下丘脑中间神经元的特异性调节，本案发明人构建了能特异性标记下丘 脑中间神经元的携带光感基因的载体，并将携带光感基因的病毒载体转染中间神经 元；利用可以发射特定波长蓝光的发光装置对中间神经元进行刺激，对下丘脑中间神 经元及其突触进行精确控制，促进中间神经元活性的改变，实现对焦虑样行为的中枢 调控。特别是通过对感染后的下丘脑中间神经元细胞进行蓝光光照刺激，增强中间神 经元的放电频率和幅度，而导致焦虑样行为增加。

具体而言，一方面，本发明提供了一种特异性调控下丘脑中间神经元活性的光照 调控组合物，该组合物包括：

用于感染中间神经元细胞或其前体细胞的携带光感基因的病毒载体；该载体中包 括启动子、光感基因、绿色荧光标记基因，其中，所述启动子为VGAT启动子；

能产生蓝光的光照装置，用于对感染后的中间神经元细胞或其前体细胞进行光照 调控以改变其活性。

根据本发明的具体实施方案，本发明中所述的特异性调控下丘脑中间神经元活性 的光照调控组合物也可以称为一种“套组”，其中包括了本发明中特异性调控下丘脑 中间神经元活性中所采用的各试剂、材料及仪器设备等组件，作为一种产品例如试剂 盒的形式，各组件可按照预定的位置在大包装中分别放置或是独立包装后成套销售及 使用。

在本发明的一具体实施方案中，构建了用于感染中间神经元细胞或其前体细胞的 携带光感基因的病毒载体；该载体中的启动子为VGAT启动子；光感基因为ChR2； 绿色荧光标记基因为GFP；所述病毒为腺相关病毒包装载体(Invitrogen公司产品)；具 体的构建过程可以参照所属领域中的现有技术进行。

根据本发明的具体实施方案，本发明中所述的能产生蓝光的光照装置主要是用于 对离体的或在体的感染后的中间神经元细胞或其前体细胞进行光照调控以改变其活 性，这样的光照装置可以商购获得，当用于对在体的感染后的中间神经元细胞或其前 体细胞进行光照调控时，光照装置通常还包括作为光传导介质的光纤。

根据本发明的具体实施方案，本发明中所述的特异性调控下丘脑中间神经元活性 的光照调控组合物还可进一步包括：使所述携带光感基因的病毒载体感染中间神经元 细胞或其前体细胞的试剂材料。具体地，这些材料可以是包括脂质体(Invitrogen公 司产品)等。

根据本发明的具体实施方案，本发明中所述的特异性调控下丘脑中间神经元活性 的光照调控组合物中，所述蓝光为波长460～480nm的蓝光，优选为波长473nm的蓝 光。

另一方面，本发明提供了所述的特异性调控下丘脑中间神经元活性的光照调控组 合物在制备焦虑样行为调控系统中的应用。

根据本发明的具体实施方案，所述焦虑样行为调控系统是利用所述的组合物中的 携带光感基因的病毒载体感染下丘脑中间神经元细胞或其前体细胞，并通过光照装置 对感染后的中间神经元细胞或其前体细胞进行蓝光光照刺激，以调控焦虑样行为。

具体实施时，所述焦虑样行为调控系统可以是用于对离体的感染后的中间神经元 细胞或其前体细胞进行蓝光光照刺激，也可以是用于对在体的感染后的下丘脑中间神 经元细胞进行蓝光光照刺激。当所述焦虑样行为调控系统用于对离体的感染后的中间 神经元细胞或其前体细胞进行蓝光光照刺激时，蓝光光照条件优选为：蓝光波长 473nm，光强1～2mW；光刺激的相关参数为12.5～25ms每次，间隔12.5～25ms，占 空比1:1，光照频率20～40Hz。当所述焦虑样行为调控系统是用于对在体的感染后的 下丘脑中间神经元细胞进行蓝光光照刺激，该系统还包括用于将蓝光传导至感染后的 下丘脑中间神经元细胞的光纤，所述光纤直径200μm，蓝光光照条件为：蓝光波长 473nm，光照的平均强度为10～20mW/mm²，光照频率20～40Hz。

另一方面，本发明还提供了一种焦虑样行为调控系统，该系统包括本发明所述的 特异性调控下丘脑中间神经元活性的组合物。

另一方面，本发明还提供了所述的特异性调控下丘脑中间神经元活性的组合物或 所述的焦虑样行为调控系统在建立由下丘脑中间神经元细胞活性改变而导致焦虑样 行为增加的动物实验模型中的应用。具体地，所述组合物或焦虑样行为调控系统是通 过对感染后的下丘脑中间神经元细胞进行蓝光光照刺激，增强中间神经元的放电频率 和幅度，而建立焦虑样行为增加的动物实验模型。在本发明的一具体实施方案中，建 立了小鼠的焦虑模型，从而可进一步探讨研究调控中间神经元对焦虑样行为产生的影 响。

本发明的有益技术效果：本发明的技术可以精确地特异性调控下丘脑的中间神经 元，可以有效的影响焦虑样行为，从而可进一步为情感功能障碍发病机制及治疗的研 究提供实验依据，具有重要意义。

附图说明

图1A：下丘脑区中的中间神经元分布；

图1B：VMH脑区中的中间神经元分布。

图2：携带光基因的病毒载体成功感染下丘脑的中间神经元。

图3：蓝光刺激中间神经元增强其放电频率和幅度，导致焦虑行为增加。

图4：通过光纤对VMH脑区进行光照。

图5：在体光调控下丘脑中间神经元活动后矿场行为明显发生改变，导致焦虑行 为增加。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照所 属领域的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中，所用原始试剂和材料均可商购获得，或可按照现有技术的记载制 备得到。

实施例1

本实施例的方案主要包含下述几个方面：1)构建携带光感基因的病毒载体并感 染下丘脑的中间神经元；2)利用473nm的蓝光刺激下丘脑的中间神经元或投射末梢 并记录光电流，从而验证光基因对中间神经元的兴奋作用；3)通过在体光刺激的方 法研究调控中间神经元的活性后对焦虑样行为的调控作用，进一步可利用焦虑的小鼠 模型，通过在体特定频率的影响神经元的活性，来评估对焦虑行为严重程度的影响。 具体实施操作如下：

1)构建携带光基因的病毒载体并感染中间神经元

将携带光感基因的载体(ChR2质粒，invitrogen公司产品)、绿色荧光基因(GFP, invitrogen公司产品)和中间神经元特异性的启动子质粒(VGAT启动子，Invitrogen 公司产品)，和慢病毒包装的质粒pCMVΔR8.74、pMD2.G.(1.5μg)一起，利用脂质 体(Invitrogen公司产品)一起转染至293FT细胞(ATCC公司产品，该细胞传代至25 代后即需要更换新的一批细胞株)中(每200,000个细胞用6mg/L脂质体)，24hr后用 含有5mM丙酮酸钠的DMEM替代原293FT细胞的培养液继续培养，16小时后，利用 超速离心机在50，000g速度下破膜，将悬液通过20％的蔗糖滤柱，收集上清。该病毒 滴度能达3×10⁸TU/mL以上，产出的病毒颗粒以灭菌的磷酸盐缓冲液以1：1000的体 积比进行重悬。将获取的病毒按1：400的体积比混入无血清DMEM中，用于感染目标 细胞：下丘脑的中间神经元。

图1A为下丘脑区中的中间神经元分布，图1B为VMH脑区中的中间神经元分布。

利用上述的携带光感基因的病毒载体感染下丘脑的中间神经元(感染浓度为 1:500)，感染24hr后用含10％血清的培养基替代感染时的无血清培养基后继续观察， 在48hr后可以观察到神经元有绿色荧光表达。参见图2，可表明携带光基因的病毒载 体成功感染下丘脑的中间神经元。

2)以膜片钳技术对中间神经元表达的光敏通道蛋白的进行功能验证。

采用激光刺激系统(上海光源)对上述感染了携带光基因的病毒载体的下丘脑中 间神经元细胞进行蓝光刺激，蓝光波长473nm，光强1.1mW左右；光刺激的相关参 数为20ms每次，间隔20ms，占空比1:1，光照频率30Hz。

以电压钳的形式记录下游神经元的IPSC，结果参见图3，表明在特定的蓝光照射 条件下，可增强中间神经元的放电频率和幅度，中间神经元的活性增强。

3)利用光基因载体对在体的中间神经元进行活性调节，在对应位置植入直径 200μm的光纤(参见图4)，然后通过蓝光刺激在体下丘脑中的中间神经元，蓝光波长 473nm，光照的平均强度为10mW/mm²，光照频率35Hz，在照射的同时对小鼠的焦 虑样行为通过旷场试验进行评估。

旷场试验评估结果参见图5，图中左边图片为对照组，右边图片为本实施例中通 过光调控影响中间神经元活性的实验组，从图中显示，小鼠调控中间神经元活性后小 鼠旷场行为发生明显改变，导致焦虑行为增加，反映小鼠焦虑样行为被调控。