一种多功能靶向异长春花碱脂质体及其制备方法

摘要

一种多功能靶向异长春花碱脂质体，是由异长春花碱、脂材及功能性靶向配体组成的；所述脂质体为双分子层结构，内部为水溶性空腔；所述异长春花碱包封在脂质体水溶性空腔中；所述脂材由卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺组成；所述功能性靶向配体由脂质体表面的修饰物和脂质体双分子层中的靶向材料组成；所述脂质体双分子层中的靶向材料为粉防己碱，粉防已碱包封在脂质体双分子层中；所述脂质体表面的修饰物为伐普肽-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与胆固醇-聚乙二醇-聚乙烯亚胺。本发明还提供一种多功能靶向异长春花碱脂质体的制备方法，使药物在跨过血脑屏障后靶向到脑胶质瘤部位，增加药物在脑肿瘤部位的分布，提高化疗效果。

说明书

技术领域

本发明涉及医药制剂技术领域，尤其涉及一种用于治疗脑胶质瘤的多功能靶向异长春花碱脂质体及其制备方法。

背景技术

脑胶质瘤作为恶性肿瘤之一，已经成为癌症死亡的十大因素之一，严重危及人们的生命和健康。目前临床上对于脑胶质瘤主要采用手术治疗、放射治疗和化学药物治疗等方案。脑胶质瘤具有强浸润性的特点，可以快速地浸润和破坏正常脑组织结构，因而，临床中不可能通过手术切除的方法完全治愈脑胶质瘤。放射治疗由于自身治疗精度的限制也不能完全清除脑胶质瘤细胞，并且该方法副作用大，对正常细胞的损伤明显。化疗方法失败的主要原因在于化疗药物很难顺利的跨越血脑屏障，药物通过静脉给药后不能充分的到达脑实质，据研究大约只有1%的化疗药物能通过血脑屏障到达中枢肿瘤组织。血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障，该屏障的生理功能是阻止大部分的外来物质由血液进入脑组织，从而保持脑组织内环境的基本稳定并更好的保护脑组织。由此可见，脑胶质瘤的上述特点使得脑肿瘤患者的预后极差，且中位生存期往往少于16个月。

因此，我们需要构建一个多功能靶向载体，这个载体可以携带化疗药物顺利跨越机体的血脑屏障，然后将药物靶向输送至脑肿瘤组织，该多功能靶向载体的成功构建是脑胶质瘤综合治疗策略中至关重要的一步。

异长春花碱（vinorelbine，VRB）是从中药长春花中提取并经半合成的一种生物碱类化合物，能抑制乳腺癌，支气管肺癌，神经母细胞瘤等多种肿瘤细胞增殖，主要通过作用肿瘤细胞微管蛋白而干扰肿瘤细胞代谢。异长春花碱几乎不溶于水，并且具有明显的毒副作用，其应用受到极大的限制。脂质体制剂可以明显改善其生物利用度，改变被包封药物的体内分布，使其具有一定的靶向特性。目前国内已有将长春花属生物碱制成静脉注射用微乳、长循环脂质体及脂质微球的专利，但未发现有将异长春花碱制备成多功能靶向脂质体的专利。

伐普肽（Vapreotide, VAP）是D-苯丙氨酰-半胱氨酰-酪氨酰-D-色氨酰-赖氮酰-缬氨酰-半胱氨酰-色氨酰胺-环^[2-7]-二硫醚单醋酸盐，是一种抑制脑垂体分泌生长激素的神经调节肽，属于生长抑素（SST）的一种。生长抑素受体（SSTR）广泛分布在各种实体瘤和神经内分泌的肿瘤中。与正常组织相比，肿瘤组织部位的生长抑素受体具有高表达的特点，生长抑素受体具有与生长抑素的高度亲和的能力，目前生长抑素已经作为肿瘤治疗的新的靶分子而在研究中被广泛应用。目前国内已有将伐普肽作为靶向配体的专利（CN101439182A），但未发现有将伐普肽与聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS₁₀₀₀）通过酰化反应结合而修饰在脂质体表面的专利。

聚乙烯亚胺 (polyethylenimine, PEI) 是一种高效的非病毒型递送载体，低分子量PEI分子表面具有高密度正电荷，可以与肿瘤微血管及肿瘤细胞表面所带的负电荷结合，从而实现高效、快速的靶向目的。目前，PEI作为非病毒基因载体已经被广泛的研究，但未发现有将聚乙烯亚胺与胆固醇-聚乙二醇-NHS（CHOL-PEG-NHS）通过缩合反应结合而修饰在脂质体表面的专利。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多功能靶向异长春花碱脂质体及其制备方法，能够使药物在跨过血脑屏障后靶向到脑胶质瘤部位，从而增加药物在脑肿瘤部位的分布，减小化疗药物的毒副作用，提高化疗的效果。

为实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案。

本发明提供一种多功能靶向异长春花碱脂质体，是由异长春花碱、脂材及功能性靶向配体组成的；所述脂质体为双分子层结构，内部具有水溶性空腔；所述异长春花碱包封在脂质体水溶性空腔中；所述脂材由卵磷脂（DPPC）、胆固醇（CHOL）、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG₂₀₀₀）组成；所述功能性靶向配体由脂质体表面的修饰物和脂质体双分子层中的靶向材料组成；所述脂质体双分子层中的靶向材料为粉防己碱（tetrandrine, TET），所述粉防已碱包封在脂质体双分子层中；所述脂质体表面的修饰物为伐普肽-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS₁₀₀₀-VAP）与胆固醇-聚乙二醇-聚乙烯亚胺（CHOL-PEG-PEI），所述TPGS₁₀₀₀-VAP通过酰化反应修饰在脂质体的表面，所述CHOL-PEG-PEI通过缩合反应修饰在脂质体的表面。

所述DPPC、CHOL、DSPE-PEG₂₀₀₀、TPGS₁₀₀₀-VAP和CHOL-PEG-PEI的物质的量之比为（55-65）:（18-22）:（3-3.5）:（1.3-1.8）:（1.3-1.8），所述异长春花碱与脂材的质量比为1:50-1:70，所述粉防己碱与脂材的质量比为1:10-1:30。

所述伐普肽-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS₁₀₀₀-VAP）是由伐普肽（VAP）中的氨基与经戊二酸活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的羧基（TPGS₁₀₀₀-COOH）发生酰化反应合成的，所述聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS₁₀₀₀）经戊二酸活化；所述酰化反应的缩合剂为碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），所述酰化反应的温度为20-25℃、时间为20-24h，所述酰化反应在二甲基亚砜（DMSO）溶剂中进行，所述酰化反应中VAP:TPGS₁₀₀₀-COOH:EDC:NHS=1:1:8:8（摩尔比）。

所述胆固醇-聚乙二醇-聚乙烯亚胺（CHOL-PEG-PEI）是由聚乙烯亚胺（PEI）中的氨基与胆固醇-聚乙二醇-NHS（CHOL-PEG-NHS）中的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）发生缩合反应合成的；所述缩合反应的温度为20-25℃，时间为30-36h，所述缩合反应可以在二甲基甲酰胺（DMF）溶剂中进行，DMF溶液用N-甲基吗啉调节pH为8.5-9.5，所述缩合反应中PEI:CHOL-PEG-NHS=5:1（摩尔比）。

所述TPGS₁₀₀₀-VAP与CHOL-PEG-PEI的合成方法还包括分别将两种化合物的反应液在去离子水中进行透析（截留值为2000 Da）纯化，然后将透析后的液体冻干得到两种靶向配体材料。

所述TPGS₁₀₀₀-VAP与CHOL-PEG-PEI为两种共轭化合物，均作为主动靶向的靶向配体，修饰在多功能靶向异长春花碱脂质体的表面，以增加所述脂质体跨越血脑屏障和主动识别靶向脑胶质瘤细胞的能力。

所述粉防己碱修饰在脂质体双分子层中，以克服肿瘤细胞的多药耐药性。

所述脂质体经过TPGS₁₀₀₀-VAP、CHOL-PEG-PEI和粉防己碱修饰，在顺利跨血脑屏障后，通过主动识别脑胶质瘤细胞和抑制脑胶质瘤细胞膜上的P-gP外排蛋白过度表达而发挥多重靶向的目的。

本发明还提供一种多功能靶向异长春花碱脂质体的制备方法，包括如下步骤。

步骤1、粉防己碱、TPGS₁₀₀₀-VAP、CHOL-PEG-PEI及脂材溶解于氯仿中，旋转蒸发除去氯仿，得到脂膜。

步骤2、将所述脂膜用硫酸铵溶液水化，水化液超声10min，然后使用脂质体挤出仪分别挤过400nm、200nm和100nm孔径的滤膜各3次，制备空白多功能靶向脂质体。

步骤3、将所述空白多功能靶向脂质体密封于透析袋（截留值10000-12000 Da）中，置磷酸盐缓冲液（PBS）中透析3次，每次12h。

步骤4、取处方量的异长春花碱，加至透析后的空白多功能靶向脂质体，置40℃恒温振荡器中，100r/min振摇30min，得到多功能靶向异长春花碱脂质体。

所述脂材由卵磷脂（DPPC）、胆固醇（CHOL）、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG₂₀₀₀）组成；所述DPPC、CHOL、DSPE-PEG₂₀₀₀、TPGS₁₀₀₀-VAP及CHOL-PEG-PEI的物质的量之比为（55-65）:（18-22）:（3-3.5）:（1.3-1.8）:（1.3-1.8）；所述异长春花碱与脂材的质量比为1:50-1:70，所述粉防己碱与脂材的质量比为1:10-1:30。

所述多功能靶向异长春花碱脂质体用于制备脑肿瘤细胞抑制剂。

所述脑肿瘤可为脑胶质瘤，具体可为C6胶质瘤。

所述多功能靶向异长春花碱脂质体粒径约为100nm，Zeta电位接近30mv。

与现有技术相比本发明的有益效果。

本发明提供的多功能靶向异长春花碱脂质体及其制备方法，通过将抗肿瘤药异长春花碱包封于脂质体水溶性空腔中，脂质体经过TPGS₁₀₀₀-VAP、CHOL-PEG-PEI和粉防己碱修饰，得到了一种全新的多功能靶向脂质体，该多功能靶向脂质体能够使药物在跨过血脑屏障后靶向到脑胶质瘤部位，避免了多药耐药现象的产生，从而增加了药物在脑肿瘤部位的分布，减小了化疗药物的毒副作用，提高了化疗的效果。本发明为脑胶质瘤化疗提供了一个新的对策，有助于对脑胶质瘤的非侵入性治疗的研究，具有重要的理论意义与临床意义。

附图说明

图1为本发明多功能靶向异长春花碱脂质体示意图。

图2A为TPGS₁₀₀₀-COOH的MALDI-TOF-MS图谱。

图2B为靶向配体TPGS₁₀₀₀-VAP的MALDI-TOF-MS图谱。

图3A为CHOL-PEG-NHS的MALDI-TOF-MS图谱。

图3B为靶向配体CHOL-PEG-PEI的MALDI-TOF-MS图谱。

图4A为多功能靶向异长春花碱脂质体的透射电镜照片。

图4B为多功能靶向异长春花碱脂质体原子力显微镜二维照片。

图4C为多功能靶向异长春花碱脂质体原子力显微镜三维照片。

图5A为多功能靶向异长春花碱脂质体的粒径分布图。

图5B为多功能靶向异长春花碱脂质体的Zeta电位图。

图6为不同脂质体对C6胶质瘤细胞的抗增殖作用。

图7为流式细胞仪测定C6胶质瘤细胞摄取异长春花碱的情况。

图8为激光共聚焦显微镜共定位测定C6胶质瘤细胞摄取异长春花碱的情况。

图9A为体外血脑屏障模型的结构示意图。

图9B为透过血脑屏障能力的测定图。

图10为不同脂质体对C6胶质瘤细胞细胞色素C释放的影响。

图11为不同脂质体对C6胶质瘤细胞细胞凋亡的影响。

图12A为不同脂质体对C6胶质瘤细胞凋亡酶Caspase 9的影响。

图12B为不同脂质体对C6胶质瘤细胞凋亡酶Caspase 3的影响。

图13为不同脂质体在C6胶质瘤干细胞球中的穿透能力情况。

图14为不同脂质体对C6胶质瘤干细胞球破坏的影响。

图15A为药物在ICR荷瘤小鼠活体状态下的组织分布情况。

图15B为药物在ICR荷瘤小鼠离体状态下的组织分布情况。

图16为C6胶质瘤小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。

具体实施方式

一、仪器与试药。

1.1、仪器：电子分析天平(AY220，日本岛津公司)；电热恒温水浴锅(HH-4，上海医疗器械五厂)；旋转蒸发器(RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂)；超声波细胞捣碎机(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)；脂质体挤出仪(LF-1，加拿大AVESTIN公司)；聚碳酸脂膜（孔径400nm、200nm、100nm，德国Whatman公司）；恒温振荡器（SHZ-82，上海仪纯实业有限公司）；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS,日本岛津公司）；激光散射粒径测定仪(Zetasizer 3000HS，英国马尔文公司)；透射电子显微镜（Tecnai G220ST, 美国FEI公司）；原子力扫描探针显微镜（SPI3800N,日本精工株式会社）；扫描电子显微镜(JSM-5600 LV,日本电子株式会社)；WJ-80B-Ⅱ二氧化碳细胞培养箱（WJ-80B-Ⅱ，上海新苗医疗器械有限公司）；超净工作台（AirTECH，中国苏净安泰公司）；倒置显微镜(XDS-1B，中国重庆光学电学仪器公司)；酶标仪(MR-96，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；激光共聚焦显微镜（SP8，德国LEICA公司）；流式细胞仪（FACSCalibur，美国Becton Dickinson 公司）；多功能小动物活体成像系统（FX，美国柯达公司）。

1.2、试剂与试药：聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG₂₀₀₀）、胆固醇-聚乙二醇-NHS（CHOL-PEG-NHS）、卵磷脂（DPPC）（日本油脂株式会社）；聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS₁₀₀₀）、聚乙烯亚胺（PEI）（美国Sigma公司）；戊二酸（国药集团化学试剂北京有限公司）；胆固醇（cholesterol，CHOL）（美国Avanti公司）；异长春花碱、粉防己碱（美仑生物技术有限公司）；碳二亚胺（EDC）（上海Medpep公司）；二甲基甲酰胺（DMF）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（北京腾达科技有限公司）；伐普肽（VAP）（上海楚肽生物科技有限公司）。

二、多功能靶向异长春花碱脂质体的制备与表征。

请参阅图1，图1为本发明多功能靶向异长春花碱脂质体示意图。本发明提供一种多功能靶向异长春花碱脂质体，是由异长春花碱、脂材及功能性靶向配体组成的；所述脂质体为双分子层结构，内部为水溶性空腔；所述异长春花碱包封在脂质体水溶性空腔中；所述功能性靶向配体由脂质体表面的修饰物和脂质体双分子层中的靶向材料组成；所述脂质体双分子层中的靶向材料为粉防己碱，所述粉防已碱包封在脂质体双分子层中；所述脂质体表面的修饰物为伐普肽-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS₁₀₀₀-VAP）与胆固醇-聚乙二醇-聚乙烯亚胺（CHOL-PEG-PEI），所述TPGS₁₀₀₀-VAP通过酰化反应修饰在脂质体的表面，所述CHOL-PEG-PEI通过缩合反应修饰在脂质体的表面。

2.1、TPGS₁₀₀₀-VAP和CHOL-PEG-PEI的合成与表征。

2.1.1、TPGS₁₀₀₀-VAP和CHOL-PEG-PEI的合成。

TPGS₁₀₀₀-VAP由经戊二酸活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯上的羧基TPGS₁₀₀₀-COOH和伐普肽上的氨基通过酰化缩合而成，以EDC和NHS为反应缩合剂。将10μmol TPGS₁₀₀₀-COOH、80μmol EDC和80μmol NHS溶解在2ml DMSO溶液中，加入10μmol伐普肽，将反应液在20-25℃下搅拌20-24h得粗产物，该粗产物转移到透析袋（截留分子量2000 Da），在去离子水中透析48h，除去未反应的原料。接下来将透析后的产物冷冻干燥，得到干燥的产物混合物白色粉末。

CHOL-PEG-PEI由CHOL-PEG-NHS上的NHS和PEI上的氨基通过缩合而成，将40μmol PEI和8μmol CHOL-PEG-NHS溶解在2ml DMF溶液中，将反应液用N-甲基吗啉调节pH至9.0，将反应液在20-25℃下搅拌30-36h得粗产物，该粗产物转移到透析袋（截留分子量2000 Da），在去离子水中透析48h，除去未反应的原料。接下来将透析后的产物冷冻干燥，得到干燥的产物混合物白色粉末。

2.1.2、TPGS₁₀₀₀-VAP和CHOL-PEG-PEI的表征。

所述TPGS₁₀₀₀-VAP和CHOL-PEG-PEI均为共轭化合物，分别将两种共轭化合物通过基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行检测，如图2A、2B、3A、3B所示，图2A为TPGS₁₀₀₀-COOH的MALDI-TOF-MS图谱，图2B为靶向配体TPGS₁₀₀₀-VAP的MALDI-TOF-MS图谱，图3A为CHOL-PEG-NHS的MALDI-TOF-MS图谱，图3B为靶向配体CHOL-PEG-PEI的MALDI-TOF-MS图谱。请参阅图2A与图2B，TPGS₁₀₀₀-COOH的加钠质谱峰1710.02 Da，终产物中TPGS₁₀₀₀-VAP的加钾平均分子质量为2859.65 Da，两者分子量的差值接近VAP的分子质量1131.37 Da。请参阅图3A与图3B，CHOL-PEG-NHS的分子量为2463.72 Da，终产物中CHOL-PEG-PEI的加钾平均分子质量为3062.96 Da，两者分子量的差值接近PEI的分子质量600.00 Da。

2.2、不同脂质体的制备。

2.2.1、多功能靶向异长春花碱脂质体的制备。

步骤1、粉防己碱、TPGS₁₀₀₀-VAP、CHOL-PEG-PEI及脂材溶解于氯仿中，旋转蒸发除去氯仿，得到脂膜。所述DPPC、CHOL、DSPE-PEG₂₀₀₀、TPGS₁₀₀₀-VAP和CHOL-PEG-PEI按物质的量之比为60:20:3:1.5:1.5溶解在氯仿中，氯仿液中加入粉防己碱，粉防已碱与脂材的质量比为1:20，超声使其溶解，旋转蒸发除去氯仿，在40℃、100rpm条件下旋蒸形成薄膜，即得脂膜。

步骤2、将所述脂膜用5ml硫酸铵溶液水化，水化液超声10min，使脂膜分散在水化液中，然后水化液使用脂质体挤出仪分别挤过400nm、200nm和100nm孔径的滤膜各3次，制备空白多功能靶向脂质体。

步骤3、空白多功能靶向脂质体密封于透析袋（截留值10000-12000 Da）中，置磷酸盐缓冲液（PBS）中透析3次，每次12h。

步骤4、取异长春花碱，异长春花碱与脂材的质量比为1:60，加至透析后的空白多功能靶向脂质体，置40℃恒温振荡器中，100r/min振摇30min，得到所述多功能靶向异长春花碱脂质体。

2.2.2、不同靶向配体修饰的脂质体的制备。

为与本发明多功能靶向异长春花碱脂质体进行比较，制备了伐普肽修饰的异长春花碱脂质体（VAP修饰异长春花碱脂质体）、聚乙烯亚胺修饰的异长春花碱脂质体（PEI修饰异长春花碱脂质体）及粉防己碱修饰的异长春花碱脂质体（TET修饰异长春花碱脂质体）作为对照组，进行功能效果比对。

VAP修饰异长春花碱脂质体采用上述相同的方法制备，其中靶向配体CHOL-PEG-PEI用CHOL-PEG-NHS代替，且不加入粉防己碱。

PEI修饰异长春花碱脂质体采用上述相同的方法制备，其中靶向配体TPGS₁₀₀₀-VAP用TPGS₁₀₀₀代替，且不加入粉防己碱。

TET修饰异长春花碱脂质体通过上述相同的方法制备，其中靶向配体CHOL-PEG-PEI和TPGS₁₀₀₀-VAP分别用CHOL-PEG-NHS和TPGS₁₀₀₀代替。

2.2.3、荧光探针脂质体的制备。

为了考察多功能靶向脂质体在荷瘤小鼠体内外靶向性及其靶向机理，选择香豆素、柔红霉素和DiR作为荧光探针，分别制备不同的荧光探针脂质体。其中香豆素脂质体、VAP修饰香豆素脂质体、PEI修饰香豆素脂质体、TET修饰香豆素脂质体及多功能靶向香豆素脂质体（香豆素与脂材的质量比1:200）；柔红霉素脂质体、VAP修饰柔红霉素脂质体、PEI修饰柔红霉素脂质体、TET修饰柔红霉素脂质体及多功能靶向柔红霉素脂质体（柔红霉素与脂材的质量比1:20）；DiR脂质体、VAP修饰DiR脂质体、PEI修饰DiR脂质体、TET修饰DiR脂质体及多功能靶向DiR脂质体（DiR与脂材的质量比1:300）分别按照上述相同的方法制备，其中异长春花碱分别用香豆素、柔红霉素和DiR代替。

2.3、脂质体的表征。

将所制备的各种脂质体分别通过Sephadex G-100柱分离游离异长春花碱，并按照以下公式计算异长春花碱的包封率：EE=(W_i/W_total)×100%，其中，W_i是过Sephadex G-100柱后被甲醇破坏的脂质体中异长春花碱的质量，W_total是相同体积的脂质体直接经过甲醇破坏后的异长春花碱质量。

脂质体表面及形态使用透射电子显微镜及原子力扫描探针显微镜进行观察。请参阅图4A、图4B与图4C，其中，图4A为多功能靶向异长春花碱脂质体的透射电子显微镜的照片，图4B为多功能靶向异长春花碱脂质体的原子力扫描探针显微镜的二维照片，图4C为多功能靶向异长春花碱脂质体的原子力扫描探针显微镜的三维照片。

采用激光散射粒径测定仪测定各种脂质体的粒径和Zeta电位。请参阅图5A与图5B，其中，图5A为多功能靶向异长春花碱脂质体的粒径分布图，图5B为多功能靶向异长春花碱脂质体的Zeta电位图。

脂质体的表征结果见表1。

表1：脂质体的表征结果。

 异长春花碱包封率(%)粉防己碱包封率(%)粒径（nm）PDIZeta电位（mV）空白多功能靶向脂质体088.32±1.4590.59±2.530.185±0.01227.65±3.65异长春花碱脂质体93.65±3.24093.34±1.430.184±0.022-0.17±0.09VAP修饰异长春花碱脂质体91.46±1.64095.42±1.260.194±0.032-1.03±0.11PEI修饰异长春花碱脂质体95.64±2.430100.11±1.070.175±0.00230.42±3.65TET修饰异长春花碱脂质体91.87±2.2287.42±1.4594.64±1.540.199±0.023-0.09±0.06多功能靶向异长春花碱脂质体93.65±1.3190.65±1.1299.35±2.130.165±0.03228.95±1.42

由表1可知，上述激光散射粒径测定仪测定的各脂质体的平均粒径约为100nm，多分散系数PDI均小于0.2，异长春花碱和粉防己碱在各脂质体中的包封率分别大于91%和87%，PEI修饰异长春花碱脂质体和多功能靶向异长春花碱脂质体的Zeta电位均大于25mv，其他脂质体都略显中性。由图4A、4B与4C可见，多功能靶向异长春花碱的粒径均在100nm左右，与激光散射粒径测定仪测定的结果相符。

三、脂质体体外靶向作用评价。

3.1、细胞培养。

鼠C6胶质瘤细胞生长在F10培养液（含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）中。

鼠源性脑毛细血管内皮细胞（BMEVC）生长在于DMEM培养液（内含20%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mmol/l l-谷胺酰胺、100μg/ml内皮生长因子和40U/ml肝素）中。

C6脑胶质瘤干细胞球培养在DMEM-F12无酚红培养液（含2% B27、20μg/ml bFGF、20μg/ml EGF）中。上述各细胞的培养均为条件37℃和5%CO₂。

3.2、细胞毒作用。

对数生长期的C6胶质瘤细胞接种于96孔细胞培养板中（5×10³个/孔），在37℃、5%CO₂培养箱中孵育24h。用无血清F10培养液配制系列浓度的不同靶向配体修饰的异长春花碱脂质体。每孔加入不同组别的药物溶液20μl，异长春花碱的最终浓度为0-0.1μM，用空白培养基作为对照组。加药后的96孔培养板，继续孵育48h。孵育完毕后，用乙酰罗丹明B法评价不同实验组中异长春花碱对细胞的抑制作用，各实验组细胞的生存率用下式计算：生存率=实验组细胞吸光度540nm/对照组细胞吸光度540nm×100%。结果见图6，图6为不同脂质体对C6胶质瘤细胞的抗增殖作用。由图6可知，在所有的实验组中，在各个给药浓度下（0.005μM、0.01μM、0.02μM、0.04μM、0.08μM、0.1μM），多功能靶向异长春花碱脂质体均具有最强的抑制C6脑胶质瘤细胞增殖的作用。同时，空白多功能靶向脂质体表现出轻微的细胞毒作用，表明多功能靶向异长春花碱脂质体的细胞抑制作用主要来自于细胞对异长春花碱摄取量的增加。

3.3、脂质体体外靶向性评价。

3.3.1、流式细胞仪测定细胞摄取。

将对数生长期的C6脑胶质瘤细胞接种到6孔细胞培养板中（5×10⁵个/孔），在5%CO₂，37℃的条件下培养24h后，分别加入不同靶向配体修饰的柔红霉素脂质体（柔红霉素作为荧光探针，与激光共聚焦显微镜测定细胞摄取实验时用的荧光探针保持一致），柔红霉素的终浓度为5.0μM，空白F10培养基作为对照组。加药后的6孔培养板，继续孵育3h。孵育完毕后，洗涤、消化并收集细胞。细胞摄取量用流式细胞仪测定，每个样品收集细胞数10000个，用荧光强度表示细胞的摄取量。结果见图7，图7为流式细胞仪测定C6胶质瘤细胞摄取异长春花碱的情况，图7中a为空白对照组、b为柔红霉素脂质体组、c为VAP修饰柔红霉素脂质体组、d为TET修饰柔红霉素脂质体组、e为PEI修饰柔红霉素脂质体组、f为多功能靶向柔红霉素脂质体组。结果显示，给药并孵育3h后，空白对照组、柔红霉素脂质体、VAP修饰柔红霉素脂质体、TET修饰柔红霉素脂质体、PEI修饰柔红霉素脂质体及多功能靶向柔红霉素脂质体在C6脑胶质瘤细胞中的平均荧光强度分别为3.35±0.52、98.68±4.23、291.81±21.42、193.44±8.64、319.63±26.74、589.53±52.53，表明多功能靶向脂质体组具有明显的增加C6脑胶质瘤细胞摄取的能力。

3.3.2、细胞共定位研究。

利用激光共聚焦显微镜观察多功能靶向异长春花碱脂质体在C6脑胶质瘤细胞中的分布情况。将对数生长期的C6脑胶质瘤细胞接种到共聚焦培养皿中（3×10⁵个细胞/皿），在5%CO₂，37℃的条件下培养24h后，分别加入不同靶向配体修饰的柔红霉素脂质体（柔红霉素作为荧光探针，可以观察出药物在细胞质或细胞核中的具体分布），柔红霉素的终浓度为5.0μM，F10培养基作为空白对照组。给药后各实验组继续孵育4h。孵育完毕后，细胞用磷酸盐缓冲液轻轻漂洗3次，样品用激光共聚焦显微镜进行图像分析。结果见图8，图8为激光共聚焦显微镜共定位测定C6胶质瘤细胞摄取异长春花碱的情况。由图8可知，柔红霉素普通脂质体只能部分的分布在C6脑胶质瘤细胞的细胞质中，而多功能靶向柔红霉素脂质体可以将药物明显的分布在C6脑胶质瘤细胞的细胞核和细胞质中。该结果与流式细胞仪测定细胞摄取结果一致。

3.4、跨越血脑屏障研究。

3.4.1、体外血脑屏障建立。

鼠脑内皮细胞（BMVEC细胞）接种在细胞插入器中（3×10⁴个/细胞插入器），细胞插入器以2%的明胶包被，连续培养7天，每两天更换一次培养液，7天后测量模型的电阻，当电阻大于250Ω·cm²后体外血脑屏障模型可以用于随后的实验。请参阅图9A，为体外血脑屏障模型的结构示意图。

3.4.2、透过血脑屏障能力的测定。

将对数生长期的C6脑胶质瘤细胞接种到12孔细胞培养板中（2×10⁵个/孔），在5%CO₂，37℃的条件下培养24 h，在细胞插入器上分别接种BMVEC细胞，当电阻大于250Ω·cm²时，将细胞插入器置于事先接种C6脑胶质瘤细胞的12孔培养板上，细胞插入器上池中分别加入游离异长春花碱或不同靶向配体修饰的异长春花碱脂质体，异长春花碱最终浓度为0.5μΜ，加入空白F10培养基作为对照组，孵育2h后移去细胞插入器，12孔细胞培养板继续孵育48h，孵育完毕后乙酰罗丹明B法测定各组中C6脑胶质瘤细胞的存活情况。结果见图9B，图9B为透过血脑屏障能力的测定图，图9B中1为游离异长春花碱、2为异长春花碱脂质体、3为VAP修饰异长春花碱脂质体、4为PEI修饰异长春花碱脂质体、5为TET修饰异长春花碱脂质体、6为多功能靶向异长春花碱脂质体。结果显示，游离异长春花碱、异长春花碱脂质体、VAP修饰异长春花碱脂质体、TET修饰异长春花碱脂质体、PEI修饰异长春花碱脂质体及多功能靶向异长春花碱脂质体，在跨越体外血脑屏障后对C6脑胶质瘤细胞的生存率分别为88.43±7.85%、73.65±5.87%、61.64±6.33%、54.34±5.23%、64.54±3.54%、40.43±1.34%，表明多功能靶向异长春花碱脂质体组可以显著增加药物跨越血脑屏障，然后明显的抑制C6脑胶质瘤细胞的生长。

3.5、体外靶向机制的评价。

3.5.1、细胞色素C的释放。

免疫组化法测定C6脑胶质瘤细胞释放细胞色素C的情况，将对数生长期的C6脑胶质瘤细胞接种到共聚焦培养皿中（2×10⁵个/皿），在5%CO₂，37℃的条件下培养24h后，分别加入不同靶向配体修饰的异长春花碱脂质体，异长春花碱的终浓度为0.5μM，F10培养基作为空白对照组。孵育12h后，细胞用PBS轻轻漂洗3次，0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）处理，3%H₂O₂消除内源性干扰，然后按照SP免疫组化试剂盒操作说明分别加入封闭用正常山羊血清工作液封闭，细胞色素C抗体并孵育过夜，生物素标记的二抗，辣根酶标记链酶卵白素工作液。最后加入二氨基联苯胺（DAB）试剂显色，苏木素复染细胞核，于光学显微镜下观察。结果如图10所示，图10为不同脂质体对C6胶质瘤细胞细胞色素C释放的影响，图10中A为空白对照组、B为异长春花碱脂质体组、C为VAP修饰异长春花碱脂质体组、D为PEI修饰异长春花碱脂质体组、E为TET修饰异长春花碱脂质体组、F为多功能靶向异长春花碱脂质体组，细胞色素C在通过染色后在光镜下观察为棕色。和其他各对照组比较，多功能靶向异长春花碱脂质体能引起大量的细胞色素C的释放，释放出来的细胞色素C最终诱导了C6脑胶质瘤细胞的凋亡。

3.5.2、细胞凋亡的评价。

细胞凋亡采用Annexin V-FITC试剂盒染色，流式细胞仪检测。将对数生长期的C6脑胶质瘤细胞接种到6孔培养板中（3×10⁵个/孔），孵育24h后，给予不同配体修饰的异长春花碱脂质体，异长春花碱的终浓度分别为0.5μM，空白F10培养基作为对照组，加药后的6孔培养板，置于37℃、5%CO₂培养箱中，孵育24h后，消化并收集细胞，并将细胞分散于结合液中，按照试剂盒操作说明加入Annexin V-FITC，避光孵育15min，检测前5min加入碘化丙啶（Propidium iodide，PI），流式细胞仪检测细胞中的荧光强度（收集10000个细胞）。结果见图11，图11为不同脂质体对C6胶质瘤细胞细胞凋亡的影响，图11中A为空白对照组、B为异长春花碱脂质体组、C为VAP修饰异长春花碱脂质体组、D为PEI修饰异长春花碱脂质体组、E为TET修饰异长春花碱脂质体组、F为多功能靶向异长春花碱脂质体组。与其他对照组相比，多功能靶向异长春花碱脂质体组可以显著增加凋亡细胞的比例（早期凋亡和晚期凋亡的总和）。

3.5.3、细胞凋亡酶的测定。

细胞凋亡酶的活性通过ELISA试剂盒进行检测。将对数生长期的C6脑胶质瘤细胞接种到6孔培养板中（3×10⁵个孔），孵育24h后，给予不同配体修饰的异长春花碱脂质体，异长春花碱的终浓度分别为0.5μM，空白F10培养基作为对照组，孵育12h后将细胞消化、裂解，细胞裂解液在4℃下10000 rpm离心10min，上清液采用BCA法检测总蛋白含量。上清样品加入到含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase 3）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（Caspase 9）试剂盒中，按照试剂盒的说明书进行操作，最后用酶标仪测量样品的吸光度值（λ= 450nm）并通过下式计算Caspase 3或Caspase 9的活性。凋亡酶活性=(OD给药组/C1)/(OD对照组/C2)。式中OD给药组和OD对照组分别代表给药组和对照组的吸光度值，C1和C2分别为给药组和对照组的总蛋白的浓度。结果见图12A与图12B，图12A为不同脂质体对C6胶质瘤细胞凋亡酶Caspase 9的影响，图12B为不同脂质体对C6胶质瘤细胞凋亡酶Caspase 3的影响，图12A与图12B中1均为空白对照组、2均为异长春花碱脂质体组、3均为VAP修饰异长春花碱脂质体组、4均为PEI修饰异长春花碱脂质体组、5均为TET修饰异长春花碱脂质体组、6均为多功能靶向异长春花碱脂质体组。结果显示C6脑胶质瘤细胞在给予异长春花碱脂质体、VAP修饰异长春花碱脂质体、TET修饰异长春花碱脂质体、PEI修饰异长春花碱脂质体及多功能靶向异长春花碱脂质体后Caspase 3的活性分别为3.86±0.76%、4.32±0.55%、5.34±0.46%、4.89±0.13%和5.84±0.36%，Caspase 9的活性分别为1.46±0.28%、2.48±0.33%、3.19±0.15%、2.79±0.37%和3.87±0.18%，表明多功能靶向异长春花碱脂质体组可以显著诱导凋亡蛋白酶Caspase 3或Caspase 9的活性，从而导致C6脑胶质瘤细胞启动自杀凋亡程序。

3.6、C6脑胶质瘤干细胞球的评价。

3.6.1、C6脑胶质瘤干细胞球穿透作用的评价。

采用无血清培养法培养C6脑胶质瘤干细胞球。将连续培养3周后的C6脑胶质瘤干细胞球加入到共聚焦小皿中，分别向共聚焦小皿中加入不同靶向配体修饰的香豆素脂质体（香豆素作为荧光探针），香豆素的最终浓度为0.5μM，孵育12h后，小心弃去培养液，冷PBS溶液轻轻洗涤三次，每皿再加入100μl PBS溶液，C6脑胶质瘤干细胞球采用激光共聚焦显微镜从干细胞球顶部到中央以5μm的间隔进行层切，研究不同层面的香豆素荧光强度。结果见图13，图13为不同脂质体在C6胶质瘤干细胞球中的穿透能力情况。由图13可知：多功能靶向香豆素脂质体在各个层切面均显示出最强的荧光强度，并且多功能靶向香豆素脂质体可以顺利穿透脑胶质瘤干细胞球到达干细胞球的核心。

3.6.2、C6脑胶质瘤干细胞球的破坏性评价。

将连续培养3周后的C6脑胶质瘤干细胞球加入到共聚焦小皿中，分别向共聚焦小皿中加入不同靶向配体修饰的异长春花碱脂质体，异长春花碱的最终浓度为0.5μM，F10培养基作为空白对照，孵育48h后，小心弃去培养液，干细胞球用2.5%戊二醛固定1h，冷磷酸盐溶液轻轻洗涤三次，将样品置于扫描电子显微镜观察，结果见图14，图14为不同脂质体对C6胶质瘤干细胞球破坏的影响，图14中A1为空白对照组（放大350倍）、A2为空白对照组（放大1800倍）、B1为异长春花碱脂质体组（放大350倍）、B2为异长春花碱脂质体组（放大1800倍）、C1为VAP修饰异长春花碱脂质体组（放大350倍）、C2为VAP修饰异长春花碱脂质体组（放大1800倍）、D1为PEI修饰异长春花碱脂质体组（放大350倍）、D2为PEI修饰异长春花碱脂质体组（放大1800倍）、E1为TET修饰异长春花碱脂质体组（放大350倍）、E2为TET修饰异长春花碱脂质体组（放大1800倍）、F1为多功能靶向异长春花碱脂质体组（放大350倍）、F2为多功能靶向异长春花碱脂质体组（放大1800倍）。结果显示，空白对照组细胞球的结构紧密排列，各个细胞圆整，而多功能靶向异长春花碱脂质体组可见明显的细胞裂断与收缩，并且干细胞球表面模糊，显示出明显的干细胞球破坏能力。

四、脂质体体内药效学评价。

4.1、荷瘤小鼠模型的建立。

ICR小鼠（雄性，体重18-22g），用4%水合氯醛麻醉（0.2 ml/只），将麻醉后的小鼠固定于脑立体定位仪上。下列实验步骤均在无菌条件下进行，头颅消毒，沿内眦连线中点向后纵向切开头皮，暴露颅骨。在颅骨的前囟后1.0mm，矢状缝右侧2.0mm的位点上，颅钻钻孔，将对数生长期的C6脑胶质瘤细胞重新悬浮于3μl无血清的F10培养基中（8×10⁴个/μl），微量注射器垂直进针3.5mm，静置1min，返回0.5mm，将细胞悬液注入脑内，留针5min，骨孔用无菌骨蜡封闭，清除手术创面，手术线逢合伤口。

4.2、荷瘤小鼠活体成像研究。

荷瘤小鼠模型建立14天后，选择造模成功的ICR小鼠21只，随机分成7组，每组3只，分别给予游离DiR和不同配体修饰的DiR脂质体（2.0mg/kg），生理盐水作为空白对照组。给药后1h、3h、6h、9h、12h、24h和48h，采用小动物活体成像系统照相。并于48h后，脱颈椎处死小鼠，立即解剖出心、肝、脾、肺、肾和脑组织，分别对不同组织进行成像。结果见图15A与图15B，图15A为药物在ICR荷瘤小鼠活体状态下的组织分布情况，图15B为药物在ICR荷瘤小鼠离体状态下的组织分布情况。由图15可知，尾静脉注射多功能靶向DiR脂质体后在每个时间点，均可以观察到荷瘤小鼠脑组织部位的强烈DiR荧光信号，离体组织DiR分布表明，多功能靶向DiR脂质体可以明显将包封的药物聚集于脑肿瘤部位，从而显现出多功能靶向脂质体的肿瘤组织的靶向性。

4.3、荷瘤小鼠药效学研究。

荷瘤小鼠模型建立14天后，选择造模成功的ICR小鼠36只，随机分成6组，分别给予不同配体修饰的异长春花碱脂质体（0.5mg/kg），每天对荷瘤小鼠的生存状态进行观察，记录各组实验动物的活动情况和死亡时间，并绘制卡普兰-迈耶生存曲线（Kaplan-Meier survival curves），结果见图16，图16为C6胶质瘤小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线，图16中a为空白对照组、b为异长春花碱脂质体组、c为VAP修饰异长春花碱脂质体组、d为PEI修饰异长春花碱脂质体组、e为TET修饰异长春花碱脂质体组、f为多功能靶向异长春花碱脂质体组。由图16可知，多功能靶向异长春花碱脂质体组可以明显延长荷瘤小鼠的生存时间。

综上所述，本发明利用大鼠源C6脑胶质瘤细胞，C6脑胶质瘤干细胞球，C6脑胶质瘤细胞ICR小鼠原位移植瘤模型进行评价。多功能靶向异长春花碱脂质体可以明显提高载体跨越血脑屏障的能力；显著增加C6脑胶质瘤细胞对药物的摄取；多功能靶向异长春花碱脂质体通过诱导细胞色素C释放及激活Caspase3和9来诱导C6脑胶质瘤细胞的凋亡；多功能靶向异长春花碱脂质体具有明显的荷瘤小鼠脑组织靶向定位的能力及可以明显的延长C6脑胶质瘤荷瘤小鼠的生存时间。