从山核桃外果皮中分离纯化4,8-DHT的方法及4,8-DHT应用

摘要

本发明公开了从山核桃外果皮中分离纯化4,8-DHT的方法及4,8-DHT应用，通过它激式超声发声超声提取得到山核桃外果皮提取液，减压浓缩，然后过X-5大孔树脂，用水与乙醇的混合溶液进行梯度洗脱，收集水与乙醇体积比为4：6的混合液洗脱得到的洗脱液，减压浓缩得到浓缩液，硅胶柱层析，用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂梯度洗脱，1/2柱体积收集一瓶流份，共收集36瓶流份，合并第10-18瓶流份，减压浓缩，乙酸乙酯结晶，得4,8-二羟基-1-四氢萘酮结晶化合物，该4,8-DHT为1:1外消旋体，杂质少，纯度为99.5-99.8%，提取率达到94%以上，该4,8-DHT外消旋体具有抑制植物种子萌发和幼苗生长的作用。

说明书

技术领域

 本发明涉及4,8-二羟基-1-四氢萘酮提取，具体涉及从山核桃外果皮中分离纯化4,8-二羟基-1-四氢萘酮的方法及4,8-DHT应用。

背景技术

4,8-二羟基-1-四氢萘酮（4,8-DHT），化学名4,8-dihydroxy-1-tetralone，无色细簇针状结晶,其中4位与羟基相连的碳为一个手性碳。4,8-DHT的左旋对映体(–)被称为regiolone，右旋对映体(+)被称为isosclerone。Regiolone最早是从青核桃中鉴定出的，可用于治疗皮肤瘙痒及痛等病症。Isosclerone最早是从Sclerotinia sclerotium中分离鉴定出，后来从一些真菌中也分离出了该化合物，它能引起葡萄灰色斑点病。山核桃外果皮中也含有4,8-DHT，是一个1:1外消旋体，熔点366-368K，溶于水、乙醇、丙酮及氯仿，[α]²⁰_D=±0° （c1.3, CH₂Cl₂）。目前公开了对山核桃外果皮中含有的4,8-DHT的鉴定，如用高效液相色谱法鉴定，一般用甲醇浸泡、回流提取山核桃外果皮提取物，再用色谱柱鉴定，4,8-DHT含量约0.036%左右。但未见从山核桃外果皮中分离纯化4,8-二羟基-1-四氢萘酮报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种从山核桃外果皮中分离纯化4,8-DHT的方法，该方法杂质少，纯度高，提取效率高。本发明还公开了4,8-DHT在抑制植物种子萌发和幼苗生长的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：从山核桃外果皮中分离纯化4,8-DHT的方法，步骤如下：

（1）将风干的山核桃外果皮粉碎，过45-60目筛，得到山核桃外果皮粉末；

（2）将山核桃外果皮粉末装入超声萃取釜中并加入蒸馏水，其中山核桃外果皮粉末与蒸馏水的质量体积比为1：18-20 (Kg/L)，在超声发生方式为：它激式超声发声，径向振动柱状换能器，超声波功率为100W，超声频率为28kHz，提取方式为间隔2min超声一次，每次4min，于25℃气升式搅拌条件下，超声提取30-45min，过滤，得到山核桃外果皮提取液；

（3）将山核桃外果皮提取液在压力为450-500Pa的条件下，减压浓缩至初始体积的1/10，然后过X-5大孔树脂，依次用体积比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10的水与乙醇的混合溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的水与乙醇混合溶液体积为5柱体积，洗脱过程中保持流速为2-3滴/秒，收集水与乙醇体积比为4：6的混合液洗脱得到的洗脱液，在压力为450-500Pa的条件下，减压浓缩55-70min，得到浓缩液；

（4）将上述浓缩液上200-300目的硅胶柱层析，依次用体积比为3:1，2:1，1:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，体积比为3:1相的混合溶剂用量为10柱体积，体积比为2:1相的混合溶剂用量为5柱体积，体积比为1:1相的混合溶剂用量为3柱体积，洗脱流速5mL/min，每1/2柱体积收集一瓶流份，共收集36瓶流份，合并第10-18瓶流份，减压浓缩，用乙酸乙酯结晶，得4,8-二羟基-1-四氢萘酮结晶化合物。 

4,8-DHT在抑制植物种子萌发和幼苗生长的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于从山核桃外果皮中分离纯化4,8-DHT的方法及4,8-DHT应用，通过它激式超声发声超声提取得到山核桃外果皮提取液，减压浓缩，然后过X-5大孔树脂，用水与乙醇的混合溶液进行梯度洗脱，收集水与乙醇体积比为4：6的混合液洗脱得到的洗脱液，减压浓缩得到浓缩液，硅胶柱层析，用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂梯度洗脱，1/2柱体积收集一瓶流份，共收集36瓶流份，合并第10-18瓶流份，减压浓缩，乙酸乙酯结晶，得4,8-二羟基-1-四氢萘酮结晶化合物，该4,8-DHT为1:1外消旋体，杂质少，纯度为99.5-99.8%，提取率达到94%以上，该4,8-DHT外消旋体具有抑制植物种子萌发和幼苗生长的作用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

从山核桃外果皮中分离纯化4,8-DHT的方法，将风干的山核桃外果皮粉碎，过45-60目筛，得到山核桃外果皮粉末10g，将山核桃外果皮粉末装入超声萃取釜中并加入180-200ml蒸馏水，在超声发生方式为：它激式超声发声，径向振动柱状换能器，超声波功率为100W，超声频率为28kHz，提取方式为间隔2min超声一次，每次4min，于25℃气升式搅拌条件下，超声提取30-45min，过滤，得到山核桃外果皮提取液；将山核桃外果皮提取液在压力为450-500Pa的条件下，减压浓缩至初始体积的1/10，然后过X-5大孔树脂，依次用体积比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10的水与乙醇混合溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的混合溶液体积为5柱体积，洗脱过程中保持流速为2-3滴/秒，收集水与乙醇体积比为4：6的混合液洗脱得到的洗脱液，在压力为450-500Pa的条件下，减压浓缩55-70min，得到浓缩液；将上述浓缩液上200-300目的硅胶柱层析，依次用体积比为3:1，2:1，1:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，体积比为3:1相的混合溶剂用量为10柱体积，体积比为2:1相的混合溶剂用量为5柱体积，体积比为1:1相的混合溶剂用量为3柱体积，洗脱流速5mL/min，1/2柱体积收集一瓶流份，共收集36瓶流份，合并第10-18瓶流份，在压力为460-480Pa的条件下，减压浓缩50-70min，加乙酸乙酯重结晶，得4,8-二羟基-1-四氢萘酮结晶化合物0.00342g，提取率达到94%以上，采用高效液相色谱法测定，该结晶化合物为纯度99.5-99.8%。

实施例2

将实施例1的4,8-二羟基-1-四氢萘酮配置成0.1mM、0.5mM的处理液作对莴苣、萝卜、黄瓜、洋葱、小麦种子萌发抑制实验，取测试物种种子各100粒，均匀摆放在铺有两层滤纸、大小15×20 cm发芽盒，加10 ml不同浓度处理液（对照组为去离子水），每个处理设置3个重复。培养条件为光周期25℃，12h；暗周期15℃，12h。种子萌发以胚根突破种皮为标准，第四天和第七天记录莴苣种子发芽数，第四天和第十天记录萝卜种子发芽数，第四天和第八天记录黄瓜种子和小麦种子发芽数，第六天和第十二天记录洋葱种子发芽数。最后结果：0.1mM 4,8-DHT处理可以降低莴苣种子发芽数50%左右、小麦种子发芽数10%以上，对其它植物种有降低作用但效应不显著(p<0.05)；0.5mM 4,8-DHT处理都可以显著降低测试上述植物种子发芽数，其中莴苣发芽数降低90%以上，萝卜发芽数降低60%左右，黄瓜发芽数降低10%以上，洋葱发芽数降低80%左右，小麦发芽数降低65%左右(p<0.05)。

实施例3

将实施例1的4,8-二羟基-1-四氢萘酮配置成0.1mM、0.5mM的处理液作对莴苣、萝卜、黄瓜、洋葱、小麦幼苗生长的抑制实验，取胚根突破种皮种子各100粒，均匀摆放在铺有两层滤纸、大小15×20cm发芽盒，加入10 ml不同浓度处理液（对照组为去离子水），每个处理设置3个重复。培养条件为光周期25℃，12h；暗周期15℃，12h。每隔一天从发芽盒中随机取5粒种子测其胚根、胚芽长度及鲜重，共测6次。0.1mM 和0.5 mM 4,8-DHT处理可以显著降低测试种胚根生长(p<0.05)。0.1mM 4,8-DHT处理可以抑制莴苣胚芽生长45%左右，萝卜胚芽生长15%左右，黄瓜胚芽生长16%左右，洋葱胚芽生长30%左右，小麦胚芽生长10%左右(p<0.05)；0.5 mM 4,8-DHT处理可以抑制莴苣胚芽生长85%左右，萝卜胚芽生长80%左右，黄瓜胚芽生长90%左右，洋葱胚芽生长70%左右，小麦胚芽生长70%左右(p<0.05)。