具有促进胶原蛋白合成活性的化合物在抗衰老化妆品中的应用

摘要

具有促进胶原蛋白合成活性的化合物在抗衰老化妆品中的应用，属于化妆品技术领域，所述的化合物为桃叶珊瑚苷或京尼平苷酸。本发明的桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸这两种化合物的提取方法简单，提取物的纯度高，并且这两种化合物均可以应用到化妆品中，制成液剂、乳剂或膏霜剂，达到促进皮肤胶原蛋白的合成，延缓和抑制皮肤衰老的效果。

说明书

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种具有促进胶原蛋白合成活性的化合物在抗衰老化妆品中的应用。

背景技术

皮肤是覆盖在人体表面最大的器官，由于直接与外界环境接触，受到氧化，干燥和紫外线等种种紧张因素的刺激，故非常容易受到损伤。同时，又因为年龄，饮食和生活习惯等内部因素的影响，导致皮肤功能的衰退和遗传畸化，从而使得皮肤更加容易老化。由于皮肤是处于人体的最外侧，一目了然地表现了人体的美。所以，抗衰老化妆品成了广大女性消费者迫切需求的产品之一。

皮肤老化的决定因素在于内外环境对真皮层内胶原蛋白的破坏。皮肤中胶原蛋白占72%，真皮中80%是胶原蛋白，它的三维螺旋结构如水库的堤坝一样，锁住皮肤深层水分，使皮肤光泽滋润、柔滑。因此被美容专家称为“皮肤的软黄金”。胶原蛋白在皮肤中如弹簧般支撑着皮肤，一旦发生断裂，真皮组织会塌陷，出现皱纹，皮肤就会松弛、下垂；皮肤出油后，撑大的毛孔由于弹性不能恢复而变得越来越大；自由基、黑色素也会在肌肤空洞和缝隙里越积越多。胶原蛋白由皮肤中的成纤维细胞生成，存在于细胞外基质中，为皮肤提供结构的稳定性，为结缔组织提供耐久性及粘结组织以支持细胞连接、细胞增生和诱导未分化细胞分化等作用。人体在年轻时能够制造许多胶原蛋白，但它们的产量会随着年龄增长而减少。有研究表明，婴儿的皮肤，真皮中胶原蛋白的含量高达80%，所以娇嫩、水润、细腻、无暇、富有弹性。随着年龄的增长，到18-22岁胶原蛋白开始流失，25岁女人的皮肤，真皮中胶原蛋白的含量为65%，眼角、嘴角出现皱纹，弹性下降，皮肤干燥。30-35岁眼角处一定出现细纹，此时你的胶原蛋白流失20%左右，毛孔更粗大，色斑、皮肤干涩、晦暗都可能出现；45-50岁嘴角两侧、额头已出现很深的皱纹，肌肤开始塌陷、下垂、甚至脸形轮廓都发生开裂，这时皮肤已经流失近40%左右的胶原蛋白。另外，皮肤老化80%的因素来自日光紫外线，紫外线能穿透真皮深层，破坏真皮的弹性纤维和胶原蛋白，受紫外线的影响体内的罗氨酸转化为了黑色素，是因为真皮内的胶原蛋白受到破坏。

 为寻找一种预防和减轻皮肤皱纹的方法，人们已经进行了广泛的研究，并阐明了胶原蛋白的重要作用。因此，人们想当然的认为，给皮肤补充胶原蛋白就能减轻皱纹、增加皮肤弹性和强度的作用。现已开发出一些含胶原蛋白的化妆品，但是这些化妆品涂抹于皮肤表面之上，高分子量的胶原蛋白难以透皮吸收，所以它们并不能改善皮肤的外观。因此新的抗皮肤衰老的方法的寻找仍然吸引着很多研究者，中药以其独特的优势，在抗皮肤老化领域的研究工作得到广泛开展。但是市面上抗皮肤老化的功效型化妆品，抗衰老效果却不理想，有待于进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有促进胶原蛋白合成活性的化合物在抗衰老化妆品中的应用。

基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：

具有促进胶原蛋白合成活性的化合物在抗衰老化妆品中的应用，所述的化合物为桃叶珊瑚苷或京尼平苷酸。

所述桃叶珊瑚苷或京尼平苷酸的归一化含量达到95%以上。

所述化合物在化妆品中的添加量为0.005～0.01wt%。

所述的化妆品为液剂、乳剂或膏霜剂。

本发明的桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸这两种化合物的提取方法简单，提取物的纯度高，并且这两种化合物均可以应用到化妆品中，达到促进皮肤胶原蛋白的合成，延缓和抑制皮肤衰老的效果。

附图说明

图1 桃叶珊瑚苷的¹HNMR；

图2 桃叶珊瑚苷的¹³CNMR；

图3 桃叶珊瑚苷的MS；

图4 京尼平苷酸的¹HNMR；

图5 京尼平苷酸的¹³CNMR；

图6 京尼平苷酸的MS；

图7 桃叶珊瑚苷纯度图；

图8 京尼平苷酸的纯度图；

图9是实施例5空白组小鼠的皮肤内部组织形态学变化图；

图10是实施例5模型组小鼠的皮肤内部组织形态学变化图；

图11是实施例5 VE组小鼠的皮肤内部组织形态学变化图；

图12是实施例5桃叶珊瑚苷低剂量组小鼠的皮肤内部组织形态学变化图；

图13是实施例5桃叶珊瑚苷中剂量组小鼠的皮肤内部组织形态学变化图；

图14是实施例5桃叶珊瑚苷高剂量组小鼠的皮肤内部组织形态学变化图；

图15是实施例5京尼平苷酸低剂量组小鼠的皮肤内部组织形态学变化图；

图16是实施例5京尼平苷酸中剂量组小鼠的皮肤内部组织形态学变化图；

图17是实施例5京尼平苷酸高剂量组小鼠的皮肤内部组织形态学变化图；

图18是试验例5模型组小鼠皮肤的减轻皱纹效果图；

图19是试验例5 VE组小鼠皮肤的减轻皱纹效果图；

图20是试验例5桃叶珊瑚苷低剂量组小鼠皮肤的减轻皱纹效果图；

图21是试验例5桃叶珊瑚苷中剂量组小鼠皮肤的减轻皱纹效果图；

图22是试验例5桃叶珊瑚苷高剂量组小鼠皮肤的减轻皱纹效果图；

图23是试验例5京尼平苷酸低剂量组小鼠皮肤的减轻皱纹效果图；

图24是试验例5京尼平苷酸中剂量组小鼠皮肤的减轻皱纹效果图；

图25是试验例5京尼平苷酸高剂量组小鼠皮肤的减轻皱纹效果图；

图26是实验组人体手部皮肤皱纹变化图；

图27是对照组人体手部皮肤皱纹变化图。

具体实施方式

    以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1 桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸的制备方法

步骤包括：

（1）取干燥的杜仲雄花，加入90v%乙醇溶液，料液质量比1:14，超声提取3次，每次30min，滤液合并，除去乙醇；

（2）去除乙醇后用大孔吸附树脂吸附，所述的大孔吸附树脂优选为H103；水洗除去糖类和蛋白质等除杂后，再用体积浓度为40v%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩冷冻干燥；

（3）取冻干物，以洗脱剂溶解，上样量25mg/mL装柱上样，三氯甲烷-甲醇(V:V=5:1)洗脱剂，流速2BV/h，收集洗脱液，减压浓缩，得到粗品；

（4）将步骤（3）的粗品配成100mg/mL 的甲醇溶液，采用制备型高效液相色谱法纯化，流动相为甲醇:水(V:V=10:90)，进样量为5mL，检测波长为206nm，收集保留时间8.28分钟的馏分，合并，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯度大于95%的桃叶珊瑚苷，10分钟后，检测波长变换为254nm，收集保留时间为18.84分钟的馏分，减压浓缩、冷冻干燥，得到纯度大于98%的京尼平苷酸。桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸的NMR和MS图，见图1-6，桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸化合物的纯度图，见图7-8。

实施例2 桃叶珊瑚苷或京尼平苷酸体外促进皮肤成纤维细胞的增殖

    取对数生长期ESF-1细胞，弃去旧培养液，加入胰酶，消化（显微镜下观察细胞形态）充分后，加入含有10wt%胎牛血清的DMEM培养液（DMEM干粉购自Gibco公司，配制方法参见其说明书），用弯头吸管反复吹打数次，使细胞脱离瓶壁，均匀悬浮于培养液中装于离心管中，1000 r/min离心5 min，弃去上清液；加入适量含有10wt%胎牛血清的DMEM培养液，吹打数次使细胞悬浮在培养液中。将细胞液置于无菌皿中吹打均匀，细胞计数板计数调整细胞浓度为3 ×10⁴个/mL。8孔微量加样器点板100 μL/孔，边缘孔用无菌PBS（0.01M）填充，移入培养箱中培养，待细胞完全贴壁生长，使用微量加样器依次加药10 μL/孔(浓度分别为:30, 20, 10, 5, 0.5μM)，对照组加入相同体积的PBS（0.01M），加药48h后，在生物安全柜中避光加入1 mg/mL MTT，50μL/孔。将加药后的细胞培养板放入培养箱中继续培养4h后弃上清液，用微量加样器加入 DMSO （二甲基亚砜）100 μL/孔，置摇床振摇 10 min，使结晶充分溶解。然后在酶标仪上490 nm 波长处测定吸光度（A）值，并计算细胞存活率：（实验组 A 值-空白 A 值）/（对照组 A 值-空白A 值）×100%。以没有添加活性成分的样品作为对照组，其细胞存活率为100%，实验结果见下表1。

表1 化合物促进成纤维细胞的增殖(%)

如表1所示，与不含本发明活性成分的对照组相比，随实验组中化合物浓度增加至5-20μM，皮肤成纤维细胞增殖明显增加，细胞存活率达到108.41%-128.71%，与对照组比较P<0.05，说明本发明的活性成分能明显促进成纤维细胞增殖，但是在化合物浓度达到30μM，化合物对细胞增殖的作用急剧减弱，推测可能是由于化合物在高浓度时具有一定的细胞毒性。

实施例3 酶联免疫吸附法(ELISA)测定成纤维细胞胶原蛋白I的含量

成纤维细胞经胰酶消化后转入96孔培养板中，边缘孔用无菌PBS（0.01M）填充，移入培养箱中继续培养，待细胞完全贴壁生长，使用微量加样器依次加药10 μL/孔(浓度分别为:30, 20, 10, 5, 0.5μM)，每组 6 个复孔，对照组加入相同体积的PBS（0.01M），加药48h后按试剂盒说明书测定Ⅰ型胶原蛋白含量。以没有添加活性成分的样品作为对照组，其胶原蛋白合成量为100%，实验结果见下表2 。

表2 化合物对于成纤维细胞中胶原蛋白合成的促进作用(%)

如表2所示，与不含本发明活性成分的对照组相比，随实验组中化合物浓度增加至5-20μM，胶原蛋白产率也明显增加到134.95%-188.95%，与对照组比较P<0.01，这说明本发明的活性成分能明显促进胶原蛋白的合成。

实施例4 提高亚急性模型衰老小鼠皮肤中羟脯氨酸（HYP）的含量

羟脯氨酸（HYP）是皮肤组织中特有的氨基酸，HYP含量的高低直接反映出皮肤组织胶原蛋白含量的高低，因此本实验选择测定皮肤组织HYP的含量，来考察化合物对小鼠皮肤组织中胶原蛋白合成是否有促进作用。具体实施如下：昆明种小鼠90只，随机分为9组，每组10只，雌雄各半，按体重随机分为空白对照组、模型组、VE阳性对照组、桃叶珊瑚苷高、中、低剂量组及京尼平苷酸高、中、低剂量组。模型组和各给药组每日上午颈背部皮下注射D-半乳糖0.12g/kg，对照组注射等量生理盐水。各组小鼠背部脱毛，暴露约2*2 cm²皮肤，模型组涂抹蒸馏水，维生素E组涂抹VE（10mg/100mL）的乙醇水溶液（乙醇和水的体积比为5︰95），桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸的低、中、高剂量组分别涂抹下述浓度(0.5mg/100mL、5mg/100mL、10 mg/100mL)的水溶液0.5mL，每天1次，连续涂试验品42d后处死，取涂抹部位皮肤，用于皮肤中羟脯氨酸（HYP）含量的测定。分别称取样品0.3g，加HCl (6M) 10mL。氮吹仪吹氮15min，手持式喷灯封口，确认密封，置110℃烘箱水解24h。冷却至室温后开封，将水解液转移至50mL烧杯，超纯水冲洗水解管3次。过滤定容至50mL，移取1mL于蒸发皿中，60℃烘干，加入0.1mol/L的盐酸1mL溶解样品。样品溶解完全后，经0.45μm有机系针头滤膜过滤，置于A300全自动氨基酸分析仪上进样分析。

表3:小鼠皮肤中羟脯氨酸及总氨基酸的含量（%）

由表3 可以看出，与对照组相比，模型组皮肤羟脯氨酸含量明显减少，具有显著性差异（P＜0.05）。与模型组相比，化合物高、中剂量组小鼠皮肤羟脯氨酸含量明显增加，且具有极显著性差异（P＜0.01）。化合物中剂量组与VE阳性对照组羟脯氨酸含量相当，而化合物高剂量组中羟脯氨酸含量远高于VE组。采用本发明活性成分促进小鼠成纤维细胞胶原蛋白合成的评价实验的结果表明，浓度为5mg/100mL 至10mg/100mL均具有明显促进胶原蛋白合成的作用。

实施例5 促进小鼠皮肤胶原纤维的增殖

上述已备好的皮肤组织中的一部分，用纱布包好，注名，用流水洗24个小时，再对组织进行脱水包埋（脱水的目的是将皮肤组织内的水分用乙醇或其他溶剂置换出来，使组织变硬，便于油类或透明剂的浸入，为已熔化石蜡浸渗到组织中创造条件），过程如下：70v%乙醇（1小时）—80v%乙醇（1小时）—90v%乙醇（1小时）—100v%乙醇（1小时）—100v%乙醇（1小时）—二甲苯（30分钟）—二甲苯（30分钟）—石蜡（3个小时），包埋完成。对已包埋好的皮肤组织进行4μm连续切片，常规HE染色，光学显微镜观察皮肤内部组织形态学变化特点。观察指标：基底层细胞排列分布、真皮层成纤细胞形态、表皮厚度、细胞层数、皮孔毛囊形态及数目（结果见图9-17）。

由图9-17可知，空白组小鼠，皮肤表皮组织结构完整、细胞分层清晰、厚度正常、具有明显的表皮突及真皮乳头；真皮层可见纤维组织、分布均匀、排列有序、疏密有致、细胞成分及数量适中。

与空白组小鼠相比，模型组小鼠的表皮组织结构不完整，分层不清楚；因真皮层纤维组织发生变性、破坏，而导致真皮组织排列紊乱、分布不均匀。

与模型组相比，桃叶珊瑚苷，京尼平苷酸的高、中剂量组，小鼠表皮组织结构受损程度明显减轻，结构比较完整、厚薄均一、细胞分层比较清晰；真皮层可见纤维组织，且分布较为均匀、排列有序，胶原纤维比较丰富，说明杜仲桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸可以延缓皮肤的老化，提高胶原纤维的表达。桃叶珊瑚苷，京尼平苷酸的低剂量组与模型组相比，小鼠表皮组织结构不完整，分层不清楚，真皮组织排列紊乱、分布不均匀，说明低剂量组对延缓小鼠皮肤老化影响不大。作为阳性对照的VE组，小鼠皮肤胶原纤维增加也不明显。

实施例6 减轻光老化模型小鼠皮肤皱纹的效应

将小鼠分为6个实验组、1个阳性对照组、1个模型组，每组10只，对于实验组，在小鼠皮肤上涂抹化合物，浓度分别为0.5mg/100mL、5mg/100mL、10mg/100mL的水溶液，阳性对照组施用10mg/mL的VE乙醇水溶液（乙醇和水的体积比为5︰95），空白组和模型组仅施用不含活性成分的蒸馏水。实验规程具体如下，采用模拟日光照射脱毛小鼠，照射剂量为2MED（造成皮肤发红的最小剂量的2倍），每周照射5天共照射10周，照射的同时，每天将各活性成分或溶剂（100μL）施用于皮肤之上，检查皱纹产生的抑制程度。利用裸眼目视检查施用化合物的区域并对该区域照相。将抑制皱纹产生的程度分为4级，即无效（分值0）、轻微（分值1）、中等（分值2）和 强效（分值3），将化合物处理组和模型组进行比较。实验结果见图8-25，实验数据列表于表4。

表4减轻光老化小鼠皮肤皱纹的效应

观察小鼠皮肤的一般形态，结果发现，模型组小鼠，背部表皮刚开始有轻度的红斑，随着紫外照射时间的延长，表皮颜色加深、增厚，严重的小鼠表皮出现裂痕、皱缩、粗糙且变硬、没有弹性及光泽。与模型组相比，桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸的高、中剂量组及VE组的小鼠背部表皮仅有不同程度的颜色加深、增厚，皱缩、粗糙其他症状都有明显改善；但是低剂量组的大部分小鼠皮肤症状与模型组相似，并没有好转迹象。如表4 所示，对于减轻小鼠皱纹而言，本发明活性成分的高、中剂量组表现出强效作用的占80%以上，这说明本发明的活性成分在5-10mg/100mL的浓度下，具有明显减轻皱纹的作用。

含有本发明活性成分的皮肤外用组合物可以采用任何施用于皮肤的剂型，如液剂、乳剂和膏霜剂等。组合物被特制为霜、乳液和爽肤水施用于人皮肤之上以减轻皱纹，已经发现它们可以显著降低皮肤皱纹密度。伴随实施例和对照例，以下将详细描述一种用于防止和减轻皮肤皱纹的皮肤外用组合物，应注意，不能认为本发明仅局限于这些实施例。

包含本发明活性成分的各种配方的制备

爽肤水的配置，首先将桃叶珊瑚苷或京尼平苷酸溶解于纯水中，然后按表中质量或体积称取或量取各物质，混匀即得爽肤水。乳液和霜的制备是将各原料按照表中数据称量，分别制作出油相，水相，然后加入乳化剂在胶体磨中充分乳化，冷却后即得。适用于皮肤的化妆品配方列于表5至7，其中采用了本发明的各种活性成分以及其它辅助成分。在本发明中制备了局部用于皮肤的爽肤水、乳液和霜。

表5 爽肤水的配方(100mL)

 

表6 乳液的配方(100g)

 

表7 营养霜的配方(100g)

包含本发明活性成分的组合物对于皮肤老化的防治作用的评价

皮肤衰老外观上以色素失调,表面粗糙皱纹形成和皮肤松弛为特征。通过比较抗衰老化妆品使用前后对皮肤衰老各方面特征的影响，可以比较客观地评价抗衰老化妆品的功效。皮肤弹性随皮肤衰老而降低因此皮肤弹性是判断皮肤衰老的重要标志之一是抗衰老化妆品的功效检测必不可少的项目；水分是皮肤表皮角质层重要的塑形物质之一，皮肤衰老时表皮角质层变薄，角质层中天然保湿因子含量减少，皮肤水合能力降低，皮肤水分丧失，使皮肤逐渐出现细小皱纹，通过对皮肤水分的测定可以间接反映皮肤衰老的程度以及抗衰老化妆品的功效；皮脂腺分泌的皮脂能够与汗腺分泌的汗液在皮肤表面形成一层乳状膜或水脂乳化物，对保持皮肤角质层的柔润、防止角质层正常水分的挥发，保持细胞组织的正常结构和形态特征有重要的生理作用，随着皮肤衰老皮脂分泌下降，水脂乳化物形成减少导致皮肤干燥租糙、无光泽等症状出现，因此通过对皮肤表面皮脂的测定可初步判断皮肤衰老的状况以及抗衰老化妆品的功效。

试验例1 包含本发明活性成分的制剂对于皮肤各项指标的改善

为评价上述对照例和实施例(5mg/100mL或5mg/100g)制备的制剂，对于人体皮肤各项指标的改善，采用年龄30-60岁之间的女性作为实施对象。将90名女性实验对象分为9组，每组10人。每天将各实施例及对照涂抹于实验对象指定区域，每天2次，共计3个月。通过测定皮肤各项指标（表8），观察各制剂对皮肤的改善效果。

表8 皮肤各项指标的在体测定

 

+：弹性高， -：弹性低

表8可以看出，使用各化妆品后皮肤的各项指标均得到明显改善，与对照组比较，皮肤水分含量，油脂含量均有升高，pH值略降低，弹性变强，因此，各剂型的化妆品均具有抗皮肤衰老的功效。

试验例2 包含本发明活性成分的各种制剂综合应用对皮肤皱纹的减轻

采用年龄30-60岁之间的女性作为实施对象。将30名女性实验对象分为3组，每组10人。每天将各种制剂（5mg/100mL或5mg/100g，包括爽肤水、乳液和霜各0.5mL）综合涂抹于手部皮肤(3*3 cm²)，每天2次，共计3个月，对照例采用各化妆品的基质。通过走访调查（表9），分析确定皱纹的减轻程度。对于走访调查而言，与未使用各组合物之前的情况相比较，将皱纹的减轻程度依次分为4级，即没有效果、轻微、中等和强效，并对各实验组人员进行统计。为进行皱纹的图像分析，在实验开始前取各实验对象手部区域的图像，在实验中期和结束后立即取相同区域的另一图像，将两图像进行对比分析，评价皱纹减轻程度。结果见图26和图27。

表9 女性手部皮肤皱纹减轻程度

如表9所示，当包含本发明活性成分的实施例用于实验对象时，与对照组比较，30-40岁的皮肤皱纹减轻达到70%，40-50岁达到80%，50-60岁达到90%。随着年龄的增长，皮肤皱纹改善的效果越明显。图26和图27的手部皮肤图像结果表明，采用爽肤水、乳液和霜等形式对皮肤局部涂敷时，能明显改善因内部或外部因素所造成的皮肤皱纹，外用基质组对皮肤有一定的改善作用，但是效果远不及含有活性成分的制剂组。

从上述描述可见，本发明提出了一种抗皮肤衰老的化妆品组合物，其中包含一种或多种促进胶原蛋白合成的活性成分，所述活性成分选自京尼平苷酸或桃叶珊瑚苷，该组合物表现出抑制、减轻和防止皮肤老化如皮肤皱纹的作用。

为达到描述的目的，在此已经公开了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说，在不背离所附权利要求界定的本发明范围和精神的基础上，有可能对本发明进行多种的改进、增添和替代。