垂穗披碱草幼穗离体培养再生植株方法

摘要

本发明主要涉及一种垂穗披碱草组织培养再生技术，属于生物技术领域。一种垂穗披碱草幼穗离体培养再生植株方法，其主要特点在于包括以下步骤：1)外植体的获取；2)愈伤组织诱导；3)将诱导的愈伤组织接种于继代培养基中进行培养；4)将步骤3)的垂穗披碱草愈伤组织转移至分化培养基中培养；5)待愈伤组织有绿芽长出，将其转移至生根成苗培养基上进行培养；6)待有5条以上健壮根长出，将三角瓶上的封口膜去掉，同时加入5mL的蒸馏水，炼苗3d，然后将小植株从三角瓶中取出，洗净根部的培养基，最后移栽于混有草炭土和蛭石比例为1:1的花盆中。本发明克服了现有的禾本科牧草组织培养技术过程中常见到的污染率高、愈伤诱导率低和再生性差等问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种以垂穗披碱草幼穗为外植体进行组织培养，获得再生植株的方法，属于农业栽培中通过组织培养技术的植物再生领域。 

背景技术

垂穗披碱草(Elymus nutans)又名钩头草、弯穗草，是禾本科披碱草属多年生草本疏丛型植物，在我国的东北、华北、西北和西南等地广泛分布，在青藏高原湿润地区常作为优势种和建群种(刘新亮，2011)。因其抗寒和抗旱能力强，对土壤要求不严格(陈智华，2009)，经栽培驯化后，可以建立打草、放牧兼用的人工草场。垂穗披碱草的种植既可以满足生态环境建设的需要，更是促进畜牧业可持续发展的重要措施。 

组织培养是指在无菌条件下利用人工培养基对植物组织进行培养，是生物工程研究的基础，是进行遗传转化和植物改良研究的基本环节。与禾谷类作物如小麦(Triticum aestivum)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)和水稻(Oryza sativa)等相比，禾本科牧草的组织培养技术起步较晚。相比利用茎、叶和下胚轴等为外植体的组织培养方法，以幼穗为外植体进行组织培养具有污染率低、取材方便，而且其组织内含有较高激素含量，利于愈伤形成和分化等优点，所以非常适合用于禾本科牧草再生体系的建立。目前，以垂穗披碱草幼穗为外植体进行组织培养的研究还鲜有报道，因此建立以垂穗披碱草幼穗为外植体的组织培养再生体系很有必要，同时也为今后的转基因研究奠定了基础。 

发明内容

本发明要解决的技术问题和提供一种垂穗披碱草幼穗离体培养植株再生方法。提出的技术任务是克服现有垂穗披碱草离体培养技术产生的污染率高、愈伤诱导率低和再生性差等缺陷，以通过选用垂穗披碱草的幼穗作为外植体材料，调控外源植物激素和培养基的渗透压，获得高比例的颗粒状胚性愈伤组织，建立植株再生的技术体系，为进行遗传转化和性状改良提供研究平台。 

本发明采用以下技术方案：一种垂穗披碱草幼穗离体培养再生植株方法，其主要特 点在于包括以下步骤： 

1)外植体的获取：取处于雌雄蕊分化期、长度约为3.0-10cm的幼穗，剪取垂穗披碱草植株上半部，去掉外层的叶片后在无菌条件下用棉球蘸取70％乙醇擦拭其茎秆和叶鞘，用消过毒的镊子小心剥取幼穗，将其切成2-3mm的小段； 

2)愈伤组织诱导：将外植体接种于愈伤诱导培养基上，每皿接种幼穗小段，放入培养室培养，培养室温度为24-26℃，光照时间16h/d，黑暗时间8h/d，培养时间为1-2个月； 

3)将诱导的愈伤组织接种于继代培养基中进行培养，培养室温度为24-26℃，光照时间16h/d，黑暗时间8h/d，在继代培养基中培养20-30d； 

4)将步骤3)的垂穗披碱草愈伤组织转移至分化培养基中培养，培养室温度为24-26℃，光照时间16h/d，黑暗时间8h/d，在分化培养基中培养的时间为20-30d； 

5)待愈伤组织有绿芽长出，将其转移至生根成苗培养基上进行培养，培养室温度为24-26℃，光照时间16h/d，黑暗时间8h/d； 

6)待有5条以上健壮根长出，将三角瓶上的封口膜去掉，同时加入5mL的蒸馏水，炼苗3d，然后将小植株从三角瓶中取出，洗净根部的培养基，最后移栽于混有草炭土和蛭石比例为1:1的花盆中，最初3d给幼苗遮上塑料薄膜以保持湿度。 

所述的垂穗披碱草幼穗离体培养再生植株方法，所述的愈伤组织诱导培养基为：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，七水合硫酸镁370mg/L，二水合氯化钙440mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.025mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，烟酸0.5mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，2,4-二氯苯氧乙酸3.0mg/L。 

所述的垂穗披碱草幼穗离体培养再生植株方法，所述的继代培养基为：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，七水合硫酸镁370mg/L，二水合氯化钙440mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.025mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，烟酸0.5mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L，2,4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L。 

所述的垂穗披碱草幼穗离体培养再生植株方法，所述的分化培养基为：硝酸钾1900 mg/L，硝酸铵1650mg/L，七水合硫酸镁370mg/L，二水合氯化钙440mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.025mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，烟酸0.5mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L，激动素1.0mg/L和6-氨苄基腺嘌呤1.0mg/L。 

所述的垂穗披碱草幼穗离体培养再生植株方法，所述的生根成苗培养基配方：所述的生根成苗培养基为：1/2MS培养基为硝酸钾950mg/L，硝酸铵825mg/L，磷酸二氢钾85mg/L，七水合硫酸镁185mg/L，二水合氯化钙220mg/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.025mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，烟酸0.5mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L。 

本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果： 

选用处于雌雄蕊分化时期、长度约为3.0-10cm的幼穗为外植体，进行离体组织再生培养。调控愈伤组织诱导培养基中外源激素的配比，提高了垂穗披碱草胚性愈伤组织的诱导率。降低愈伤组织继代培养基中激素2,4-二氯苯氧乙酸的浓度至2.0mg/L，以提高愈伤组织的质量和胚性细胞发生率。本发明建立的垂穗披碱草幼穗离体培养植株再生方法体系，为进行遗传转化和性状改良提供研究平台。 

附图说明

图1：幼穗诱导愈伤组织； 

图2：愈伤组织分化绿苗； 

图3：生根的幼苗； 

图4：移栽至花盆中的再生植株。 

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。 

实施例1：一种垂穗披碱草幼穗离体培养再生植株方法，其主要特点在于包括以下步 骤： 

1)外植体的获取：取处于雌雄蕊分化期、长度约为3.0-10cm的幼穗，剪取垂穗披碱草植株上半部，去掉外层的叶片后在无菌条件下用棉球蘸取70％乙醇擦拭其茎秆和叶鞘，用消过毒的镊子小心剥取幼穗，将其切成2-3mm的小段； 

2)愈伤组织诱导：将外植体接种于愈伤诱导培养基上，每皿接种幼穗小段，放入培养室培养，培养室温度为24-26℃，光照时间16h/d，黑暗时间8h/d，培养时间为1-2个月； 

3)将诱导的愈伤组织接种于继代培养基中进行培养，培养室温度为24-26℃，光照时间16h/d，黑暗时间8h/d，在继代培养基中培养20-30d； 

4)将步骤3)的垂穗披碱草愈伤组织转移至分化培养基中培养，培养室温度为24-26℃，光照时间16h/d，黑暗时间8h/d，在分化培养基中培养的时间为20-30d； 

5)待愈伤组织有绿芽长出，将其转移至生根成苗培养基上进行培养，培养室温度为24-26℃，光照时间16h/d，黑暗时间8h/d； 

6)待有5条以上健壮根长出，将三角瓶上的封口膜去掉，同时加入5mL的蒸馏水，炼苗3d，然后将小植株从三角瓶中取出，洗净根部的培养基，最后移栽于混有草炭土和蛭石比例为1:1的花盆中，最初3d给幼苗遮上塑料薄膜以保持湿度。 

所述的愈伤组织诱导培养基为：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，七水合硫酸镁370mg/L，二水合氯化钙440mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.025mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，烟酸0.5mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，2,4-二氯苯氧乙酸3.0mg/L。 

所述的继代培养基为：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，七水合硫酸镁370mg/L，二水合氯化钙440mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.025mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，烟酸0.5mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L，2,4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L。 

所述的分化培养基为：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，七水合硫酸镁370mg/L，二水合氯化钙440mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.025 mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，烟酸0.5mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L，激动素1.0mg/L和6-氨苄基腺嘌呤1.0mg/L。 

所述的生根成苗培养基为：所述的生根成苗培养基为：1/2MS培养基为硝酸钾950mg/L，硝酸铵825mg/L，磷酸二氢钾85mg/L，七水合硫酸镁185mg/L，二水合氯化钙220mg/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.025mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，烟酸0.5mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L。 

试验验证例，垂穗披碱草采自甘肃省玛曲县野生种质，其组织培养过程为： 

1)外植体的获取：取处于雌雄蕊分化期、长度约为3.0-10cm的幼穗，剪取垂穗披碱草植株上半部，去掉外层的叶片后在无菌条件下用棉球蘸取70％乙醇擦拭其茎秆和叶鞘，用消过毒的镊子小心剥取幼穗，将其切成2-3mm的小段。 

2)愈伤组织诱导：将外植体接种于愈伤诱导培养基上，每皿接种10个幼穗小段，放入培养室培养。 

3)愈伤组织诱导培养基配方：MS基本培养基加入2,4-二氯苯氧乙酸3.0mg/L，培养室温度为24-26℃，光照时间16h/d，黑暗时间8h/d。 

4)将诱导的愈伤组织接种于继代培养基中进行培养。 

5)继代培养基配方：MS基本培养基加入2,4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L，培养室温度为24-26℃，光照时间16h/d，黑暗时间8h/d。 

6)在继代培养基中培养20-30d，将垂穗披碱草愈伤组织转移至分化培养基中培养。 

7)分化培养基配方：MS基本培养基加入激动素1.0mg/L和6-氨苄基腺嘌呤1.0mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L，培养室温度为24-26℃，光照时间16h/d，黑暗时间8h/d。 

8)在分化培养基中培养的时间为20-30d。 

9)待愈伤组织有绿芽长出，将其转移至生根成苗培养基上进行培养。 

10)生根成苗培养基配方：1/2MS(MS培养基大量元素减半，其它不变)，培养室温度为24-26℃，光照时间16h/d，黑暗时间8h/d。 

11)待有5条以上健壮根长出，将三角瓶上的封口膜去掉，同时加入5mL的蒸馏水， 炼苗3d，然后将小植株从三角瓶中取出，洗净根部的培养基，最后移栽于混有草炭土和蛭石比例为1:1的花盆中，最初3d给幼苗遮上塑料薄膜以保持湿度。