杀菌剂、口腔用杀菌剂、杀菌方法、杀菌装置及杀菌剂的评价方法

摘要

提供能够提高杀菌效果的杀菌剂、口腔用杀菌剂、杀菌方法、杀菌装置及杀菌剂的评价方法。使包含过氧化氢、以及含有黄芩或绿茶的过氧化氢酶活性抑制剂的杀菌剂接触口腔内的牙齿、假牙等杀菌对象。然后，利用包含半导体激光器的发光单元，对杀菌对象照射具有350nm～500nm的波长的光。从而，过氧化氢发生光分解、产生羟自由基，能够利用所产生的羟自由基进行杀菌。

说明书

技术领域

本发明涉及杀菌剂、口腔用杀菌剂、杀菌方法、杀菌装置及杀菌 剂的评价方法。

背景技术

作为现有的杀菌方法，有使过氧化氢等氧化剂接触杀菌对象、对 杀菌对象照射400nm～1000nm的波长的光的方法(参照例如专利文 献1)。根据该方法，对过氧化氢照射400nm～1000nm的波长的光、 使其产生羟自由基，能够利用该羟自由基进行杀菌。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开2008-284312号公报

发明内容

本发明要解决的技术问题

专利文献1所述的方法存在如下课题：在存在于杀菌对象中的细 胞、微生物所具有的过氧化氢酶作用下，部分过氧化氢发生分解，因 此对这些细胞、微生物的杀菌效果下降。

本发明正是着眼于这样的课题而做出的，目的在于提供能够提高 杀菌效果的杀菌剂、口腔用杀菌剂、杀菌方法、杀菌装置及杀菌剂的 评价方法。

解决技术问题的技术手段

本发明人等发现，存在于杀菌对象中的细胞、微生物所具有的过 氧化氢酶，使生成具有高抗菌性的羟自由基的基质即过氧化氢分解。 本发明人等使用为过氧化氢酶阳性的细菌及真菌的金黄色葡萄球菌 (Streptococcus aureus)ATCC12693及白色念珠菌(Candida albicans) JCM9061，对于它们与羟自由基的反应测定DMPO-OH的变化并通 过双倒数作图(Lineweaver-Burk Plot)进行解析。将其结果示于图1。

如图1所示，发现：菌的细胞数不同的所有直线在1/DMPO浓度 的负数侧相交，不仅金黄色葡萄球菌及白色念珠菌与羟自由基反应， 而且这些微生物所具有的过氧化氢酶也与过氧化氢反应。予以说明， 若金黄色葡萄球菌及白色念珠菌仅与羟自由基反应则菌的细胞数不 同的所有直线在1/DMPO-OH浓度轴上相交，若过氧化氢酶仅与过氧 化氢反应则菌的细胞数不同的所有直线应当平行。

需要说明的是，图1所示的实验如下实施，即，在对金黄色葡萄 球菌及白色念珠菌的细胞数进行各种改变的200μL(微升)菌液的各 试样中，加入25～300mM的自由基捕捉剂：DMPO (5,5-Dimethyl-pyrrolin-N-oxide，5,5-二甲基-吡咯啉-N-氧化物)50μL， 再加入0.5M的过氧化氢450μL，然后照射波长400±20nm的LED光 1分钟，1分钟后进行ESR(电子自旋共振)测定。

本发明人等由图1所示的结果，获得了通过加入过氧化氢酶活性 抑制剂来降低细胞、微生物的过氧化氢酶活性，从而能够进行有效的 羟自由基杀菌的见解，直至完成本发明。

即，本发明的杀菌剂的特征为，包含过氧化氢和过氧化氢酶活性 抑制剂。

本发明的口腔用杀菌剂的特征为，包含过氧化氢和过氧化氢酶活 性抑制剂。

本发明的杀菌剂及口腔用杀菌剂按照下述方式使用。首先，将本 发明的杀菌剂及口腔用杀菌剂涂布或喷雾到杀菌对象上使其接触杀 菌对象。此时，由于包含过氧化氢酶活性抑制剂，因此即使杀菌对象 中存在过氧化氢酶阳性细菌和真菌等细胞、微生物，也能够降低它们 的过氧化氢酶活性，能够防止过氧化氢酶与过氧化氢反应。

然后，对杀菌对象照射规定波长的光。从而，过氧化氢发生光分 解、产生羟自由基，因此能够利用所产生的羟自由基进行杀菌。此时， 能够通过过氧化氢酶活性抑制剂降低存在于杀菌对象中的细胞、微生 物的过氧化氢酶活性，因此能够防止通过过氧化氢酶与过氧化氢反应 而产生的羟自由基减少。

由此，本发明的杀菌剂及口腔用杀菌剂，能够通过过氧化氢酶活 性抑制剂防止产生羟自由基的过氧化氢与存在于杀菌对象中的细胞、 微生物所具有的过氧化氢酶反应而减少，结果防止由过氧化氢产生的 羟自由基的减少，因此能够提高利用羟自由基实现的杀菌效果。

本发明的杀菌方法的特征为，使过氧化氢和过氧化氢酶活性抑制 剂接触杀菌对象，对前述杀菌对象照射具有350nm～500nm的波长的 光。

本发明的杀菌方法，在使过氧化氢和过氧化氢酶活性抑制剂接触 杀菌对象时，即使杀菌对象中存在过氧化氢酶阳性细菌、真菌等细胞、 微生物，也能够通过过氧化氢酶活性抑制剂降低它们的过氧化氢酶活 性，能够防止过氧化氢酶与过氧化氢反应。

此外，通过对杀菌对象照射具有350nm～500nm的波长的光，过 氧化氢发生光分解、产生羟自由基，因此能够利用所产生的羟自由基 进行杀菌。此时，由于能够通过过氧化氢酶活性抑制剂降低存在于杀 菌对象中的细胞、微生物的过氧化氢酶活性，因此能够防止过氧化氢 酶与过氧化氢反应而产生的羟自由基的减少。

从而，根据本发明的杀菌方法，能够通过过氧化氢酶活性抑制剂， 防止产生羟自由基的过氧化氢与存在于杀菌对象中的细胞、微生物所 具有的过氧化氢酶反应而减少，结果防止由过氧化氢产生的羟自由基 的减少，因此能够提高利用羟自由基实现的杀菌效果。

本发明的杀菌方法中，使过氧化氢和过氧化氢酶活性抑制剂接触 杀菌对象的方法可以为涂布或喷雾本发明的杀菌剂及口腔用杀菌剂 的方法、将杀菌对象浸渍在本发明的杀菌剂的溶液中的方法等任意方 法。

本发明的杀菌装置的特征为，具有过氧化氢、过氧化氢酶活性抑 制剂和发光单元，所述发光单元设置为能够对接触了前述过氧化氢和 前述过氧化氢酶活性抑制剂的杀菌对象照射具有350nm～500nm的波 长的光。

本发明的杀菌装置能够适当实施本发明的杀菌方法。根据本发明 的杀菌装置，能够通过过氧化氢酶活性抑制剂，防止产生羟自由基的 过氧化氢与存在于杀菌对象中的细胞、微生物所具有的过氧化氢酶反 应而减少，结果防止由过氧化氢产生的羟自由基的减少，因此能够提 高利用羟自由基实现的杀菌效果。

本发明的杀菌装置中，过氧化氢及过氧化氢酶活性抑制剂也可以 由本发明的杀菌剂或口腔用杀菌剂构成。此外，本发明的杀菌装置中， 杀菌对象包括口腔内的牙齿、假牙等，过氧化氢酶活性抑制剂也可以 由包含过氧化氢酶活性抑制剂的牙膏、漱口水等构成。此时，在用该 牙膏刷牙等、或用漱口水漱口之后，使杀菌对象接触过氧化氢、利用 发光单元照射光，从而使用。

本发明的杀菌方法及杀菌装置中，照射光的发光单元只要能够照 射具有350nm～500nm的波长的光即可，可以是任意发光单元，例如 发热灯、荧光灯、卤素灯、氙灯、LED(发光二极管)、半导体激光 器等。所照射的光只要具有350nm～500nm的波长即可，既可以为单 一波长，也可以包含多种波长，还可以由规定带宽的波长构成。

本发明的杀菌剂、口腔用杀菌剂、杀菌方法及杀菌装置中，过氧 化氢酶活性抑制剂优选包含例如黄芩、绿茶、茴香、枇杷、甘草、芦 荟、鼠尾草、金缕梅、洋甘菊、迷迭香、蜜蜂花或桃。特别优选包含 过氧化氢酶活性抑制效果高的黄芩或绿茶。

本发明的杀菌剂的评价方法的特征为，对采集自接触了本发明的 杀菌剂后的杀菌对象的试样和4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧化物 (TEMPOL)的混合液，进行电子自旋共振(ESR)测定，基于所获 得的电子自旋共振(ESR)谱的线宽，测定前述试样中包含的细胞或 微生物的过氧化氢酶活性，对前述杀菌剂的杀菌效果进行评价。

由于过氧化氢酶催化过氧化氢分解为水和氧的反应，因此本发明 的杀菌剂的评价方法中，利用ESR测氧法测定该反应所产生的氧， 从而测定过氧化氢酶活性。此外，由于TEMPOL的ESR谱的线宽和 过氧化氢酶浓度之间可以视为正相关关系，因此可以基于ESR谱的 线宽测定试样中包含的细胞或微生物的过氧化氢酶活性，对杀菌剂的 杀菌效果进行评价。需要说明的是，杀菌剂可以为本发明的口腔用杀 菌剂。

发明效果

根据本发明，可以提供能够提高杀菌效果的杀菌剂、口腔用杀菌 剂、杀菌方法、杀菌装置及杀菌剂的评价方法。

附图说明

图1为示出通过过氧化氢的光分解而生成的羟自由基和(a)金 黄色葡萄球菌的反应动态解析、与(b)白色念珠菌的反应动态解析 的图。

图2为示出基于本发明的实施方式的杀菌剂评价方法的、过氧化 氢酶浓度和TEMPOL的ESR谱的线宽的关系的图。

图3为示出研究作为本发明的实施方式的杀菌剂的过氧化氢酶 活性抑制剂的用途的各种生药的、过氧化氢酶活性的抑制作用的图。

图4为示出本发明的实施方式的杀菌剂的过氧化氢酶活性抑制 剂的、对金黄色葡萄球菌的基于黄芩的杀菌效果的增强效果的图(图 中的H表示过氧化氢、L表示激光照射、O表示黄芩(1mg/mL)、+ 表示有、-表示无)。

图5为表示本发明的实施方式的杀菌剂的过氧化氢酶活性抑制 剂的、对金黄色葡萄球菌的基于黄芩浓度的杀菌效果的图。

图6为表示本发明的实施方式的杀菌剂的过氧化氢酶活性抑制 剂的对(a)金黄色葡萄球菌、(b)白色念珠菌的基于黄芩浓度的杀 菌效果的图，对(c)金黄色葡萄球菌、(d)白色念珠菌的基于绿茶 浓度的杀菌效果的图(图中的H表示过氧化氢、L表示激光照射、+ 表示有、-表示无)。

具体实施方式

下面对本发明的实施方式的杀菌剂、杀菌方法、杀菌装置及杀菌 剂的评价方法进行说明。

本发明的实施方式的杀菌装置具有本发明的杀菌剂和发光单元。

杀菌剂包含过氧化氢和过氧化氢酶活性抑制剂。过氧化氢酶活性 抑制剂包含黄芩或绿茶。

发光单元包含能够照射具有350nm～500nm的波长的光的半导体 激光器。

本发明的实施方式的杀菌方法优选利用本发明的实施方式的杀 菌装置来实施。首先，使包含过氧化氢和过氧化氢酶活性抑制剂的杀 菌剂接触杀菌对象。此时，即使杀菌对象中存在过氧化氢酶阳性细菌、 真菌等细胞、微生物，也能够通过过氧化氢酶活性抑制剂降低它们的 过氧化氢酶活性，能够防止过氧化氢酶与过氧化氢反应。

然后，利用发光单元对杀菌对象照射具有350nm～500nm的波长 的光。从而，过氧化氢发生光分解、产生羟自由基，因此能够利用所 产生的羟自由基进行杀菌。此时，由于能够通过过氧化氢酶活性抑制 剂降低存在于杀菌对象中的细胞、微生物的过氧化氢酶活性，因此能 够防止过氧化氢酶与过氧化氢反应而产生的羟自由基的减少。

从而，根据本发明的实施方式的杀菌剂、杀菌方法及杀菌装置， 能够通过过氧化氢酶活性抑制剂，防止产生羟自由基的过氧化氢与存 在于杀菌对象中的细胞、微生物所具有的过氧化氢酶反应而减少，结 果防止由过氧化氢产生的羟自由基的减少，因此能够提高利用羟自由 基实现的杀菌效果。

实施例1

进行求出过氧化氢酶活性和TEMPOL的ESR谱的线宽之间的关 系的试验。将100μL的过氧化氢酶(和光纯药工业株式会社制)、25μL 的TEMPOL(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Corporation)制) 和125μL的过氧化氢(三德化学工业株式会社制)分别用超纯水稀释 并按照达到表1所示的最终浓度的方式混合，制备过氧化氢酶的最终 浓度为0、0.25、0.5、1.0、2.0U/mL的5种混合液。对制备的混合液 进行ESR测定，将其测定结果示于图2。

[表1]

如图2所示，确认TEMPOL的ESR谱的线宽和过氧化氢酶浓度 之间可视为高的正相关关系。可以由该结果基于ESR谱的线宽测定 被测试样的过氧化氢酶活性。

实施例2

使用图2的结果，对过氧化氢酶活性抑制剂带来的过氧化氢酶活 性的抑制作用进行测定。将50μL的过氧化氢酶、25μL的TEMPOL、 认为具有过氧化氢酶活性的抑制作用的50μL生药和125μL的过氧化 氢分别用超纯水(Milli-Q水)稀释并按照达到表2所示的最终浓度 的方式混合，制备混合液。作为生药，使用黄芩、绿茶、蜜蜂花(lemon  balm)。此外，生药使用的是为了去除不溶于水的物质而用0.22μm的 过滤器过滤后的物质。此外，为了进行比较，还制备了不加生药的混 合液试样(Milli-Q水：MQ)。

[表2]

对获得的混合液试样进行ESR测定，基于其ESR谱的线宽由图 2测定过氧化氢酶活性，将其测定结果示于图3。如图3所示，与不 具有过氧化氢酶活性抑制作用的MQ(对照)相比，黄芩和绿茶在显 著水准5％下可确认到显著高的过氧化氢酶抑制作用(图3中的*记 号)。因此可以说，作为过氧化氢酶活性抑制剂，黄芩及绿茶是优选 的。

实施例3

进行调查过氧化氢酶活性抑制剂带来的杀菌效果的增强效果的 试验。试验中，作为杀菌对象，使用为过氧化氢酶阳性细菌的金黄色 葡萄球菌。使用该细菌，用生理盐水制备10⁷细胞/mL的浓度的细菌 悬浮液并用于试验。作为发光单元，使用半导体激光器(商品名 “RV-1000”；日本理光光学株式会社制)，将照射光的波长设为 400±20nm、将照射输出功率设为300mW、将照射时间设为2分钟。 将100μL的细菌悬浮液和150μL的过氧化氢按照分别达到表3所示 的最终浓度的方式在96孔微孔板中混合。使用黄芩作为过氧化氢酶 活性抑制剂，在超纯水中稀释后用0.22μm的过滤器进行过滤灭菌， 将其按照最终浓度分别达到0、1、3mg/mL的方式添加到细菌悬浮液 和过氧化氢的混合液中，由此制备试验试样。

[表3]

制备试验试样后立即进行激光照射，将照射后的试样50μL和 5000U/mL的过氧化氢酶50μL混合，使过氧化氢的反应停止。然后 制备10倍稀释系列，接种在BHI琼脂培养基中，在37℃的好氧条件 下培养24小时后，进行杀菌效果的评价。此外，在使用为过氧化氢 酶阳性真菌的白色念珠菌作为杀菌对象时以及使用绿茶作为过氧化 氢酶活性抑制剂时，也进行同样的试验。此外，作为比较试验，还评 价了过氧化氢、过氧化氢酶活性抑制剂、及有无激光照射所带来的杀 菌效果。将这些的试验结果示于图4～图6。

如图4所示，确认在以1mg/mL的浓度加入黄芩时〔图4中的H (+)L(+)O(+)〕，与未加入黄芩时〔图4中的H(+)L(+) O(-)〕相比对金黄色葡萄球菌获得约10倍的杀菌效果。此外，确认 在无过氧化氢、仅黄芩时〔图4中的H(-)L(-)O(+)〕、仅黄芩 且进行光照射时〔图4中的H(-)L(+)O(+)〕、仅过氧化氢时 〔图4中的H(+)L(-)O(-)〕、未进行光照射时〔图4中的H(+) L(-)O(+)〕的情况下，对金黄色葡萄球菌均未获得杀菌效果。

然后，如图5所示，确认在改变作为过氧化氢酶活性抑制剂的黄 芩的浓度时，随着黄芩的浓度升高，对金黄色葡萄球菌的杀菌效果也 变大。例如，在黄芩的浓度为3mg/mL时，与不使用过氧化氢酶活性 抑制剂、仅作为过氧化氢的羟自由基杀菌(黄芩的浓度0mg/mL)相 比，对金黄色葡萄球菌获得约1000倍的杀菌作用。

此外，如图6的(a)及(b)所示，不仅对金黄色葡萄球菌，对 白色念珠菌也确认了随着黄芩的浓度升高杀菌效果变大。如图6的 (c)及(d)所示，在使用绿茶作为过氧化氢酶活性抑制剂时，对金 黄色葡萄球菌及白色念珠菌也确认了随着绿茶的浓度升高、杀菌效果 也大致变大。此外，如图6的(a)～(d)所示，还确认了通过将过 氧化氢酶活性抑制剂与过氧化氢和激光照射组合使用，杀菌效果显著 改善。

根据图4～图6的结果，可以说通过将过氧化氢酶活性抑制剂与 通过过氧化氢的光分解形成的羟自由基杀菌组合，能够更有效地进行 杀菌。此外，由于细菌所具有的过氧化氢酶活性和致病性有关，对氧 化应激的防御机构越好的细菌引起感染症的可能性越大，因此可以 说，组合使用了过氧化氢酶活性抑制剂的本发明对于杀灭致病性高的 细菌也是有效的。