日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法和四倍体杂交鱼的应用

摘要

一种日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，其是以日本白鲫为母本，以团头鲂为父本，将性成熟的日本白鲫的卵子与团头鲂的精子进行人工干法受精，受精卵在19℃～20℃水温下孵化，鱼苗在池塘中饲养；再利用流式细胞DNA含量测定法、外周血细胞培养的染色体倍性检测方法和血涂片法对鱼苗进行DNA含量、染色体数目以及血细胞大小的检测，筛选后制备得到三倍体杂交鱼和四倍体杂交鱼。将四倍体杂交鱼通过后续自交选育，可形成一个遗传稳定的具有四套白鲫染色体的四倍体鱼品系，并可用该四倍体鱼品系作为繁殖不育三倍体鱼的资源。本发明的方法不仅杂交后代性状优良，而且能为品种选育奠定良好基础，为后续新型多倍体鱼的选育提供宝贵资源。

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类杂交方法，具体涉及一种鲫鱼与团头鲂的亚科间远缘杂交方法。

背景技术

杂交技术是改良鱼类性状常用的方法，是通过杂交将两个或两个以上品种的部分优良性 状整合的育种方法，它是最基础的鱼类育种方法之一，也是被广泛采用的育种手段。亲缘关 系在种间或种间以上的杂交一般称为远缘杂交。远缘杂交作为一种重要的鱼类遗传育种和性 状改良方法，它可以整合整套外源基因，从而改变杂交后代基因的表达调控，使得杂交后代 可能在生长速度、抗逆性、抗病性以及肉质等方面表现出杂种优势。如红鲫与湘江野鲤的属 间远缘杂交形成的杂交后代具有生长速度快、肉质鲜嫩、抗病力强、存活率高等优点；而红 鲫与团头鲂的杂交后代中发现有三倍体(3n＝124)与四倍体(4n＝148)杂交后代。以往的日 本白鲫与团头鲂的杂交虽然也有进行，但在其后代中仅仅发现了三倍体杂交后代个体，而未 检测到四倍体。

如何利用和改进现有的生物学技术和方法，在现有鱼品种中挑选合适的亲本鱼进行远缘 杂交，从而对其进行遗传改良以获得性状更为优良、品种更加丰富和对遗传研究更有意义的 新型多倍体鱼，就成为本领域技术人员长期面临和需要解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种不仅 杂交后代性状优良、而且能为品种选育奠定良好基础、为后续新型多倍体鱼的选育提供宝贵 资源的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，以及该方法获得的四倍体杂交鱼的应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交 的方法，其特征在于：所述方法是以日本白鲫为母本，以团头鲂为父本，将性成熟的日本白 鲫的卵子与团头鲂的精子进行人工干法受精，受精卵在20℃～21℃水温下孵化，鱼苗在池塘 中饲养；再利用流式细胞DNA含量测定法、外周血细胞培养的染色体倍性检测方法和血涂 片法对鱼苗进行DNA含量、染色体数目以及血细胞大小的检测，筛选后制备得到三倍体杂 交鱼和四倍体杂交鱼。

上述本发明的技术方案中，日本白鲫(Carassius auratus cuvieri Temminck et Schlegel)隶 属于鲤形目，鲤科，鲤亚科鲫属中的二倍体鱼(2n＝100)，日本白鲫适应性强，耐寒、耐高温、 性成熟早、繁殖率高、养殖成本低，是一种成长快、经济效益高的优质鱼类；团头鲂 (Megalobrama amblycephala Yih)隶属于鲤形目，鲤科，鲌亚科，鲂属中的二倍体鱼(2n＝48)， 体高侧扁，尾柄高而短，体型优美，草食性，生长速度快，抗逆性强，肉质细嫩、腴美，脂 肪丰富。本发明通选择日本白鲫为母本、团头鲂为父本进行远缘杂交，获得了具备多种杂交 优势的新型三倍体、四倍体杂交鱼类。杂交后代整合了父、母本体形优美、生长速度快、抗 逆性强、肉质细嫩、营养价值高等优良性状，具有良好的市场前景。并且，杂交后代中获得 的四倍体后代，有望大规模应用于三倍体鱼的生产，在水产养殖中具有重要意义。

上述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，优选的，所述方法具体包括以下步骤：

(1)亲鱼的选择和培育：在繁殖期前3～4个月，挑选性成熟特征明显、体征良好的雌 性日本白鲫和雄性团头鲂分别作为远缘杂交的母本亲鱼和父本亲鱼进行专池培育(体征良好 的亲鱼一般表现为体型好、体色鲜艳、体质健壮、无病无伤)，保持水质良好；在繁殖期前一 个月左右以精饵饲养，每隔2～3天流水刺激一次，以促进亲鱼性腺发育成熟；

(2)人工催产：在当年的5月中旬至6月上旬，当水温稳定在20℃以上时，为亲鱼注 射黄体素释放激素类似物(LRH-A)与绒毛膜促性腺激素(HCG)的混合催产剂进行催产， 所述黄体素释放激素类似物的用量为10μg/kg，绒毛膜促性腺激素的用量为600IU/kg；先注 射母本亲鱼，4～5h后再注射父本亲鱼，父本亲鱼的注射剂量减半；注射完毕后按1∶6～8 的数量比将母、父本亲鱼放入同一产卵池中(水面面积为80m²左右)，然后视水情及时向池 中冲水；在产卵前3～4h，注入一定水量后，停止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺 利产卵和产精；

(3)授精孵化：挑选产卵顺利的母本亲鱼，然后与产精量大的父本亲鱼进行人工干法授 精，受精卵置于水温为19℃～20℃的培养皿中静水孵化；

(4)饲养：待鱼苗全部孵出后，于孵化环道中继续培育2～3天，待鱼苗出现腰点后将 鱼苗转入预先培肥的池塘中饲养，1～2天后泼洒豆浆，2～3次/天，力求细、匀；再利用流 式细胞DNA含量测定法、外周血细胞培养的染色体倍性检测方法和血涂片法对鱼苗进行 DNA含量、染色体数目以及血细胞大小的检测，检测筛选后获得日本白鲫与团头鲂杂交的三 倍体杂交鱼和四倍体杂交鱼。

上述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，优选的，所述步骤(2)中注射时采用 胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法，以提高亲鱼的存活率。

上述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，优选的，所述步骤(3)中授精孵化时 是用帆布担架固定母本亲鱼与父本亲鱼进行人工干法授精，以便于操作和减少对母本亲鱼的 损伤。

上述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，优选的，所述流式细胞DNA含量测 定法包括以下操作步骤：用经肝素润湿的一次性注射器从鱼尾静脉血管采血0.2mL，注入装 有0.8％生理盐水的Eppendorf管中，在血液和生理盐水混合液中加入1mL细胞核提取液 DAPI-A，处理时间10～15min；样品经过20μm尼龙滤器过滤；DNA染色液静置于暗处染 色样品5～10min，然后上机检测。

上述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，优选的，所述外周血细胞培养的染色 体倍性检测方法包括以下操作步骤：1)在超净工作台中配制培养基，100ml培养基含以下成 分：84ml RPMI-1640，15ml小牛血清，2支PHA，1ml 0.1％肝素钠，以7.5％NaHCO₃或1N HCl调pH至7.2～7.4；2)用注射器吸取灭菌肝素钠溶液，于用碘酒消毒后的实验鱼尾部静 脉取血；3)按每10ml培养液中加入0.2ml抗凝血的标准将抗凝血加入培养液中，于24℃、 5％二氧化碳浓度的培养箱中培养68～72小时，培养期间，定期轻摇匀，以使细胞充分接触 培养基；4)终止培养前24小时，在培养液中用1ml注射器滴加入10μg/ml的秋水仙碱，使 终浓度为0.05～0.07μg/ml。

上述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，优选的，所述血涂片法的操作步骤包 括：1)用碘酒棉签擦拭鱼尾静脉部位，用一次性注射器取适量血液，轻推一滴于干净载玻片 一端，使血滴附于玻片面上；2)以一只手拿该载玻片的两端，用另一只手拿住另一载玻片的 一端，在滴有血液的载玻片上由前向后接触血滴，使两载玻片约成45°角，轻轻移动，使血 滴成一直线，然后由前向后推为一均匀的薄片；3)涂片在空气中干燥后置于染色架上，滴加 瑞氏染色液，使涂片被染色液覆盖；4)染色5～10分钟后，于载玻片背面用蒸馏水均匀冲洗， 见涂片呈粉红色后，自然晾干，最后镜检。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的 方法获得的四倍体杂交鱼的应用，将所述四倍体杂交鱼通过后续自交选育，形成一个遗传稳 定的具有四套白鲫染色体的四倍体鱼品系，并用该四倍体鱼品系作为繁殖不育三倍体鱼的资 源。

在以前的红鲫与团头鲂的杂交实验中，鲫鲂杂交F1代中有两性可育的异源四倍体鲫鲂 (4n＝148)群体。在以前的雌性日本白鲫与雄性团头鲂杂交实验中，我们仅仅获得了三倍体 (3n＝124)鲫鲂杂交后代，并未发现有异源四倍体个体。在本发明的研发过程中，我们通过 细化远缘杂交操作和严格的筛选检测，在雌性日本白鲫与雄性团头鲂杂交后代中，我们不但 获得了三倍体(3n＝124)的鲫鲂后代，还获得了异源四倍体鱼(4n＝148)鲫鲂后代，而且该 异源四倍体鱼(4n＝148)与雌性红鲫跟雄性团头鲂的杂交F1代中的异源四倍体鱼(4n＝148) 在外形上有着显著的差异，最为明显特征的是前者无口须，而后者有口须。在反交实验中， 也就是以团头鲂作为母本、日本白鲫作为父本进行远缘杂交实验，没有获得存活的杂交后代。

红鲫与团头鲂的杂交后代F1代异源四倍体鲫鲂具有能同时产生减数和不减数配子的特 殊繁殖特性，它们通过自交形成了具有四套红鲫的同源四倍体鱼(4n＝200)。在本发明中，由 雌性日本白鲫与雄性团头鲂的杂交后代F1中，在获得新型四倍体鲫鲂(4n＝148)的基础上， 通过后续自交选育，将有望形成一个遗传稳定的具有四套白鲫染色体的四倍体鱼(4n＝200) 新品系。而一旦该四倍体鱼新品系的形成，将为不育三倍体鱼的大规模生产提供了宝贵的四 倍体鱼资源，将会产生重大的社会、经济和生态效益。因此，本发明在鱼类遗传育种和鱼类 进化研究方面具有极其重要意义。

可见，日本白鲫与团头鲂杂交后代的培育，不仅为两个优良品种的选育奠定了良好基础， 而且为后续的新型多倍体鱼的选育提供了宝贵资源，在生物进化和鱼类遗传育种方面具有重 要的生物学意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术 描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实 施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图 获得其他的附图。

图1为本发明实施例中日本白鲫(♀)×团头鲂(♂)后代中三倍体杂交鱼的外形照片。

图2为本发明实施例中日本白鲫(♀)×团头鲂(♂)后代中四倍体杂交鱼的外形照片。

图3为本发明实施例中日本白鲫(♀)×团头鲂(♂)后代中三倍体杂交鱼的染色图 (3n＝124)。.

图4为本发明实施例中日本白鲫(♀)×团头鲂(♂)后代中四倍体杂交鱼的染色体图 (4n＝148)。

图5为本发明实施例中日本白鲫的DNA含量图。

图6为本发明实施例中日本白鲫(♀)×团头鲂(♂)后代中三倍杂交体鱼的DNA含量 图。

图7为本发明实施例中日本白鲫(♀)×团头鲂(♂)后代中四倍杂交体鱼的的DNA含 量图。

图8为本发明实施例中日本白鲫(♀)×团头鲂(♂)后代中三倍体杂交鱼的血涂片图 (100×)。

图9为本发明实施例中日本白鲫(♀)×团头鲂(♂)后代中四倍体杂交鱼的血涂片图 (100×)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致 地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

需要特别说明的是，当某一元件被描述为“固定于、固接于、连接于或连通于”另一元 件上时，它可以是直接固定、固接、连接或连通在另一元件上，也可以是通过其他中间连接 件间接固定、固接、连接或连通在另一元件上。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。 本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范 围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购 买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例：

一种本发明的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，该方法是以日本白鲫为母本， 以团头鲂为父本，将性成熟的日本白鲫的卵子与团头鲂的精子进行人工干法受精，受精卵在 一定水温下孵化，鱼苗在池塘中饲养；再利用流式细胞DNA含量测定法、外周血细胞培养 的染色体倍性检测方法和血涂片法对鱼苗进行DNA含量、染色体数目以及血细胞大小的检 测，筛选后制备得到三倍体杂交鱼和四倍体杂交鱼。

上述本实施例的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，具体包括以下步骤：

(1)亲鱼的选择和培育：在繁殖期前3～4个月，挑选性成熟特征明显、体征良好的雌 性日本白鲫和雄性团头鲂分别作为远缘杂交的母本亲鱼和父本亲鱼进行专池培育(体征良好 的亲鱼一般表现为体型好、体色鲜艳、体质健壮、无病无伤)，保持水质良好；在繁殖期前一 个月左右以精饵饲养，每隔2～3天流水刺激一次，以促进亲鱼性腺发育成熟；

(2)人工催产：在当年的5月中旬至6月上旬，当水温稳定在20℃以上时，为亲鱼注 射黄体素释放激素类似物(LRH-A)与绒毛膜促性腺激素(HCG)的混合催产剂进行催产， 黄体素释放激素类似物的用量为10μg/kg，绒毛膜促性腺激素的用量为600IU/kg；先注射母 本亲鱼，4～5h后再注射父本亲鱼，父本亲鱼的注射剂量减半；注射完毕后按1∶6～8的数 量比将母、父本亲鱼放入同一水面面积为80m²左右的产卵池中，然后视水情及时向池中冲 水；在产卵前3～4h，注入一定水量后，停止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺利产 卵和产精；注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法，以提高亲鱼的存活率；

(3)授精孵化：当发现亲鱼在产卵池中相互追逐后，开始拉网打捞，对亲鱼进行检测(注 意要用软质网，操作要轻，水中检测)，将催产效果良好、产卵顺利的雌性日本白鲫与雄性团 头鲂进行人工干法授精，用帆布担架固定母本亲鱼与父本亲鱼进行人工干法授精，以便于操 作和减少对母本亲鱼的损伤；把精卵挤入干净的瓷盆中，用干净的搅拌器迅速不停地搅拌2～ 3min，然后迅速将受精卵轻轻倒入培养皿进行静水孵化，水温控制在20℃～21℃之间。

(4)饲养：待鱼苗全部孵出后，于孵化环道中继续培育2～3天，待鱼苗出现腰点后将 鱼苗转入预先培肥的池塘中饲养，1～2天后泼洒豆浆，2～3次/天，力求细、匀；再利用流 式细胞DNA含量测定法、外周血细胞培养的染色体倍性检测方法和血涂片法对鱼苗进行 DNA含量、染色体数目以及血细胞大小的检测。

鱼苗长成后采用外周血细胞培养的染色体倍性检测方法进行检测，操作步骤为：1)在超 净工作台中配制培养基，100ml培养基含以下成分：84ml RPMI-1640，15ml小牛血清，2 支PHA，1ml 0.1％肝素钠，以7.5％NaHCO₃(无菌)或1N HCl调pH至7.2～7.4；2)用注 射器吸取少量灭菌肝素钠溶液，于用碘酒消毒后的实验鱼尾部静脉取血；3)按每10ml培养 液中加入约0.2ml抗凝血的标准将抗凝血加入培养液中，于24℃、5％二氧化碳浓度的培养箱 中培养68～72小时，培养期间，定期轻摇匀，以使细胞充分接触培养基；4)终止培养前24 小时，在培养液中用1ml注射器滴加入10μg/ml的秋水仙碱，使终浓度为0.05～0.07μg/ml。 以上步骤均需无菌操作。

染色体制备步骤为：1)将培养物全部转入洁净的10ml离心管中，以1000rpm离心5分 钟，弃上清液；2)向离心管中加入低渗液9ml，混匀，低渗25～30分钟；3)加入1ml固 定液，轻轻混匀后1000rpm离心5分钟，弃上清液；4)加入5ml固定液，轻轻混匀，静置 20分钟后1000rpm离心5分钟，弃上清液；5)重复步骤4)一次；6)视最后细胞数量多少 加入适量固定液制成细胞悬液(一般为1～2ml)后，吸取细胞悬液自20～30cm高处滴片， 轻吹散，空气中自然干燥；7)Giemsa染液染色20～40分钟，细水流冲洗载玻片背面去除染 液，气干后镜检、拍照。

经检测筛选后发现，本实施例获得的日本白鲫与团头鲂杂交后代中含有三倍体杂交鱼和 四倍体杂交鱼(参见图3和图4)。

通过外形观察发现，本实施例方法获得的三倍体杂交鱼和四倍体杂交鱼的外形照片如图 1、图2所示，它们兼有日本白鲫与团头鲂的性状特征，例如它们的头部偏向于团头鲂，而身 体部位偏向于日本白鲫，其三倍体杂交后代在体色方面偏向于日本白鲫，体色较白，而四倍 体杂交后代体色则偏向于团头鲂，颜色较深；尾鳍方面，三倍体杂交后代个体尾柄较长，更 接近于日本白鲫，而四倍体杂交后代尾柄短而高，与团头鲂更接近。下表1、表2为日本白 鲫(♀)×团头鲂(♂)后代中三倍体杂交鱼和四倍体杂交鱼形态特征中可量、可数性状。

表1：三倍体杂交鱼和四倍体杂交鱼形态特征中可量性状

表2：三倍体杂交鱼和四倍体杂交鱼形态特征中可数性状

经用流式细胞仪检测获得日本白鲫以及日本白鲫与团头鲂杂交后代血液DNA含量，流 式细胞测定法步骤为：用经肝素润湿的一次性注射器从鱼尾静脉血管采血约0.2mL，注入装 有0.8％生理盐水的Eppendorf管中，在血液和生理盐水混合液中加入1mL细胞核提取液 DAPI-A(nuclei extraction solution，德国Partec Gmbh提供)，处理时间10～15min；样品 经过20μm尼龙滤器(德国Partec GmbH提供)过滤；DNA染色液(DAPI-B，德国Partec GmbH 提供)静置于暗处染色样品约5～10min，然后上机检测，日本白鲫以及三倍体杂交鱼和四倍 体杂交鱼的检测结果分别如图5、图6和图7所示。表3为日本白鲫×团头鲂后代中三倍体杂 交鱼和四倍体杂交鱼DNA含量与日本白鲫DNA含量的比较。

表3：三倍体杂交鱼和四倍体杂交鱼DNA含量与日本白鲫DNA含量的比较

血涂片法步骤为：1)用碘酒棉签擦拭鱼尾静脉部位，用一次性注射器取适量血液，轻推 一滴于干净载玻片一端，使血滴附于玻片面上；2)以一只手拿该载玻片的两端，迅速用另 一只手拿住另一载玻片的一端，在滴有血液的载玻片上由前向后接触血滴，使两载玻片约成 45°角，轻轻移动，使血滴成一直线，然后由前向后推为一均匀的薄片；3)涂片在空气中干 燥后置于染色架上，滴加瑞氏染色液，使涂片被染色液覆盖；4)染色5～10分钟后，于载玻 片背面用蒸馏水均匀冲洗，见涂片呈粉红色后，自然晾干，最后镜检。

日本白鲫(♀)×团头鲂(♂)后代中三倍体杂交鱼和四倍体杂交鱼的血涂片图分别如图 8、图9所示，在光学显微镜下观察，发现三倍体杂交鱼和四倍体杂交鱼的红细胞中，都存在 有部分红细胞具有哑铃状细胞核，分别占红细胞总数的18％、26％。在电子显微镜下观察,哑 铃状的细胞核表现为两头弯曲变形,细胞核的大部分表现为凝集程度较高、染色较深的异染 色质，少部分为凝集程度较低、染色较浅的常染色质。红细胞的细胞质呈均质状，其内的细 胞器不明显。在光学显微镜和电子显微镜下,我们还观察到少量红细胞核出现一分为二的分 裂现象，只是细胞质还是相互连接没有完全分开。日本白鲫×团头鲂后代中三倍体杂交鱼和四 倍体杂交鱼的红细胞(核)测量值如下表4所示。

表4为日本白鲫×团头鲂后代中三倍体鱼、四倍体鱼红细胞(核)测量值。

由上可见，本发明方法为利用远缘杂交产生新型三倍体和四倍体鱼类开辟了新途径，通 过进一步选育，可以选育出集白鲫与团头鲂优势的新型四倍体鱼与三倍体鱼，这在生物进化 研究和鱼类遗传育种方面具有重要的生物学意义。