一种冷休克蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了一种冷休克蛋白的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：步骤一，TRIzol法提取总RNA；用研钵磨碎小鼠组织样品，每50-100mg组织加入1ml裂解液；步骤二，cDNA第一链合成于20μl反应体系中加入5μl RNA溶液、1μl Oligo、1μl dNTP，65℃反应5min；步骤三，于20μl反应体系中加入cDNA1μl、dNTP2μl、TapDNA聚合酶1μl、上下游引物各加1μl、10×buffer2μl；步骤四，重组载体的构建；步骤五，诱导表达；步骤六，初步纯化；步骤七，高度纯化。本发明所制备的冷休克蛋白CIRP对神经组织细胞具有保护作用及抗凋亡作用的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种的制备方法，特别是涉及一种冷休克蛋白的制备方法。 

背景技术

现有技术表达及纯化出的蛋白为包涵体，仅具有蛋白一级结构可用于抗体制作，不具有生物学活性。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种冷休克蛋白的制备方法，其制备的蛋白为可溶性表达，具有生物学活性，对神经细胞具有保护作用。 

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：一种冷休克蛋白的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤： 

步骤一，TRIzol法提取总RNA；用研钵磨碎小鼠组织样品，每50-100mg组织加入1ml裂解液，PBS漂洗细胞后，加入1ml TRIzol试剂，吹打混匀，移入1.5ml EP管中，然后加入氯仿抽提，用75％的乙醇充分洗涤沉淀，离心后去上清，干燥后用DEPC水溶解，-70℃保存备用； 

步骤二，eDNA第一链合成于20μl反应体系中加入5μl RNA溶液、1μl Oligo、1μl dNTP，65℃反应5min，迅速放冰上冷却；再加入4μlbuffer、2μl DTT、1μl Rnase inhibitor，37℃反应2min后加入1μl逆转录酶，37℃反应60min；80℃15min终止反应，得到cDNA； 

步骤三，于20μl反应体系中加入cDNA1μl、dNTP2μl、TapDNA聚合酶1μl、上下游引物各加1μl、10×buffer2μl；95℃预变性5min，然后95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃ 延伸10min； 

步骤四，重组载体的构建，将纯化的PCR产物和pGEX-4t-1，分别以EcoR I和Sal I双酶切，经割胶纯化后，将目的基因和pGEX-4t-1按5∶1进行连接；反应体系10μl，另加入1μl T₄DNA连接酶，1μl缓冲液液，置于室温2～4小时；将连接产物转化DH5感受态细胞，依次于冰水浴30min，42℃水浴90s及冰水浴2min；加入500μl LB培养基，37℃振荡培养1h；离心后取50μl培养液涂于LB+氨苄青霉素120μg/ml平板，37℃过夜培养； 

步骤五，诱导表达，挑取单个菌落5ml LB振荡培养过夜，180r/min，37℃；次日转种新鲜LB培养基进行放大培养；当OD₆₀₀值达到0.6～0.7时加入IPTG，于32℃继续培养4h；取诱导前和诱导后细菌离心12000r/min收集菌体，处理后进行10％SDS-PAGE凝胶电泳； 

步骤六，初步纯化，蛋白溶液准备，将上步所得菌体加入PH＝7.2，Tris-Hcl0.1g/ML，超声破碎，12000rpm4℃离心30min，取上清用0.22mm滤膜过滤除去杂质沉淀；蛋白溶液上阳离子结合柱，收集穿透液，将穿透液上阴离子结合柱，并用0.3mol NaCl洗脱杂蛋白，0.6mol NaCl收集洗脱液；穿透流出液以280nm紫外检测； 

步骤七，高度纯化。 

优选地，所述步骤七将初步纯化的蛋白溶液上S200分子筛柱，PBE溶液淋洗柱体，分段收集蛋白洗脱液并取样做SDS-page检验纯度，将高纯度组份合并，真空冻干保存。 

本发明的积极进步效果在于：本发明所制备的冷休克蛋白CIRP对神经组织细胞具有保护作用及抗凋亡作用的效果，且应用原核细胞表达，产量大，制备条件简化的优点。 

附图说明

图1为本发明CIRP序列PCR扩增核酸电泳1道为maker2道为CIRP 片段大小在520bp左右的示意图。 

图2为本发明重组GST-CIRP表达SDS-PAGE蛋白电泳的示意图。 

图3为本发明阴阳离子交换柱初纯重组CIRP蛋白SDS-PAGE蛋白电泳的示意图。 

图4为本发明收集蛋白洗脱液并取样做SDS-page检验纯度的示意图。 

具体实施方式

下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案。 

本发明冷休克蛋白的制备方法包括以下步骤： 

步骤一，TRIzol法提取总RNA；用研钵磨碎小鼠组织样品，每50-100mg组织加入1ml裂解液，PBS漂洗细胞后，加入1ml TRIzol试剂，吹打混匀，移入1.5ml EP管中，然后加入氯仿抽提，用75％的乙醇充分洗涤沉淀，离心后去上清，干燥后用DEPC水溶解，-70℃保存备用。 

步骤二，eDNA第一链合成于20μl反应体系中加入5μl RNA溶液、1μl Oligo(dT)、1μl dNTP，65℃反应5min，迅速放冰上冷却。再加入4μl buffer(缓冲液)、2μl DTT(二硫苏糖醇)、1μl Rnase inhibitor(RNA酶抑制剂)，37℃反应2min后加入1μl逆转录酶，37℃反应60min。80℃15min终止反应，得到eDNA； 

步骤三，于20μl反应体系中加入cDNA1μl、dNTP2μl、TapDNA聚合酶1μl、上下游引物各加1μl、10×buffer2μl。95℃预变性5min，然后95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。所获PCR产物进行1％琼脂糖电泳，并割胶回收；如图1所示，CIRP序列PCR扩增核酸电泳1道为maker2道为CIRP片段大小在520bp左右。 

步骤四，重组载体的构建，将纯化的PCR产物和pGEX-4t-1，分别以EcoR I和Sal I双酶切，经割胶纯化后，将目的基因和pGEX-4t-1按5∶1 (摩尔数)进行连接。反应体系10μl，另加入lμl T₄DNA连接酶，1μl缓冲液液，置于室温2～4小时。将连接产物转化DH5感受态细胞，依次于冰水浴30min，42℃水浴90s及冰水浴2min。加入500μlLB培养基，37℃振荡培养1h。离心后取50μl培养液涂于LB+氨苄青霉素120μg/ml平板，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，提取质粒，进行限制性内切酶酶切鉴定，测序正确； 

步骤五，诱导表达，挑取单个菌落5ml LB振荡培养过夜，180r/min，37℃。次日转种新鲜LB培养基进行放大培养。当OD₆₀₀值达到0.6～0.7时加入IPTG(终浓度为0.1mmol/L)，于32℃继续培养4h。取诱导前和诱导后细菌离心12000r/min收集菌体，处理后进行10％SDS-PAGE凝胶电泳；如图2所示，重组GST-CIRP表达SDS-PAGE蛋白电泳，SDS-PAGE电泳，1道、2道为工程菌株上清与沉淀，GST标签在上清中23KD左右，3道、4道为重组GST-CIRP上清与沉淀，目的蛋白可溶性表达在上清40KD左右； 

步骤六，初步纯化，蛋白溶液准备，将上步所得菌体加入PH＝7.2，Tris-Hcl0.1g/ML，超声破碎，12000rpm4℃离心30min，取上清用0.22mm滤膜过滤除去杂质沉淀。蛋白溶液上阳离子结合柱，收集穿透液，将穿透液上阴离子结合柱，并用0.3mol NaCl洗脱杂蛋白，0.6mol NaCl收集洗脱液。穿透流出液以280nm紫外检测；如图3所示，阴阳离子交换柱初纯重组CIRP蛋白SDS-PAGE蛋白电泳，1道为超声破碎菌液上清，2道为穿过Q柱穿透液，3道为0.3mmol盐离子浓度洗脱杂蛋白，4道为0.5mmol盐离子浓度洗脱含目的蛋白洗脱液，5道为高盐离子浓度洗脱剩余杂蛋白。 

步骤七，高度纯化，将初步纯化的蛋白溶液上S200分子筛柱，PBE溶液淋洗柱体，分段收集蛋白洗脱液并取样做SDS-page检验纯度(图4)，将高纯度组份合并，真空冻干保存。如图4所示，分子筛高度纯化重组CIRP蛋白SDS-PAGE蛋白电泳1道为超声破碎菌液上清，2道为经过阴阳离子交换柱初步纯化的蛋白溶液，3道为穿透S200分子筛进一步纯化，得到纯度较 高的重组蛋白，纯度＞95％ 

本发明重点在于研究CIRP对神经组织细胞的保护作用或抗凋亡作用的效果，明确其保护作用或抗凋亡作用的分子机制，从而进一步阐明亚低温刺激表达CIRP对神经功能保护的作用机制，并为外源性给予CIRP保护神经组织细胞提供理论依据。 

本领域的技术人员可以对本发明进行各种改型和改变。因此，本发明覆盖了落入所附的权利要求书及其等同物的范围内的各种改型和改变。