一种饮食诱导胰岛素抵抗模型的构建方法及应用

摘要

本发明一种饮食诱导胰岛素抵抗模型的构建方法，采用同时饲喂高脂高糖饲料及饮用一定浓度的果糖溶液诱导雄性昆明小鼠产生胰岛素抵抗，得到胰岛素抵抗模型。所述方法模拟人类的胰岛素抵抗发病过程，所制备的动物模型出现高胰岛素血症，糖脂代谢紊乱等胰岛素抵抗的典型症状，能适合于该病的机制研究和相关药物的筛选。通过高脂高糖饲料和低浓度果糖饮用水进行模型的诱导，能够高度的模拟人类胰岛素抵抗的发病过程，结果可信度高，并且排除了化学试剂产生的不良反应，避免了单纯食物饲喂时模型不稳定，成模率低的问题。通过高脂高糖饲料喂养使之能量摄入大于消耗，导致体内能量平衡失调，引起向心性肥胖和脂肪堆积，达到使机体产生胰岛素抵抗的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及动物模型构建技术领域，具体为一种饮食诱导胰岛素抵抗模 型的构建方法及应用。

背景技术

胰岛素抵抗(IR)是指胰岛素的外周组织及其靶器官或靶组织对胰岛素的 敏感性及反应性降低，导致正常量的胰岛素产生的生物学效应低于正常水 平。此时，机体为了保持内环境的稳定和血糖正常，代偿性地增加胰岛素分 泌，临床可表现为高胰岛素血症。目前医学界普遍把中心性肥胖(内脏性肥 胖)、高血压、血脂紊乱及血管内皮损伤等一系列构成心血管疾病的高危因 素，统称为“代谢综合征”。现代研究表明，胰岛素抵抗是引起“代谢综合 征”的基础，并且把伴有胰岛素抵抗的糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、 脑卒中称为“死亡五重奏”，IR有可能已经成为21世纪威胁人类健康与生 命安全的头号杀手。因此，对胰岛素抵抗的预防及治疗的研究具有重要的意 义，而建立理想的胰岛素抵抗动物模型则对研究该类疾病的发生机制，评估 药物疗效、治疗策略的有效性和安全性起到关键作用。

胰岛素抵抗的表现是由于胰岛素与靶组织细胞膜表面的胰岛素受体结合 能力及结合后的反应能力下降，使得由胰岛素介导的肌肉和脂肪组织摄取葡 萄糖能力下降，同时肝脏中葡萄糖生成增加，为了克服这种变化维持正常血 糖，胰腺代偿性刺激胰岛素分泌增加，最终导致的结果是胰岛素分泌及其作 用失衡，导致高血糖。胰岛素抵抗与糖脂代谢紊乱有关，肥胖和高能量膳食 摄入可增加其发病风险，因此高脂高糖膳食诱导肥胖型的糖脂代谢紊乱的动 物模型因符合人类胰岛素相关疾病的发病机理而被广泛的应用。

现有关于胰岛素抵抗模型的制备，通常是饮食加化学试剂诱导或者是单 一果糖诱导所致，而单凭现有的饮食配方或单纯果糖造出的模型稳定性不 强，所用化学试剂又极易导致结果差别过大，致使造模的致病程度存在一定 差异。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种简单、成模率高、成本低 及重现性好的饮食诱导胰岛素抵抗模型的构建方法及应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明一种饮食诱导胰岛素抵抗模型的构建方法，同时饲喂高脂高糖饲 料及饮用一定浓度的果糖溶液诱导雄性昆明小鼠产生胰岛素抵抗，得到胰岛 素抵抗模型。

优选的，具体包括如下步骤，

1)选取正常SPF级4周龄雄性昆明小鼠，体重18g～22g；

2)通过自由摄食及饮水的方式，用高脂高糖饲料及果糖溶液持续喂养 选取的雄性昆明小鼠5周后，得到胰岛素抵抗模型。

进一步，选取正常SPF级4周龄雄性昆明小鼠，体重18g～22g，分别标 记；通过自由摄食及饮水的方式，用高脂高糖饲料及果糖溶液持续喂养；对 照组自由摄食普通标准饲料和饮用蒸馏水；连续饲喂5周后，进行口服糖耐 量试验，及计算胰岛素敏感指数和胰岛素抵抗指数来测量动物模型的胰岛素 抵抗程度，得到胰岛素抵抗模型。

再进一步，连续饲喂5周，每周检测体重和随机血糖值；第5周结束 后，按2g/kg体重灌服40％D-葡萄糖溶液进行口服糖耐量试验，禁食8小 时后眼球取血留血清，检测血脂四项和游离脂肪酸，空腹血清胰岛素水平； 计算胰岛素抵抗指数及胰岛素敏感指数，得到胰岛素抵抗模型。

优选的，高脂高糖饲料由以下组分按重量百分比构成，基础饲料 56％～65％，蔗糖14％～16％，猪油14％～16％，胆固醇9％～15.9％，猪胆盐 0.1％；所述的果糖溶液浓度为10％～20％。

进一步，高脂高糖饲料中各组分满足如下要求，猪油：蔗糖≤1:1和/或 蔗糖：基础饲料≤1:4。

优选的，高脂高糖饲料由以下组分按重量百分比构成，基础饲料 60％，蔗糖15％，猪油15％，胆固醇9.9％，猪胆盐0.1％；所述的果糖溶液 浓度为15％。

本发明一种饮食诱导胰岛素抵抗模型的应用，所述的饮食为每天按照高 脂高糖饲料及果糖溶液进行自由摄食及饮水的用量给予。

优选的，糖脂代谢紊乱，进而诱导胰岛素抵抗的发生。

优选的，饮食诱导血清胰岛素水平升高的胰岛素抵抗模型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明所述方法模拟人类的胰岛素抵抗发病过程，所制备的动物模型出 现高胰岛素血症，糖脂代谢紊乱等胰岛素抵抗的典型症状，能适合于该病的 机制研究和相关药物的筛选。采用通过高脂高糖饲料和低浓度果糖饮用水进 行模型的诱导，能够高度的模拟人类胰岛素抵抗的发病过程，结果可信度 高，并且排除了化学试剂产生的不良反应，避免了单纯食物饲喂时模型不稳 定，成模率低的问题。通过高脂高糖饲料喂养使之能量摄入大于能量消耗， 导致体内能量平衡失调，引起向心性肥胖和脂肪堆积；与其他如化学给药或 者单纯的高果糖诱导相比，其最大优点是接近人类胰岛素抵抗的发病过程， 符合Randel学说中胰岛素抵抗的发生发展过程。

进一步的，通过进行口服糖耐量试验，及计算胰岛素敏感指数和胰岛素 抵抗指数来作为其发生胰岛素抵抗的特异性指标，通过测量与计算的结合， 避免了测量值对结果的影响，有利于准确的以这些作为依据进行相关药物的 筛选和研究。

进一步的，通过对饲料的独特配比，模拟人类饮食的条件；其中以猪油 和蔗糖对小鼠的血糖值实现升高的影响；以猪油的摄入影响脂肪堆积和胰岛 素分泌；以蔗糖摄入影响糖原合成；通过饮水中添加的果糖来增加甘油三脂 的浓度和升高血压，三者的相互配合，实现对模型的构建。

进一步的，通过猪油和蔗糖的比例，和/或蔗糖和基础饲料的比例控 制，满足动物饲料的制备，以及对各原材料的节省，降低了成本，充分保证 了饲料配比的稳定。

本发明所提供的模型的应用，所诱导的动物模型与对照相比，模型组的 糖耐量，动物胰岛素抵抗指数及胰岛素敏感指数与正常对照组动物有显著差 异，模型组肝细胞破损且排列杂乱，呈空泡状变性，有轻微炎症特征，这都 与临床的胰岛素抵抗症状一致，因此得到的模型能够很好的用于胰岛素抵抗 的相关研究。

附图说明

图1为本发明实施例中所述的两组实验小鼠的糖耐量变化曲线图。

图2为本发明实施例中所述的两组实验小鼠肝组织比较图，其中，2a 为正常组，2b为模型组。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明 的解释而不是限定。

本发明一种饮食诱导胰岛素抵抗模型的构建方法，通过自由摄食及饮水 的方式，用高脂高糖饲料及果糖溶液持续喂养4周龄或4周龄左右的， 18g～22g的雄性昆明小鼠5周。本发明中高脂高糖饲料由常规实验动物饲料 添加猪油、蔗糖、胆固醇和微量猪胆盐配制而成。果糖溶液采用分析纯加蒸 馏水配制。

其中，猪油主要用于提供饮食中的脂肪，其中含有大量饱和脂肪酸，用 于加速生物体脂肪堆积，从而导致体重增加，血液中甘油三酯和总胆固醇浓 度的增加。并且有文献表明，饲料中脂肪应用量的加大会导致糖耐量受损， 餐后血糖异常，继而诱发胰岛素抵抗。

高浓度的蔗糖旨在引起模型动物的糖代谢紊乱，虽然没有研究表明高糖 与糖尿病有直接关系。但是长期高糖饮食导致血液中血糖升高，为了维持血 糖平衡，机体不得不长期分泌大量胰岛素，最终结果是导致胰腺受损、碳水 化合物和脂肪代谢紊乱，引起体内环境失调，进而促进胰岛素抵抗的发生。 饲料中的蔗糖一般用商店可购买到的食用糖代替，以此降低成本。

果糖旨在引起模型动物的代谢紊乱，提高胰岛素抵抗发生的概率。由于 果糖和葡萄糖结构的差异，故在代谢机制上二者有所不同，果糖经过门静脉 输入肝脏后，可被迅速代谢为甘油醛和磷酸二氢丙酮，这些产物可很快地进 入糖酵解通路。当果糖摄入占能量比超过25％时，可加快对脂质生成的刺 激作用，导致甘油三酯堆积，并介导氧化应激反应，影响胰岛素与其受体结 合及由胰岛素刺激的葡萄糖转运，并干预游离脂肪酸代谢。这些变化反过来 又引起胰岛素敏感性下降、肝胰岛素抵抗以及肥胖。

通过上述方法得到的动物模型的验证方法包括体重、随机血糖、空腹血 清胰岛素水平及五项血脂指标，分别为胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度 脂蛋白-胆固醇(LDL)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL)及游离脂肪酸(FFA)等胰 岛素抵抗指标，通过口服糖耐量实验(OGTT)及计算胰岛素敏感指数(ISI)和 胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)来测量动物模型的胰岛素抵抗程度。

模型组小鼠采用高脂高糖饲料加果糖溶液诱导胰岛素抵抗模型。正常组 小鼠喂以普通标准饲料和蒸馏水。喂养5周，每周检测体重和随机血糖值。 第5周结束后，按2g/kg体重灌服40％D-葡萄糖溶液进行口服糖耐量试 验，禁食8小时后眼球取血留血清，检测血脂四项和游离脂肪酸，空腹血清 胰岛素水平。计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及胰岛素敏感指数(ISI)。同时 取肝脏组织，做免疫组织化学检测。

结果表明：与正常组相比，模型组体重、随机血糖、空腹血清胰岛素、 胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及游离脂肪酸明显升高， ISI和HOMA-IR较正常组相比有显著性差异(P<0.05)。光镜下，正常组小鼠 肝组织的肝小叶结构正常，肝细胞规则，排列整齐；模型组肝细胞结构破 坏，呈现空泡状变性，有轻微炎症特征，这都与临床的胰岛素抵抗症状一 致，可见该模型能够很好的用于胰岛素抵抗的相关研究。

具体的，实验及验证方法如下。

1.预备例试验材料的准备：

选正常SPF级4周龄左右的雄性昆明小鼠，体重18g～22g，购自西安交 通大学医学院。正常组小鼠饲喂基础饲料。

模型组小鼠的高脂高糖饲料配方：按重量份数比，基础饲料 56％～65％，蔗糖14％～16％，猪油14％～16％，胆固醇9％～15.9％，猪胆盐 0.1％；所述的果糖溶液浓度为10％～20％。在取值范围中的值就可以进行配 比。本实例中优选的采用，基础饲料60％(江苏省协同医药生物工程有限 责任公司)，蔗糖15％，猪油15％，胆固醇9.9％，猪胆盐0.1％。

先将猪油放置锅中熔化，然后加入蔗糖直至与猪油混匀。然后将称好的 胆固醇和猪胆盐倒入混和的猪油和蔗糖中。最后将普通饲料倒入锅中，炒拌 均匀；猪油与蔗糖的比例≤1:1，否则猪油无法全部吸收，猪油要粘附在椭 圆体的标准动物饲料上，必须依靠蔗糖的粘附作用。如果蔗糖比猪油量少， 会导致猪油的浪费；蔗糖与标准鼠粮的比例≤1:4，否则蔗糖无法全部吸 收，超过比例的蔗糖往往没有空间粘附在椭圆体的鼠粮上，造成蔗糖浪费。 最终将制好的饲料放置瓷盘中晾干即可。

正常组小鼠饮用水采用蒸馏水；模型组小鼠的果糖溶液浓度15％，即 将15g果糖溶解在100ml蒸馏水中。

实验小鼠全部自由饮水摄食。

采用如下的主要试剂和仪器：

小鼠胰岛素酶联免疫分析试剂盒，北京科盈美科技有限公司，批号： 14072401。胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL)、高密 度脂蛋白-胆固醇(HDL)试剂盒均由长春汇力生物技术有限公司提供，生产 批号分别是：20140219、20140223、20140224、20140232。游离脂肪酸 (FFA)测试盒，南京建成生物工程研究所，生产批号：20140723。GLM-77 博仕珑血糖分析仪，博仕珑血糖试纸片，厚美德生物科技股份有限公司(台 北)。一次性无菌采血针，北京瑞成医疗器械有限公司。全自动生化分析仪 器等常见实验室设备。

开始实验时，先造模及给药。

正常组小鼠喂以普通的基础饲料和蒸馏水，造模组采用高脂高糖饲料及 果糖溶液喂养5周。

然后进行指标测定。

每周检测体重和随机血糖值。血糖值采用博士珑公司提供的血糖仪和试 纸。第5周结束后，进行OGTT试验。实验前动物禁食12h，然后按2g/kg 体重比灌服40％D-葡萄糖溶液进行口服糖耐量试验，测定灌胃前空腹血糖 值(FBG)及灌胃后30min、60min和120min血糖值(BG_30min、BG_60min和 BG_120min)。

据公式：AUC＝(FBG+BG_30min)×1/4+(BG_30min+BG_60min)×1/4+ (BG_60min+BG_120min)×1/2，计算血糖曲线下面积(area under curve，AUC)。

继续禁食8小时后眼球取血留血清，参照上述各种试剂盒的说明书，检 测总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和游离脂肪酸，空腹 血清胰岛素水平(FINS)。并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感指 数(ISI)。

其中，HOMA-IR＝(FBG×FINS)/22.5；ISI＝In[l/(FBG×FINS)]。

同时速取两组小鼠的肝脏组织，用4％的多聚甲醛固定，进行系列梯度 脱水、浸蜡、包埋，然后切片，继而进行HE染色，光镜下观察肝脏情况。

最后进行结果分析。

1.如图1所示，与正常组相比，模型组体重、随机血糖、空腹血清胰岛 素、TC、TG、HDL、LDL明显升高，并且糖耐量受损，均具有统计学差异 (P<0.05)。具体的结果如下表1、表2和表3所示，其中，表1为本发明实 例中所述的两组实验小鼠的体重、随机血糖、空腹血糖、空腹血清胰岛素水 平、HOMA-IR、ISI的差别比较；表2为本发明实例中所述的两组实验小鼠 的糖耐量的变化值；表3为本发明实例中所述的两组实验小鼠的TC、TG、 HDL、LDL、FFA指标(mmol/L)。

2.与正常组相比，造模小鼠胰岛素敏感指数(ISI)降低，胰岛素抵抗指数 (HOMA-IR)升高(P<0.05)。

表1

组别 正常组 模型组 体重(g) 32.12±1.90 39.20±2.11* 随机血糖(mmol/L) 7.45±0.83 11.58±0.80* 空腹血糖(mmol/L) 5.96±0.50 8.66±1.70* 空腹血浆胰岛素(μU/mL) 21.26±1.86 41.86±1.56* HOMA-IR 5.34±0.86 16.26±3.08* ISI -4.35±0.51 -6.39±0.27*

Note:*p＜0.05vs normal control

表2：

Note:*p＜0.05vs normal control

表3

组别 TC LDL HDL TG FFA 正常组 1.50±0.15 1.25±0.31 3.04±0.88 1.65±0.28 1.39±0.56 模型组 2.23±0.18* 2.82±0.59* 1.30±0.22* 2.66±0.38* 2.12±0.10*

Note:*p＜0.05vs normal control

3.HE染色显示，其中实验小鼠肝脏HE染色400×。如图2a所示，正 常组小鼠肝脏结构正常，肝细胞排列紧密，围绕在中央静脉周围，呈放射状 分布；如图2b所示，模型组小鼠肝脏组织结构较正常组明显紊乱，肝细胞 内可见大量脂肪沉积，肝细胞损伤严重，呈现空泡状变性。