风险患者和中风原因的基于肌钙蛋白和BNP的诊断

摘要

本发明涉及用于早期区别受试者患有心脏栓塞性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风的方法。该方法基于测定来自患有缺血性中风的受试者的样品中的心脏肌钙蛋白量，所述样品在缺血性中风的症状发作后不超过24小时获得。本发明进一步涵盖适合于实施本发明的方法的试剂盒和装置。

说明书

本发明涉及用于早期区别受试者患有心脏栓塞性中风还是患有非心脏 栓塞性缺血性中风的方法。该方法基于测定来自患有缺血性中风的受试者的 样品中的心脏肌钙蛋白量，所述样品在缺血性中风的症状发作后不超过24小 时获得。此外，本发明涉及用于在受试者中诊断心房肌纤维震颤的方法。本 发明进一步涵盖适合于实施本发明的方法的试剂盒和装置。本发明还涉及用 于早期区别受试者患有心脏栓塞性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风 及用于诊断心房肌纤维震颤的系统。此外，本发明涉及实施本文中公开的方 法中使用的试剂和试剂盒。

在缺血性心脏病后，中风作为高收入国家中丧失失能调整生命年(lost  disability–adjusted life–years)的原因及作为全世界死亡原因排序第二。如果 中风呈现的早期不利后果可以使用溶栓改善，那些在晚期呈现的情况中，使 用阿司匹林和抗凝的二级预防(以预防随后的中风)似乎是避免疾病进展的 唯一合适的方法(van der Worp B and van Gijn J.,NEJM2007:357:572–578)。

为了预防或治疗中风，鉴定中风的根本原因是有意义的。这已经通过 TOAST标准(Adams H.P.等Stroke1993:24:35–41)解决。TOAST标准将中风 的原因仔细分析成动脉粥样硬化血栓形成性(atherothrombotic)(大血管的动 脉粥样硬化)、心脏栓塞性、腔隙性(lacunar)(牵涉小血管)和未确定的(Adams  H.P.等)。为了评估这些标准，需要颈动脉和经颅超声及超声心动描记术和心 电图(Rodriguez-Yanez等,Disease Markers2009:26:189–195)。迄今为止， NT-pro BNP已经与心脏栓塞性中风，而没有与动脉粥样硬化血栓形成性、腔 隙性和未确定的中风联系起来(Rodriguez-Yanez等)。此方法的一个主要缺点 是BNP或NT-pro BNP在缺血性中风中可以从脑中释放，如此限制脑型利尿钠 肽的诊断性潜力。令人感兴趣地，在发明人实施的研究的上下文中已经显示 了中风患者中NT-原BNP的中值血清水平从呈现331pg/ml至24小时随访 (437pg/ml)升高约30％。如此，基于利尿钠肽测定的心脏栓塞性中风诊断基 于获得要测试的样品的时间点。如此，需要鉴定不从脑中释放的风险标志物。

心脏肌钙蛋白T和I是诊断急性心肌梗死的优选生物标志物(Anderson JL, ACC/AHA2007guidelines for the management of patients with unstable  angina/non-ST-Elevation myocardial infarction.J Am Coll Cardiol. 2007；50(7):e1–e157)。已经认可可以在几种非急性慢性疾病状态，包括冠状 动脉疾病、心力衰竭、和慢性肾病中检测到升高的肌钙蛋白水平(见例如 Omland等,N Engl J Med.2009；361(26):2538–2547)。还已经显示了肌钙蛋白T 和I在来自一般群体的个体中可检出(见例如Wallace等,Prevalence and  determinants of troponin T elevation in the general population.Circulation. 2006；113(16):1958–1965)。

Song等(Journal of Clinical Neurology,卷4,2006,第75页至第83页)描述 了一项包括455名缺血性中风患者的研究。血清肌钙蛋白T在约10％的患者中 是升高的，并且与更大的中风严重性，特别是更严重的神经学缺陷和对岛叶 的损伤有关。研究的作者推断升高的血清肌钙蛋白水平可以指示对急性缺血 性中风的应激原因的较低心脏耐受性。如此，依照Song等，肌钙蛋白的增加 会由急性中风引起，即会在急性事件后引起。

在本发明的上下文中，令人惊讶地，已经显示了心脏栓塞性中风患者中 升高的心脏肌钙蛋白水平在心脏栓塞性中风发作时已经可检测。如此，与 Song等的教导形成对比，心脏肌钙蛋白水平的升高不是由中风事件引起的。 取而代之，本发明的研究提示了心脏肌钙蛋白的水平在中风症状发作前已经 升高。因此，测定心脏肌钙蛋白容许早期区别受试者中的心脏栓塞性缺血性 中风和非心脏栓塞性缺血性中风。这是有利的，因为中风原因的早期评估是 至关重要的，以充分治疗患有中风的受试者，特别是患有心脏栓塞性中风的 受试者。此外，由于心脏栓塞所致的中风一般是严重的且易于早期复发。

常规的诊断技术通常不容许中风原因的早期、可靠评估。因而，个人化 治疗方案不能以足够的精确性测定。因此，许多患者会接受不充分的或者可 能具有不利副作用的治疗方案。因此，需要用于可靠区别中风原因的手段和 方法。

本发明根本的技术问题可以看作提供用于遵从前述需要的手段和方法。

技术问题通过权利要求书和下文中表征的实施方案解决。

因而，用于早期区别受试者患有心脏栓塞性中风还是患有非心脏栓塞性 缺血性中风的本发明方法，其包括：

a)测定来自患有缺血性中风的受试者的样品中的心脏肌钙蛋白量，

其中在缺血性中风的症状发作后立即获得所述样品。

在一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括如下步骤：

b)比较如步骤a中测定的所述心脏肌钙蛋白的量与参照量，由此区别所 述受试者患有心脏栓塞性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风。

如此，本发明特别涉及用于早期区别受试者患有心脏栓塞性中风还是患 有非心脏栓塞性缺血性中风的方法，其包括：

a)测定来自患有缺血性中风的受试者的样品中的心脏肌钙蛋白量，所述 样品在缺血性中风的症状发作后立即获得，并

b)比较如步骤a)中测定的所述心脏肌钙蛋白的量与参照量，由此区别所 述受试者患有心脏栓塞性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风。

优选地，通过实施进一步的步骤c)，即基于步骤b)中实施的比较的结果， 诊断受试者患有心脏栓塞性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风来区别 受试者患有心脏栓塞性缺血性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风。

在本发明的方法的一个优选的实施方案中，步骤a)进一步包括测定在缺 血性中风发作后立即获得的来自受试者的样品中的利尿钠肽量。优选地，如 此，在步骤b)中比较测定的利尿钠肽量与利尿钠肽的参照量。

如此，本发明还涉及用于早期区别受试者患有心脏栓塞性中风还是患有 非心脏栓塞性缺血性中风的方法，其包括：

a)测定来自患有缺血性中风的受试者的样品中的心脏肌钙蛋白的和利 尿钠肽的量，所述样品在缺血性中风的症状发作后立即获得，并

b)比较如步骤a)中测定的所述心脏肌钙蛋白的量与心脏肌钙蛋白的参 照量，和所述利尿钠肽的量与利尿钠肽的参照量，由此区别所述受试者患有 心脏栓塞性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风。

优选地，本发明的方法是离体方法。此外，它可以包括上文明确提及的 那些步骤外的步骤。例如，其它步骤可以涉及样品预处理或通过上述方法获 得的结果的评估。上述方法可以手动实施或通过自动化辅助。优选地，步骤 (a)和/或(b)可以完全或部分通过自动化，例如通过合适的机器人和感应设备 辅助，用于步骤(a)中的测定或计算机执行的比较和/或基于步骤(b)中所述比 较的区别。

因而，本发明还优选涉及用于早期区别受试者患有心脏栓塞性缺血性中 风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风的系统，其包含：

a)分析仪单元，其配置为使来自患有缺血性中风的受试者的样品的一部 分与包含对心脏肌钙蛋白的特异性结合亲和力的配体在体外接触，

b)分析仪单元，其配置为检测与配体接触的来自受试者的样品的一部 分的信号，

c)计算装置，其具有处理器且与所述分析单元可操作通信，和

d)非瞬时机器可读介质，其包含多个由处理器可执行的指令，该指令 在执行时计算心脏肌钙蛋白的量，并比较所述标志物的量与参照量，由此区 别受试者患有心脏栓塞性缺血性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风。

如本文中使用的，术语“区别”意指在患有缺血性中风的患者中区分患 有心脏栓塞性中风和非心脏栓塞性中风。如本文中使用的，该术语优选包括 在受试者中区别性诊断心脏栓塞性缺血性中风和非心脏栓塞性缺血性中风。 如本领域技术人员会理解的，此类评估通常并不意图对于要区别性诊断的 100％受试者是正确的。然而，该术语需要可以正确诊断受试者的统计学显 著的部分。可以通过本领域中公知的方法确认诊断/区别是否正确。此外，本 领域技术人员使用多种公知的统计学评估工具，例如测定置信区间、p值测 定、Student氏t检验、Mann-Whitney检验等无需额外费力就能测定某部分是 否是统计学显著的。详情参见Dowdy and Wearden,Statistics for Research,John  Wiley&Sons,New York1983。优选的置信区间是至少90％，至少95％，至少 97％，至少98％或至少99％。优选地，p值是0.1、0.05、0.01、0.005、或0.0001。

如本文中使用的，术语“受试者”指动物，优选哺乳动物，更优选人。 优选地，受试者患有或未患有急性感染。此外，进一步涵盖受试者未患有急 性冠状动脉综合征和/或慢性肾衰竭。特别地，前述方法的上下文中的受试者 应当具有正常的肾功能。此外，优选地，受试者是送到急症病房的受试者。

优选地，本文中给予的受试者的定义适用于要依照本发明的方法测试的 受试者及从其得到参照量的一名或多名受试者。

要依照本发明的方法测试的受试者应当患有缺血性中风。术语“缺血性 中风”(在本文中又称为“中风(stroke)”)是技术人员公知的(见例如Adams  等,Guidelines for the Early Management of Adults With Ischemic Stroke,A  Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association  Stroke Council,Clinical Cardiology Council,Cardiovascular Radiology and  Intervention Council,and the Atherosclerotic Peripheral Vascular Disease and  Quality of Care Outcomes in Research Interdisciplinary Working Groups in  Stroke.2007；38:1655；或Stroke Genetics,Hugh S.Markus编,第1章“An  introduction to stroke,Oxford University Press,Incorporated,出版日期06/03， 通过提及将这两篇就其全部公开内容而言收入本文)。如本文中使用的，优 选地，该术语指脑缺血性中风。缺血性中风是由对脑或其部分的血流降低， 导致氧对脑细胞的投递降低(供应不足)引起的。缺血性中风可以以由动脉 血流入的阻塞引起的组织贫血为特征。它可以导致由于脑细胞死亡所致的不 可逆组织损伤。

存在有缺血性中风的多种分类系统。牛津社区中风项目(Oxford  Community Stroke Project)分类(OCSP，又称为班福德(Bamford)或牛津分类) 主要依赖于初始症状；基于症状的程度，中风事件分类为总前循环梗死(total  anterior circulation infarct,TACI)、部分前循环梗死(partial anterior circulation  infarct,PACI)、腔隙性梗死(lacunar infarct,LACI)或后循环梗死(posterior  circulation infarct,POCI)。这四种实体预测中风的程度、受累的脑区、根本性 原因、和预后。

优选地，本文中应用所谓的TOAST标准。对于TOAST标准，见例如 Donnan GA,Fisher M,Macleod M,Davis SM(2008年5月).“Stroke”.Lancet  371(9624):1612–23或“Classification of subtype of acute ischemic stroke. Definitions for use in a multicenter clinical trial.TOAST.Trial of Org 10172 in  Acute Stroke Treatment”。TOAST(急性中风治疗中的Org10172试验)分类 基于临床症状及进一步调查的结果；以此为基础，中风分类为是由于(1)心脏 起源的栓塞(心脏栓塞性中风)，(2)由于大动脉的动脉粥样硬化所致的血栓 形成或栓塞(大动脉狭窄，动脉粥样硬化血栓形成性中风)，(3)小血管的阻 塞(腔隙性中风)或(4)未确定的原因(两种可能的原因：无鉴定的原因，或 不完全调查)。如此，优选的非心脏栓塞性缺血性中风是动脉粥样硬化血栓 形成性中风(见2)和腔隙性中风(见3)。

可以通过公知的方法测定受试者是否患有中风，特别是缺血性中风。此 外，中风的症状是本领域中公知的，并且例如记载于Adams等(在上述引文 中)。例如，中风症状包括脸、臂或腿(尤其在身体一侧)的突然麻木或虚 弱、突然意识错乱、说话或理解困难、一只或两只眼突然视物困难、和突然 行走困难、头晕、平衡或协调的丧失。

术语“样品”指体液样品、分离细胞的样品或来自组织或器官的样品。 体液样品可以通过公知的技术获得，并且包括优选地，血液、血浆、血清或 尿液的样品，更优选地，血液、血浆或血清的样品。可以例如通过活组织检 查从任何组织或器官获得组织或器官样品。可以通过分离技术诸如离心或细 胞分选从体液或组织或器官获得分离的细胞。优选地，可以从那些表达或生 成本文中提及的肽的细胞、组织或器官获得细胞、组织或器官样品。

要在本发明的方法的上下文中测试的样品应当在中风的症状发作后立 即获得(以及参照样品)。优选地，若已经在中风的症状发作后不超过24小 时，特别是不超过12小时从所述受试者获得样品，它视为在中风的症状发作 后立即获得。更优选地，若在缺血性中风的症状发作后不超过6小时，且甚 至更优选地不超过3小时从所述受试者获得样品，则其视为在中风的症状发 作后立即获得。进一步涵盖的是在中风症状的发作后不超过1或2小时获得样 品。

术语“心脏肌钙蛋白”指心脏细胞，且优选心内膜下细胞中表达的所有 肌钙蛋白同等型。这些同等型在本领域中充分表征，如记载于例如Anderson 1995,Circulation Research,vol.76,no.4:681-686及Ferrieres 1998,Clinical  Chemistry,44:487-493的。优选地，心脏肌钙蛋白指肌钙蛋白T和/或肌钙蛋 白I，且最优选肌钙蛋白T。应当理解，肌钙蛋白的同等型可以在本发明的方 法中一起，即同时或序贯，或单独(即根本不测定其它同等型)测定。人肌 钙蛋白T和人肌钙蛋白I的氨基酸序列披露于Anderson,在上述引文中和 Ferrieres1998,Clinical Chemistry,44:487-493。

术语“心脏肌钙蛋白”还涵盖前述特定肌钙蛋白，即优选肌钙蛋白I， 且更有选肌钙蛋白T的变体。此类变体与具体的心脏肌钙蛋白具有至少相同 的必需生物学和免疫学特性。特别地，若它们通过本说明书中提及的相同特 异性测定法，例如通过使用特异性识别所述心脏肌钙蛋白的多克隆或单克隆 抗体的ELISA测定法可检出，则它们共享相同的必需生物学和免疫学特性。 此外，应当理解，依照本发明提及的变体应当具有由于至少一处氨基酸取代、 缺失和/或添加而不同的氨基酸序列，其中变体的氨基酸序列与具体的肌钙蛋 白的氨基酸序列仍然优选是至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约 80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约95％、至少约97％、至 少约98％、或至少约99％相同的。优选地，要如下测定同一性的程度，即在 比较窗里比较两个最佳比对的序列，其中比较窗中的氨基酸序列的片段与参 照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(例如缺口或突出 物)以实现最佳比对。如下计算百分比，即测定两条序列中存在相同氨基酸 残基的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的 位置总数，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。可以通过Smith和 Waterman Add.APL.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman 和Wunsch J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和 Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过 这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、 BLAST、PASTA、和TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr., Madison,WI)，或者通过视觉检查进行序列的最佳比对以进行比较。鉴于已 经鉴定两个序列进行比较，优选采用GAP和BESTFIT来测定其最佳比对和如 此同一性程度。优选地，使用缺省数值缺口加权为5.00和缺口加权长度为 0.30。变体可以是等位变体或任何其它物种特异性同系物、旁系同系物 (paralog)、或直向同系物。此外，本文中提及的变体包括特定心脏肌钙蛋白 或前述变体类型的片段，只要这些片段具有上文提及的必需免疫学和生物学 特性。优选地，心脏肌钙蛋白变体与人肌钙蛋白T或肌钙蛋白I具有相当的免 疫学特性(即，表位组成)。如此，用于测定心脏肌钙蛋白浓度的前述手段 或配体应当可识别变体。此类片段可以是例如肌钙蛋白的降解产物。进一步 包括由于翻译后修饰诸如磷酸化或豆蔻酰化而不同的变体。优选地，肌钙蛋 白I及其变体的生物学特性是抑制肌动球蛋白ATP酶或在体内和在体外抑制 血管发生的能力，其可以例如基于由Moses等1999 PNAS USA 96(6): 2645-2650)描述的测定法检测。优选地，肌钙蛋白T及其变体的生物学特性是 与肌钙蛋白C和I形成复合物，结合钙离子或结合原肌球蛋白(优选若以肌钙 蛋白C、I和T的复合物，或通过肌钙蛋白C、肌钙蛋白I和肌钙蛋白T变体形成 的复合物存在)的能力。已知低浓度的循环心脏肌钙蛋白可以在多种条件在 受试者中检出，但是需要进一步的研究来了解其相应的作用和速率(Masson 等,Curr Heart Fail Rep(2010)7:15–21)。

术语“利尿钠肽”包括心房利尿钠肽(ANP)型和脑利尿钠肽(BNP)型肽及 具有相同预测潜力的其变体。依照本发明的利尿钠肽包含ANP型和BNP型肽 及其变体(见例如Bonow,1996,Circulation93:1946-1950)。ANP型肽包含前 原ANP(pre-proANP)、原ANP(proANP)、NT-原ANP、和ANP。BNP型肽包含 前原BNP、原BNP、NT-原BNP、和BNP。前原肽(pre-pro peptide)(在前原 BNP的情况中为134个氨基酸)包含短的信号肽，其被酶促切除以释放原肽 (在原BNP的情况中为108个氨基酸)。原肽被进一步切割成N端原肽(NT- 原肽，在NT-原BNP的情况中为76个氨基酸)和活性激素(在BNP的情况中 为32个氨基酸，在ANP的情况中为28个氨基酸)。优选地，依照本发明的利 尿钠肽是NT-原ANP、ANP、且更优选NT-原BNP、BNP、及其变体。ANP和 BNP是活性激素，并且比其相应的无活性对应物NT-原ANP和NT-原BNP具有 更短的半衰期。BNP在血液中代谢，而NT-原BNP在血液中以完整的分子循 环，并且因此是肾消除的。NT-原BNP的体内半衰期比BNP的半衰期(其是 20分钟)长120分钟(Smith 2000,J Endocrinol.167:239-46.)。预分析用NT-原 BNP更强力，容许将样品容易地运输到中心实验室(Mueller 2004,Clin Chem  Lab Med 42:942-4.)。可以将血液样品于室温贮存几天或者可以在没有回收 损失的情况中将其邮寄或运输。比较而言，将BNP于室温或于4摄氏度贮存 48小时导致至少20％的浓度损失(Mueller同上；Wu 2004,Clin Chem 50: 867-73.)。因此，根据感兴趣特性的时间过程，利尿钠肽的活性或无活性形 式的测量可以是有利的。依照本发明的最优选利尿钠肽是NT-原BNP或其变 体。如上文简短讨论的，如依照本发明提及的人NT-原BNP是一种包含优选 长度为76个氨基酸的多肽，其对应于人NT-原BNP分子的N端部分。在现有技 术中已经详细描述了人BNP和NT-原BNP的结构，例如WO02/089657,WO 02/083913或Bonow同上。优选地，如本文中使用的人NT-原BNP是如披露EP 0648228B1的人NT-原BNP。通过提及将这些现有技术文件就其中公开的 NT-原BNP及其变体的具体序列而言收入本文。依照本发明提及的NT-原BNP 进一步涵盖上文讨论的人NT-原BNP的所述具体序列的等位和任何变体。具 体地，涵盖与人NT-原BNP，优选在NT-原BNP的整个长度里在氨基酸水平上 优选至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、 或99％相同的变体多肽。可以通过本领域中公知的算法测定两种氨基酸序列 间的同一性程度。优选地，要如下测定同一性的程度，即在比较窗里比较两 个最佳比对的序列，其中比较窗中的氨基酸序列的片段与参照序列(其不包 含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(例如缺口或突出物)以实现最佳 比对。如下计算百分比，即测定两条序列中存在相同氨基酸残基的位置数目 以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数，并将 结果乘以100以产生序列同一性的百分比。可以通过Smith和Waterman Add. APL.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch J.Mol. Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad. Sci.(USA)85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化执行 (Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA、和TFASTA, Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)，或者通过视 觉检查进行序列的最佳比对以进行比较。鉴于已经鉴定两个序列进行比较， 优选采用GAP和BESTFIT来测定其最佳比对和如此同一性程度。优选地，使 用缺省数值缺口加权为5.00和缺口加权长度为0.30。上文提及的变体可以是 等位变体或任何其它物种特异性同系物、旁系同系物、或直向同系物。基本 上相同且还涵盖的是蛋白水解降解产物，其仍被诊断手段或针对相应全长肽 的配体识别。还涵盖的是与人NT-原BNP的氨基酸序列相比具有氨基酸缺失、 取代、和/或添加的变体多肽，只要所述多肽具有NT-原BNP特性。如本文中 提及的NT-原BNP特性是免疫学和/或生物学特性。优选地，NT-原BNP变体 与人NT-原BNP具有相当的免疫学特性(即表位组成)。因此，用于测定利尿 钠肽量的前述手段或配体应当可识别变体。可以通过Karl等(Karl 1999, Scand J Clin Lab Invest 230:177-181),Yeo等(Yeo 2003,Clinica Chimica Acta 338:107-115)中描述的测定法检测生物学和/或免疫学NT-原BNP特性。变体还 包括翻译后修饰肽，诸如糖基化肽。此外，依照本发明的变体也是在收集样 品后例如通过将标记物，特别是放射性或荧光标记物共价或非共价附着于肽 而经过修饰的肽或多肽。

测定本说明书中提及的肽或多肽量涉及测量量或浓度，优选半定量或定 量测量。可以直接或间接进行测量。直接测量指基于从肽或多肽自身获得， 并且其强度与样品中存在的肽分子的数目直接相关的信号测量肽或多肽的 量或浓度。例如，可以通过测量肽或多肽的特定物理或化学特性的强度数值 获得此类信号(在本文中有时称为强度信号)。间接测量包括测量从第二组 分(即不是肽或多肽自身的组分)或生物学读出系统，例如可测量细胞响应、 配体、标记物、或酶促反应产物获得的信号。

依照本发明，可以通过用于测定样品中肽量的公知手段实现测定肽或多 肽的量。所述手段包括可以以多种三明治式、竞争或其它测定形式利用经标 记的分子的免疫测定法和方法。优选地，此类测定法基于检测剂，诸如特异 性识别要测定的肽或多肽的抗体。检测剂应当直接或间接能够产生指示肽或 多肽存在或缺乏的信号。此外，优选地，信号强度可以与样品中存在的多肽 量直接或间接(例如反比例)相关。其它合适的方法包括测量对于肽或多肽 特异性的物理或化学特性，诸如其精确的分子量或NMR谱。优选地，所述方 法包括生物传感器、与免疫测定法偶联的光学装置、生物芯片、分析装置， 诸如质谱仪、NMR-分析仪、或层析装置。此外，方法包括基于微板ELISA 的方法、完全自动化的或机器人的免疫测定法(在例如ElecsysTM分析仪上 可用)、CBA(一种酶促钴结合测定法，其在例如Roche-HitachiTM分析仪上 可用)、和胶乳凝集测定法(例如在Roche-HitachiTM分析仪上可用)。

优选地，测定肽或多肽的量包括如下的步骤：(a)使能够引发其强度指示 肽或多肽量的细胞应答的细胞与所述肽或多肽接触足够的时间段，(b)测量细 胞应答。为了测量细胞应答，优选地，对细胞培养物添加样品或加工过的样 品，并且测量内部或外部细胞应答。细胞应答可以包括可测量的报告基因表 达或物质(例如肽、多肽或小分子)的分泌。所述表达或物质应当产生强度 信号，其与肽或多肽的量相关联。

还优选地，测定肽或多肽的量包括如下的步骤，即测量从样品中的肽或 多肽可获得的特定强度信号。如上文描述的，此类信号可以是在对于肽或多 肽特异性的质谱或NMR谱中观察到的对于肽或多肽特异性的某个m/z变量观 察到的信号强度。

优选地，测定肽或多肽的量可以包括如下的步骤：(a)使肽与特定的配体 接触，(b)(任选地)除去未结合的配体，(c)测量结合的配体的量。

依照一个优选的实施方案，可以通过本文中公开的系统的分析仪单元实 施所述接触、除去和测量的步骤。依照一些实施方案，可以通过所述系统的 单一分析仪单元或者通过彼此可操作通信的不超过分析仪单元实施所述步 骤。例如，依照一个具体的实施方案，本文中公开的所述系统可以包含用于 实施所述接触和除去步骤的第一分析仪单元和实施所述测量步骤的第二分 析仪单元，该第二分析仪单元与所述第一分析仪单元通过转运单元(例如机 器人臂)可操作连接。

结合的配体，特别是配体或配体/肽复合物会产生强度信号。依照本发明 的结合包括共价和非共价结合两者。依照本发明的配体可以是结合本文中描 述的肽或多肽的任何化合物，例如肽、多肽、核酸、或小分子。优选的配体 包括抗体、核酸、肽或多肽，诸如针对肽或多肽的受体或结合配偶及包含肽 的结合域的其片段，和适体，例如核酸或肽适体。制备此类配体的方法是本 领域中公知的。例如，商业供应商也提供合适抗体或适体的鉴定和生成。本 领域技术人员熟悉开发具有更高亲和力或特异性的此类配体的衍生物的方 法。例如，可以将随机突变引入核酸、肽或多肽中。然后，可以依照本领域 中已知的筛选规程，例如噬菌体展示对这些衍生物测试结合。如本文中提及 的抗体包括多克隆和单克隆抗体两者，及能够结合抗原或半抗原的其片段， 诸如Fv、Fab和F(ab)2片段。本发明还包括单链抗体和人源化杂合抗体，其中 将展现出期望抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人接受抗体的序 列组合。供体序列通常会至少包含供体的抗原结合氨基酸残基，但是也可以 包含供体抗体的其它结构和/或功能相关氨基酸残基。可以通过本领域中公知 的几种方法制备此类杂合物。优选地，配体或药剂特异性结合肽或多肽。依 照本发明的特异性结合意味着配体或药剂基本上不应结合(与其“起交叉反 应”)要分析的样品中存在的另一种肽、多肽或物质。优选地，特异性结合 的肽或多肽应当比任何其它相关肽或多肽以高至少3倍，优选高至少10倍， 且甚至更优选高至少50倍的亲和力结合。若非特异性结合依照例如其在 Western印迹上的大小，或者根据其在样品中相对较高的丰度仍然可以明确区 别并测量，则其会是可容许的。可以通过本领域中已知的任何方法测量配体 的结合。优选地，所述方法是半定量或定量的。下文描述了其它用于测定多 肽或肽的合适技术。

第一，可以例如通过NMR或表面等离振子共振直接测量配体的结合。依 照优选的实施方案，通过本文中公开的系统的分析仪单元实施配体结合的测 量。此后，可以通过本文中公开的系统的计算装置计算测量的结合的量。第 二，若配体也充当感兴趣的肽或多肽的酶促活性的底物，则可以测量酶促反 应产物(例如可以通过例如在Western印迹上测量切割底物的量测量蛋白酶的 量)。或者，配体可以自身展现出酶促特性，并且可以使“配体/肽或多肽” 复合物或被肽或多肽结合的配体与合适的底物接触，所述合适的底物容许通 过强度信号的产生进行检测。为了测量酶促反应产物，优选地，底物的量是 饱和的。也可以在反应前用可检测标记物标记底物。优选地，使样品与底物 接触足够的时间段。足够的时间段指产生可检测，优选可测量产物量必需的 时间。代替测量产物量，可以测量给定(例如可检测)产物量出现必需的时 间。第三，可以将配体与标记物共价或非共价偶联，所述标记物容许配体的 检测和测量。可以通过直接或间接方法进行标记。直接标记牵涉将标记物与 配体直接偶联(共价或非共价)。间接标记牵涉将二级配体与一级配体结合 (共价或非共价)。二级配体应当特异性结合一级配体。所述二级配体可以 与合适的标记物偶联和/或是结合二级配体的三级配体的靶物(受体)。二级、 三级或甚至更高级配体的使用经常用于增强信号。合适的二级和更高级配体 可以包括抗体、二抗、和公知的链霉亲合素-生物素系统(Vector Laboratories, Inc.)。也可以用一种或多种如本领域中已知的标签“标记”配体或底物。然 后，此类靶物可以是更高级配体的靶物。合适的标签包括生物素、洋地黄毒 苷、His标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc标签、甲型流感病毒 血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白，等等。在肽或多肽的情况中，优选地，标签 在N端和/或C端。合适的标记物是通过合适的检测方法可检测的任何标记物。 典型的标记物包括金颗粒、胶乳珠、吖啶酯(acridan ester)、鲁米诺(luminol)、 钌、酶促活性标记物、放射性标记物、磁性标记物(例如“磁珠”，包括顺 磁性和超顺磁性标记物)、和荧光标记物。酶促活性标记物包括例如辣根过 氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素、及其衍生物。适合于检测 的底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3,3'-5,5'-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基 蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐，以已经生成的储备溶液自Roche  Diagnostics获得)、CDP-Star^TM(Amersham Biosciences)、ECF^TM(Amersham  Biosciences)。合适的酶-底物组合可以导致有色的反应产物、荧光或化学发 光，其可以依照本领域中已知的方法(例如使用光敏膜或合适的照相机系统) 测量。关于测量酶促反应，类似地应用上文给予的标准。典型的荧光标记物 包括荧光蛋白(诸如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红(Texas Red)、 荧光素和Alexa染料(例如Alexa568)。其它荧光标记物可购自例如Molecular  Probes(Oregon)。还涵盖量子点作为荧光标记物的用途。典型的放射性标记 物包括35S、125I、32P、33P，等等。可以通过任何已知且合适的方法，例 如光敏膜或磷光体(phosphor)成像仪检测放射性标记物。依照本发明的合适 的测量方法还包括沉淀(特别是免疫沉淀)、电化学发光(电产生的化学发 光)、RIA(放射性免疫测定法)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、三明治式 酶免疫测试、电化学发光三明治式免疫测定法(ECLIA)、解离增强镧系荧光 免疫测定法(DELFIA)、闪烁迫近测定法(SPA)、比浊法、浊度法、乳胶增强 的比浊法或浊度法、或固相免疫测试。本领域中已知的其它方法(诸如凝胶 电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western印迹、 和质谱术)可以单独或与如上文描述的标记或其它检测方法组合使用。

优选地，也可以如下测定肽或多肽的量：(a)使包含如上文规定的肽或多 肽的配体的固体支持物与包含肽或多肽的样品接触，并(b)测量与支持物结合 的肽或多肽的量。优选地，优选选自由核酸、肽、多肽、抗体和适体组成的 组的配体存在于固定化形式的固体支持物上。用于制造固体支持物的材料是 本领域中公知的，并且包括商品化的柱材料、聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁珠、 胶体金属颗粒、玻璃和/或硅芯片和表面、硝酸纤维素条、膜、片、duracytes、 反应盘的孔和壁、塑料管等。可以将配体或药剂与许多不同载体结合。公知 的载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、 右旋糖苷、尼龙、直链淀粉、天然的和经修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂 糖和磁铁矿，等等。出于本发明的目的，载体的性质可以是可溶性的或不溶 性的。适合于固定/固定化所述配体的方法是公知的，并且包括但不限于离子、 疏水性、共价相互作用，等等。还涵盖的是使用“悬浮阵列”作为依照本发 明的阵列(Nolan 2002,Trends Biotechnol.20(1):9-12)。在此类悬浮阵列中，载 体(例如微珠或微球)存在于悬浮液中。该阵列由携带不同配体的不同微珠 或微球(可能经标记)组成。例如基于固相化学和光敏保护基团生成此类阵 列的方法是公知的(US 5,744,305)。

如本文中使用的，术语“量”涵盖多肽或肽的绝对量、所述多肽或肽的 相对量或浓度及与其关联或可以自其衍生的任何数值或参数。此类数值或参 数包含通过直接测量从所述肽获得的所有特定物理或化学特性的强度信号 数值，例如质谱或NMR谱中的强度数值。此外，涵盖的是通过此描述中别处 规定的间接测量获得的所有数值或参数，例如从应答肽的生物学读出系统测 定的应答量或从特异性结合的配体获得的强度信号。应当理解，也可以通过 所有标准计算操作获得与前述量或参数关联的数值。依照本发明的优选实施 方案，通过公开的系统实施“量”的测定，其中基于由所述系统的一个或多 个分析仪单元实施的接触和测量步骤，计算装置测定“量”。

如本文中使用的，术语“比较”涵盖比较要分析的样品包含的肽或多肽 的量与本描述中别处规定的合适参照来源的量。应当理解，如本文中使用的 比较指比较相应的参数或数值，例如比较绝对量与绝对参照量，而比较浓度 与参照浓度或比较从测试样品获得的强度信号与参照样品的相同类型的强 度信号。可以手动或计算机辅助实施本发明的方法的步骤(b)中提及的比较。 如此，可以通过(例如本文中公开的系统的)计算装置实施本发明的方法的 步骤(b)中提及的比较。例如，可以将量和参照的数值彼此比较，并且可以通 过执行比较算法的计算机程序自动实施所述比较。实施所述评估的计算机程 序会以合适的输出形式提供期望的评估。对于计算机辅助比较，计算机程序 可以比较测定量的数值与数据库中存储的对应于合适参照的数值。计算机程 序可以进一步评估比较结果，即以合适的输出形式自动提供期望的评估。

对于计算机辅助比较，计算机程序可以比较测定量的数值与数据库中存 储的对应于相应参照的数值。计算机程序可以进一步评估比较结果，即以合 适的输出形式自动提供期望的评估。优选地，所述结果可以充当区别心脏栓 塞性和非心脏栓塞性缺血性中风的辅助。

例如，比较结果可以以原始数据(绝对或相对量)给出，且在一些情况 中以可以指示特定诊断的词、短语、符号、或数值形式的指标给出。

如本文中使用的，术语“参照量”指容许分配入患有心脏栓塞性缺血性 中风的受试者组或患有非心脏栓塞性缺血性中风的受试者组中的量。此类参 照量可以是将这些组彼此分开的阈值量。因而，生物标志物肌钙蛋白的参照 量应当是容许将受试者分配入患有心脏栓塞性缺血性中风的受试者组或患 有非心脏栓塞性缺血性中风的受试者组中的量。基于来自患有心脏栓塞性缺 血性中风的受试者或受试者组或患有非心脏栓塞性缺血性中风的受试者或 受试者组的心脏肌钙蛋白量，可以通过本文中别处提及的统计学测试在不额 外费力的情况下计算将两个组分开的合适的阈值量。本文中别处指示可以从 前述受试者或受试者组得到的优选参照量。

原则上可以通过应用标准统计学方法基于给定生物标志物的平均值或 均值数值对如上文规定的受试者分组计算参照量。特别地，测试诸如以诊断 事件与否为目的的方法的准确度以其接收者操作特征(receiver-operating  characteristics,ROC)进行最佳描述(尤其见Zweig 1993,Clin.Chem. 39:561-577)。ROC图是源自在观察到的整个数据范围里不断改变判定阈值的 所有灵敏性/特异性对的图。诊断方法的临床性能取决于其准确度，即其将受 试者正确分配到某种预后或诊断的能力。ROC图指示两种分布间的重叠，其 通过对适合于进行区别的整个阈值范围绘制灵敏性相对于1-特异性得到。y 轴上是灵敏性，或真阳性分数，其定义为真阳性测试结果的数目与真阳性测 试结果的数目和假阳性测试结果的乘积的比率。这在存在疾病或状况的情况 中也已经称为阳性。它仅从受影响的亚组计算。x轴上是假阳性分数，或1- 特异性，其定义为假阳性结果的数目与真阳性结果的数目和假阳性结果的数 目的乘积的比例。它是特异性的指数，并且完全从不受影响的亚组计算。由 于通过使用来自两个不同亚组的测试结果完全分开计算真和假阳性分数， ROC图不依赖于分组中的事件流行。ROC图上的每个点代表与特定判定阈值 对应的灵敏性/特异性对。具有完全辨别(结果的两个分布中没有重叠)的测 试具有通过上右角的ROC图，其中真阳性分数是1.0，或100％(完全灵敏性)， 且假阳性分数是0(完全特异性)。没有辨别(两组的结果的相同分布)的测 试的理论图是从下左角至上右角的45°对角线。大多数图落在这两个极值间。 若ROC图完全落到45°对角线下，则这容易通过将“阳性”标准从“大于” 反转到“小于”或反之亦然补救。在定性上，图越接近上左角，测试的总体 准确度越高。根据期望的置信区间，可以从ROC曲线得到阈值，容许以灵敏 性和特异性的适当平衡诊断或预测给定事件。因而，优选地，要用于前述本 发明的方法的参照可以是阈值或截留量，并且优选地，可以通过如上文描述 的那样为所述分组建立ROC并且自其得到阈值量产生。根据诊断方法的期望 灵敏性和特异性，ROC图容许得到合适的阈值。

可以基于计算“量”与参照或阈值的所述比较通过本文中公开的系统的 计算装置提供本文中提及的诊断/区别。例如，系统的计算装置可以提供指示 一种心脏栓塞性中风或非心脏栓塞性中风的词、符号、或数值形式的指标。

优选地，从已知患有心脏栓塞性缺血性中风的受试者或受试者的组得到 一个或多个参照量。在此情况中，优选地，与参照量相比测试样品中心脏肌 钙蛋白的基本上相同的量或增加的量指示心脏栓塞性缺血性中风。若还测定 利尿钠肽，则优选地，与心脏肌钙蛋白的参照量和利尿钠肽的参照量相比测 试样品中心脏肌钙蛋白的和利尿钠肽的基本上相同的量或增加的量指示心 脏栓塞性缺血性中风。

还优选地，可以从已知患有非心脏栓塞性缺血性中风的受试者或受试者 的组得到心脏肌钙蛋白(和任选利尿钠肽)的参照量。在此情况中，与参照 量相比测试样品中心脏肌钙蛋白(和任选利尿钠肽)的基本上相同的量或减 少的量指示非心脏栓塞性缺血性中风。若还测定利尿钠肽，则与心脏肌钙蛋 白的参照量和利尿钠肽的参照量相比测试样品中心脏肌钙蛋白的和利尿钠 肽的基本上相同的量或减少的量指示非心脏栓塞性缺血性中风。

适用于个别受试者的参照量可以随多种生理学参数诸如年龄、性别、或 亚群及随用于测定本文中提及的多肽或肽的手段而变化。可以从要与测试样 品一起(即同时或随后)分析的参照样品测定合适的参照量。

此外，参照量可以限定心脏肌钙蛋白(和任选利尿钠肽)的阈值量，特 别是计算的参照量，由此大于相应阈值的测试受试者的样品中的肌钙蛋白 (和任选利尿钠肽)量应当指示心脏栓塞性缺血性中风，而低于相应阈值的 测试受试者的样品中的肌钙蛋白(和任选利尿钠肽)量应当指示非心脏栓塞 性中风。

下文指示优选的参照量：

指示心脏栓塞性缺血性中风的优选参照量是约8pg/ml至约40pg/ml且更 优选10至30pg/ml，约11.6至约20pg/ml，甚至更优选约15至20pg/ml的心脏肌 钙蛋白，特别是肌钙蛋白T的量。甚至更优选地，参照是约8、10、或11.6pg/ml 的量。与参照量相比测试样品中基本上相同或增加的测试量应当指示心脏栓 塞性缺血性中风，而减少的量应当指示非心脏栓塞性缺血性中风。优选地， 从已知患有心脏栓塞性缺血性中风的受试者或受试者的组得到前述参照量。

本发明特别可用于排除心脏栓塞性中风。特别地，低于5pg/ml，特别是 低于3或低于2pg/mg的心脏肌钙蛋白(优选肌钙蛋白T)的测试量指示受试者 未患有心脏栓塞性中风(且如此优选患有非心脏栓塞性中风)。

指示心脏栓塞性缺血性中风的优选参照量是约500pg/ml至约1500pg/ml 且更优选700至1300pg/ml，甚至更优选约800至1000pg/ml的利尿钠肽，特别 是NT-原BNP的量。甚至更优选地，参照是约700，800，或最优选900pg/ml 的量。与参照量相比测试样品中基本上相同或增加的测试量应当指示心脏栓 塞性缺血性中风，而减少的量应当指示非心脏栓塞性缺血性中风。优选地， 自已知患有心脏栓塞性缺血性中风的受试者或受试者的组得到前述参照量 (在心脏肌钙蛋白的量外)。

如上文列出的，本发明特别可用于排除心脏栓塞性中风。特别地，低于 250pg/ml，特别是低于200或低于150pg/mg的利尿钠肽，特别是NT-原BNP的 测试量指示受试者未患有心脏栓塞性中风(且如此优选患有非心脏栓塞性中 风)。

术语“约”在本发明的上下文中意指所述数值的+/-20％、+/-10％、+/-5％、 +/-2％或+/-1％。这还考虑由测量技术、统计学等引起的常见偏差。

在本发明的方法的一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括向所述 受试者(尤其是，若受试者已经诊断为患有心脏栓塞性中风)推荐疗法。可 以对患有心脏栓塞性中风的受试者推荐的疗法是溶解疗法和/或抗凝疗法(见 例如Cairns J.A.等Canadian J of Cardiology 2011:27:74–90或Camm A.J.等 Eur Heart Journal 2010:31:2369–429，通过提及将它们都收入本文)。

在本发明的一个方面中，涵盖用于区别受试者患有心脏栓塞性缺血性中 风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风的方法，所述方法包括：

a)如下测定来自患有缺血性中风的受试者的样品中的心脏肌钙蛋白量， 即(i)使样品与特异性结合所述心脏肌钙蛋白的检测剂接触一段时间，该时间 足以容许形成所述检测剂和来自样品的心脏肌钙蛋白的复合物，(ii)测量形成 的复合物的量，其中形成的复合物的所述量与样品中存在的心脏肌钙蛋白量 成比例，并(iii)将形成的复合物的量转化成心脏肌钙蛋白的量，其反映样品 中存在的标志物的量；

b)比较所述量与参照；并

c)基于步骤b)中进行的比较的结果，建立用于区别受试者患有心脏栓塞 性缺血性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风的辅助。

优选地，还测定利尿钠肽的量。

在本发明的另一个方面中，涵盖用于区别受试者患有心脏栓塞性缺血性 中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风的系统，其包含：

a)分析仪单元，其配置为使来自患有缺血性中风的受试者的样品与特异 性结合标志物心脏肌钙蛋白的检测剂接触一段时间，该时间足以容许形成所 述检测剂和来自样品的标志物的复合物，

b)分析仪单元，其配置为测量形成的复合物的量，其中形成的复合物 的所述量与样品中存在的标志物量成比例

c)计算装置，其具有处理器且与所述分析单元可操作通信，和

d)非瞬时机器可读介质，其包含多个由处理器可执行的指令，该指令 在执行时将形成的复合物的量转化成反映样品中存在的标志物量的标志物 量，比较所述量与参照，并基于与所述参照的所述比较的结果，建立用于区 别受试者患有心脏栓塞性缺血性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风的 辅助。

优选地，系统还包含特异性结合利尿钠肽的检测剂。

在一个方面，合适的检测剂可以是抗体，其特异性结合要通过本发明的 方法调查的受试者的样品中的心脏肌钙蛋白。在一个方面，可以应用的另一 种检测剂可以是特异性结合样品中的标志物的适体。在又一个方面，自检测 剂和标志物之间形成的复合物除去样品，之后测量形成的复合物的量。因而， 在一个方面，可以将检测剂在固体支持物上固定化。在又一个方面，可以通 过应用清洗溶液从固体支持物上形成的复合物除去样品。形成的复合物应当 与样品中存在的标志物的量成比例。应当理解，要应用的检测剂的特异性和 /或灵敏性限定样品中包含的能够被特异性结合的至少一种标志物的比例程 度。关于如何可以实施测定的更多详情在本文中别处也找得到。应当将形成 的复合物的量转化成反应样品中确实存在的量的标志物量。在一个方面，此 类量可以基本上是样品中存在的量或者在另一个方面可以是由于形成的复 合物和初始样品中存在的量之间的关系而作为其某种比例的量。

在前述方法的又一个方面，可以通过分析仪单元，在一个方面，如本文 中别处定义的分析仪单元实施步骤a)。

在本发明的方法的一个方面，比较步骤a)中测定的量与参照。在一个方 面，参照是如本文中别处定义的参照。在又一个方面，参照考虑测量的复合 物量和初始样品中存在的量之间的比例关系。如此，本发明方法的一个方面 中应用的参照是人工参照，其用来反映已经使用的检测剂的限制。在另一个 方面，也可以在例如通过包含测定量的标准化和/或校正计算步骤，之后实际 比较测定量和参照的数值实施比较时考虑所述关系。此外，测定量的标准化 和/或校正计算步骤采用比较步骤，使得正确反映已经使用的检测剂的限制。 在一个方面，自动实施比较，例如通过计算机系统等辅助。

基于步骤b)中实施的比较建立用于区别受试者患有心脏栓塞性缺血性 中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风的辅助，其通过将受试者分配为(i)患 有心脏栓塞性中风的受试者组或(ii)患有非心脏栓塞性中风的组进行，如本文 中别处列出的。如本文中已经在别处讨论的，调查受试者的分配不一定在 100％的调查病例中是正确的。此外，调查受试者分配的受试者组是人工组， 因为它们是基于统计学考虑(即本发明方法应当以其为基础运行的某种预先 选择的概率程度)建立的。在本发明的一个方面，用于区别的辅助是自动建 立的，例如通过计算机装置等辅助，如本文中描述和公开的。

在本发明方法的一个方面，所述方法进一步包括依照步骤c)中建立的结 果推荐和/或管理受试者的步骤，如本文中别处详细列出的。

在前述方法的一个方面，通过如本文中别处列出的一个或多个分析仪单 元实施步骤b)和/或c)。

用于诊断心房肌纤维震颤的方法

心房肌纤维震颤(AF)通常是患者认识不到的。在约40％的患者中是这种 情况，指示构成的病史在心房肌纤维震颤的诊断方面不灵敏(history taking in  insensitive for the diagnosis of atrial fibrillation)(Kamel H.等,Curr Atheroscler  Rep2011:13:338–343)。虽然这些数目涉及持续性心房肌纤维震颤，但是阵 发性心房肌纤维震颤甚至更难以诊断，并且仅可以通过住院病人心脏遥测术 (cardiac telemetry)或甚至Jolter监测来捕捉。后一种具有的优点在于将ECG记 录，并且后来可以被有经验的临床医生审阅。使用Holter ECG，阵发性(先前 未被识别的)心房肌纤维震颤比持续性心房肌纤维震颤更频繁(Rizos T.等 Cerebrovasc.Dis 2011:32:276–282)。为了可靠地捕捉阵发性/缺血性心房肌 纤维震颤，72小时Holter监测似乎是必需的(Gumbinger C等,Europ.J of  Neurology 2011提前出版)。如此，阵发性心房肌纤维震颤的识别是一项重 大的考验，具体地，由于至少1％的一般群体具有持续性心房肌纤维震颤， 并且频率随年龄而增加(Rizos T.等)。

发明人已经发现了心脏肌钙蛋白的测定容许诊断心房肌纤维震颤。令人 感兴趣地，间歇性AF患者还具有升高的心脏肌钙蛋白水平。因此，也可以通 过测定心脏肌钙蛋白的量鉴定展现出间歇性AF的患者。

上文给出的定义和解释对本发明的以下实施方案应用必要的修改。

此外，本发明涉及在怀疑患有心房肌纤维震颤的受试者中诊断心房肌纤 维震颤的方法，其包括a)测定来自所述受试者的样品中的心脏肌钙蛋白量。

在一个优选的实施方案中，所述方法还包括以下步骤：

b)比较所述心脏肌钙蛋白的如此测定的量与参照量。由此，诊断间歇 性心房肌纤维震颤。

因而，本发明涉及在怀疑患有心房肌纤维震颤的受试者中诊断心房肌纤 维震颤的方法，其包括：

a)测定来自所述受试者的样品中的心脏肌钙蛋白量，并

b)比较所述心脏肌钙蛋白的如此测定的量与参照量。由此，诊断间歇 性心房肌纤维震颤，由此，诊断间歇性心房肌纤维震颤。

优选地，通过实施进一步的步骤c)诊断受试者患有心房肌纤维震颤与否 来诊断受试者患有心房肌纤维震颤与否。

优选地，诊断间歇性心房肌纤维震颤。

因而，本发明特别涉及在怀疑患有心房肌纤维震颤的受试者中诊断间歇 性心房肌纤维震颤的方法，其包括：

a)测定来自所述受试者的样品中的心脏肌钙蛋白量，并

b)比较所述心脏肌钙蛋白的如此测定的量与参照量。由此，诊断间歇 性心房肌纤维震颤，由此，诊断间歇性心房肌纤维震颤。

在本发明的方法的一个优选的实施方案中，步骤a)进一步包括测定来自 所述受试者的样品中的利尿钠肽量。优选地，在步骤b)中比较利尿钠肽的如 此测定的量与利尿钠肽的参照量。

如此，本发明还涉及在怀疑患有心房肌纤维震颤的受试者中诊断心房肌 纤维震颤的方法，其包括：

a)测定来自所述受试者的样品中的心脏肌钙蛋白和利尿钠肽的量，并

b)比较如步骤a)中测定的所述心脏肌钙蛋白的量与心脏肌钙蛋白的参 照量，并且比较所述利尿钠肽的量与利尿钠肽的参照量，与此诊断心房肌纤 维震颤。

术语“心房肌纤维震颤”是本领域中公知的。心房肌纤维震颤的综述见 例如Fuster等，在此通过提及将其完整收录(Fuster V,Rydén LE,Asinger RW等 ACC/AHA/ESC Guidelines for the Management of Patients With Atrial  Fibrillation:Executive Summary A Report of the American College of  Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines and  the European Society of Cardiology Committee for Practice Guidelines and  Policy Conferences(Committee to Develop Guidelines for the Management of  Patients With Atrial Fibrillation)Developed in Collaboration With the North  American Society of Pacing and Electrophysiology.Circulation.Oct 23 2001；104(17):2118-50)。心房肌纤维震颤是一种异常的心脏节律，其牵涉心 脏的两个上室。在正常的心脏节律中，由窦房结产生的脉冲扩散到心脏，并 且引起心肌收缩和血液泵送。在心房肌纤维震颤中，窦房结的规则电脉冲被 无组织的、快速的电脉冲替换，其导致不规则的心搏。

心房肌纤维震颤(AF)可以是永久性、持续性或间歇性(关于这些术语的 解释，还可见Fuster等(同上))。

若AF已经持续超过一年，则优选地，受试者患有永久性AF。特别地， 不发生回到窦性心律的转变(或仅在治疗时回到窦性心律)。

若AF持续超过7天，并且会需要药理或电干预以终止心房肌纤维震颤， 则优选地，受试者患有持续性AF。如此，持续性AF以事件方式发生(occurs in  episodes)，但是心律失常不自动转变回到窦性心律。

若存在有同时终止的心房肌纤维震颤事件，则优选地，受试者患有间歇 性AF(通常又称为阵发性AF)。心房肌纤维震颤的事件可以从几秒持续到几 天。优选地，事件持续小于1小时。

在前述方法的背景中，优选地，诊断间歇性心房肌纤维震颤。

可以容易地诊断永久性和持续性心房肌纤维震颤，例如在心电图上。优 选地，特征性发现是缺乏P波、其原位的无组织的电活动(unorganized electrical  activity in their place)、和由于脉冲对心室的不规则传导所致的R—R时间间隔 不规则。间歇性心房肌纤维震颤更难以诊断，因为诊断仅在心房肌纤维震颤 事件期间是有可能的。

令人惊讶地，发明人已经发现了测定怀疑患有心房肌纤维震颤的受试者 的样品中的心脏肌钙蛋白(和任选利尿钠肽)容许诊断心房肌纤维震颤。特 别地，升高的心脏肌钙蛋白水平指示受试者患有AF，而降低的心脏肌钙蛋白 水平指示受试者未患有AF。此外，测定心脏肌钙蛋白还容许诊断间歇性AF， 即使在缺乏AF事件的情况下(在获得样品的时间点时)。如此，通过实施前 述方法，优选地，在缺乏心房肌纤维震颤的事件的情况下，特别是在获得样 品的时间点时诊断出间歇性心房肌纤维震颤。如此，优选地，受试者在获得 样品时未患有AF事件。

依照本发明的前述方法的受试者应当怀疑患有心房肌纤维震颤。优选 地，怀疑患有心房肌纤维震颤(例如间歇性心房肌纤维震颤)的受试者是具 有一种或多种心房肌纤维震颤风险的受试者。这些风险因素是本领域中公知 的，并且包括心脏病，包括瓣膜问题和心脏病发作和心脏手术史、系统性高 血压(特别若它没有通过生活方式改变或药物充分控制)，和饮酒。优选地， 受怀疑的受试者属于风险组。特别地，涵盖的是，受试者是具有证实或疑似 的心脏病症的受试者，包括具有对心脏病症有素因的风险因素的受试者，诸 如动脉或系统性高血压、糖尿病、吸烟者、具有高脂血或代谢综合征体征的 个体(特别若受试者为老年年龄(年龄超过60、65、70和优选75岁)。或者/ 另外，优选地，受试者可以患有瓣膜病症，优选二尖瓣病变。进一步涵盖的 是，怀疑患有AF的受试者患有甲状腺功能亢进。

在本发明的方法的一个优选的实施方案中，优选地，怀疑患有心房肌纤 维震颤的受试者患有缺血性中风，特别是心脏栓塞性缺血性中风(对于这些 术语的解释，参见本文中别处)。若要依照前述方法测试的受试者患有缺血 性中风，则优选地，在用于早期区别受试者患有心脏栓塞性中风还是非心脏 栓塞性缺血性中风的方法的背景中在如描述的中风症状发作后立即获得样 品。

然而，还优选的是，要测试的受试者未患有缺血性中风。

优选地，结合前述方法的参照量从已知患有心房肌纤维震颤的受试者 (或受试者组)得到，且其中与参照量相比，心脏肌钙蛋白(和任选利尿钠 肽)的相同量，或增加的心脏肌钙蛋白(和任选利尿钠肽)量指示受试者患 有心房肌纤维震颤。另外/或者，参照量从已知未患有心房肌纤维震颤的受试 者或此类受试者的组得到，其中与参照量相比，心脏肌钙蛋白(和任选利尿 钠肽)的相同量，或减少的心脏肌钙蛋白Troponin(和任选利尿钠肽)量指 示受试者未患有心房肌纤维震颤。

此外，参照量可以限定心脏肌钙蛋白(和任选利尿钠肽)的阈值量，由 此与相应的阈值大的测试受试者的样品中肌钙蛋白(和任选利尿钠肽)的量 应当指示心房肌纤维震颤，而与相应的阈值小的测试受试者的样品中肌钙蛋 白(和任选利尿钠肽)的量应当指示受试者未患有心房肌纤维震颤。

下文指示优选的参照量：

指示心房肌纤维震颤的优选参照量是约6pg/ml至约40pg/ml且更优选地， 8至30pg/ml，或约10至约20pg/ml，甚至更优选约15至20pg/ml的心脏肌钙蛋 白，特别是肌钙蛋白T的量。甚至更优选地，参照是约10pg/ml，或最优选地， 约7pg/ml的量。与参照量相比，测试样品中基本上相同或增加的测试量应当 指示心房肌纤维震颤，而减少的量应当指示受试者未患有心房肌纤维震颤。 优选地，前述参照量从已知患有心房肌纤维震颤的受试者或受试者组得到。

指示心房肌纤维震颤的优选参照量是约300pg/ml至约1500pg/ml且更优 选地，400至1300pg/ml，甚至更优选约500至1000pg/ml的利尿钠肽，特别是 NT-原BNP的量。甚至更优选地，参照是约500、400、或最优选地，约300pg/ml 的量。与参照量相比，测试样品中基本上相同或增加的测试量应当指示心房 肌纤维震颤，而减少的量应当指示受试者未患有心房肌纤维震颤。优选地， 前述参照量从已知患有心房肌纤维震颤的受试者或受试者组得到。

如上文所列，间歇性心房肌纤维震颤的诊断是挑战性的，而永久性或持 续性心房肌纤维震颤的诊断是相当容易的。由于可以无需费力鉴定具有永久 性和持续性心房肌纤维震颤的受试者，特别感兴趣的是鉴定那些未患有永久 性或持续性心房肌纤维震颤，但是患有间歇性心房肌纤维震颤的受试者。

令人感兴趣地，在本发明的研究的背景中已经显示了心脏肌钙蛋白和利 尿钠肽的水平在具有间歇性心房肌纤维震颤的受试者中比在具有持续性或 永久性心房肌纤维震颤的受试者中低。这是有利的，因为测定心脏肌钙蛋白 和任选地利尿钠肽容许鉴定那些患有间歇性肌纤维震颤的患者。

因此，在本发明的一个优选的实施方案中，应当诊断间歇性心房肌纤维 震颤，特别是在怀疑患有间歇性心房肌纤维震颤的受试者中。

为了容许诊断间歇性AF，应当在步骤b)中比较如步骤a)中测定的心脏肌 钙蛋白的量和任选地利尿钠肽的量与两个参照量。涵盖的是，第一参照量从 已知患有间歇性AF的受试者(或此类受试者的组)得到，而第二参照量从已 知患有永久性或特别是持续性AF的受试者(或此类受试者的组)得到。当然， 参照量应当从前述受试者的样品得到。

优选地，测试受试者的样品中心脏肌钙蛋白和任选地利尿钠肽的如下量 指示间歇性AF的诊断，所述量基本上等于或大于从已知患有间歇性AF的受 试者(或此类受试者的组)得到的参照量(对于心脏肌钙蛋白和任选地对于 利尿钠肽)，但是其低于从已知患有永久性或持续性AF的受试者(或此类受 试者的组)得到的参照量。

从已知患有间歇性AF的受试者(或此类受试者的组)得到的心脏肌钙蛋 白，特别是肌钙蛋白T的优选参照量在约5至10pg/ml的范围内。优选地，参 照量是约9pg/ml。

从已知患有永久性或持续性AF的受试者(或此类受试者的组)得到的心 脏肌钙蛋白，特别是肌钙蛋白T的优选参照量在约12至25pg/ml的范围内。优 选地，参照量是约18pg/ml。

从已知患有间歇性AF的受试者(或此类受试者的组)得到的利尿钠肽， 特别是NT-原BNP的优选参照量在约300至500pg/ml的范围内。优选地，参照 量是约350pg/ml。

从已知患有永久性或持续性AF的受试者(或此类受试者的组)得到的利 尿钠肽，特别是NT-原BNP的优选参照量在约900至1500pg/ml的范围内。优 选地，参照量是约900pg/ml。

在诊断AF的方法的另一个优选的实施方案中，诊断出间歇性AF。应当 知道依照此优选实施方案的受试者未患有永久性和/或持续性心房肌纤维震 颤(其可以不费力测定，参见上文)。

如此，还涵盖的是用于在怀疑患有间歇性心房肌纤维震颤，但是已知未 患有持续性和/或永久性心房肌纤维震颤的受试者中诊断间歇性心房肌纤维 震颤的方法，其包括

a)在来自所述受试者的样品中测定心脏肌钙蛋白(和任选地利尿钠肽) 的量，并

b)比较所述心脏肌钙蛋白(和任选地所述利尿钠肽)的如此测定的量 与参照量，由此诊断间歇性心房肌纤维震颤。

优选地，怀疑患有间歇性AF的受试者与患有AF的受试者具有相同的风 险因素(参见本文中别处)。特别地，涵盖的是受试者患有缺血性中风，特 别是心脏栓塞性缺血性中风。

要在本发明的背景中应用的参照量应当从已知患有间歇性AF或已知未 患有AF的受试者得到。

优选地，结合前述方法的参照量从已知患有间歇性心房肌纤维震颤的受 试者(或受试者组)得到，且其中与参照量相比，心脏肌钙蛋白(和任选利 尿钠肽)的相同量，或增加的心脏肌钙蛋白(和任选利尿钠肽)量指示受试 者患有间歇性心房肌纤维震颤。另外/或者，参照量从已知未患有心房肌纤维 震颤的受试者或此类受试者的组得到，其中与参照量相比，心脏肌钙蛋白 Troponin(和任选利尿钠肽)的相同量，或减少的心脏肌钙蛋白(和任选利 尿钠肽)量指示受试者未患有间歇性心房肌纤维震颤。

指示间歇性心房肌纤维震颤的优选参照量是约5pg/ml至约30pg/ml且更 优选地，5至25pg/ml，或约6至约10pg/ml，甚至更优选约6至8pg/ml的心脏肌 钙蛋白，特别是肌钙蛋白T的量。甚至更优选地，参照是约8pg/ml，或最优 选地，约7pg/ml的量。与参照量相比，测试样品中基本上相同或增加的测试 量应当指示间歇性心房肌纤维震颤，而减少的量应当指示受试者未患有间歇 性心房肌纤维震颤。优选地，前述参照量从已知患有间歇性心房肌纤维震颤 的受试者或受试者组得到。

指示间歇性心房肌纤维震颤的优选参照量是约300pg/ml至约800pg/ml且 更优选地，300至700pg/ml，甚至更优选约350至500pg/ml的利尿钠肽，特别 是NT-原BNP的量。甚至更优选地，参照是约500、400、或最优选地，约 300pg/ml的量。与参照量相比，测试样品中基本上相同或增加的测试量应当 指示间歇性心房肌纤维震颤，而减少的量应当指示受试者未患有间歇性心房 肌纤维震颤。优选地，前述参照量从已知患有间歇性心房肌纤维震颤的受试 者或受试者组得到。

在本发明的前述方法的一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括若 受试者已经诊断为患有心房肌纤维震颤，特别是间歇性心房肌纤维震颤，为 所述受试者推荐疗法。可以对患有心房肌纤维震颤的受试者推荐的优选的疗 法例如由Fuster等(Fuster等J Am Coll Cardiol 2001:38:1231,and Fuster V.等 Circulation 2006:114至257)描述。优选的疗法包括施用β阻断剂、非二氢吡啶 钙通道阻断剂、地高辛、维生素K拮抗剂、阿司匹林、乙酰基水杨酸 (acetylsalicylic acid)。此外，可以推荐药理或电干预以终止心房肌纤维震颤。 优选地，药理干预包括施用氟卡尼(flecainide)、多非利特(dofetilide)、普罗帕 酮(propafenone)和/或伊布利特(ibutilide)。进一步涵盖施用因子Xa抑制剂，诸 如Rivaroxoban和/或达比加群(dabigatran)(参见Patel M.R.等,NEJM 2011:365: 883–91；Connolly S.J.等NEJM 2010:261:1139–51)。

前述方法的优选实施方案：

优选地，诊断间歇性心房肌纤维震颤。

在一个优选的实施方案中，受试者未患有缺血性中风。

在另一个优选的实施方案中，怀疑患有心房肌纤维震颤的受试者患有缺 血性中风，特别是心脏栓塞性中风，且其中样品在缺血性中风的症状发作后 立即获得。优选地，来自所述受试者的样品在缺血性中风的症状发作后不超 过12小时，特别是缺血性中风的症状发作后不超过6小时或不超过3小时获 得。

在一个优选的实施方案中，其中已知所述受试者未患有持续性和/或永久 性心房肌纤维震颤，特别是其中参照量从已知患有间歇性心房肌纤维震颤的 受试者或此类受试者的组得到，且其中与参照量相比心脏肌钙蛋白的相同量 或增加的心脏肌钙蛋白量指示受试者患有间歇性心房肌纤维震颤，和/或其中 参照量从已知未患有心房肌纤维震颤的受试者或此类受试者的组得到，其中 与参照量相比心脏肌钙蛋白的相同量，或减少的心脏肌钙蛋白Troponin量指 示受试者未患有间歇性心房肌纤维震颤。

在另一个优选的实施方案中，比较来自受试者的样品中的心脏肌钙蛋白 的量与两个参照量，其中第一参照量从已知患有间歇性AF的受试者或此类受 试者的组得到，而第二参照量从已知患有永久性或持续性AF的受试者或此类 受试者的组得到。优选地，受试者的样品中心脏肌钙蛋白的如下量指示间歇 性AF的诊断，所述量基本上等于或大于第一参照量，但是其低于从已知患有 永久性或持续性AF的受试者得到的第二参照量。

在一个优选的实施方案中，方法进一步包括测定利尿钠肽，特别是脑利 尿钠肽，特别是BNP和NT-原BNP的量。

优选地，在缺乏心房肌纤维震颤事件的情况中，特别是在获得样品的时 间点时诊断间歇性心房肌纤维震颤。

在本发明的另一个方面，涵盖用于诊断AF，特别是间歇性AF的系统， 其包含：

a)分析仪单元，其配置为使来自怀疑患有AF，特别是间歇性AF的受试 者的样品与特异性结合标志物心脏肌钙蛋白的检测剂接触一段时间，该时间 段足以容许所述检测剂和来自样品的标志物的复合物的形成，

b)分析仪单元，其配置为测量形成的复合物的量，其中形成的复合物 的所述量与样品中存在的标志物的量成比例，

c)计算装置，其具有处理器且与所述分析单元可操作通信，和

d)非瞬时机器可读介质，其包含多个由处理器可执行的指令，该指令 在执行时将形成的复合物的量转化成反映样品中存在的标志物量的标志物 量，比较所述量与参照，并且基于与所述参照的所述比较的结果建立用于诊 断AF，特别是间歇性AF的辅助。

优选地，系统还包含特异性结合利尿钠肽的检测剂。

在前述方法的又一个方面，可以通过分析仪单元，在一个方面，如本文 中别处定义的分析仪单元实施步骤a)。

在本发明方法的一个方面，比较步骤a)中测定的量与参照。在一个方面， 参照是如本文中别处定义的参照。在又一个方面，参照考虑测量的复合物量 和初始样品中存在的量之间的比例关系。如此，本发明方法的一个方面中应 用的参照是人工参照，其用于反映已经使用的检测剂的限度。在另一个方面， 在实施比较时也可以考虑所述关系，例如通过在实际比较测定量和参照的数 值前包括测定量的标准化和/或校正计算步骤。此外，测定量的标准化和/或 校正计算步骤采用比较步骤，使得已经使用的检测剂的限度得到正确反映。 在一个方面，自动实施比较，例如通过计算机系统等辅助。

基于步骤b)中实施的比较，建立用于诊断AF，特别是间歇性AF的辅助， 其通过将受试者分配为(i)患有AF的受试者的组或(ii)未患有AF的受试者的 组，如本文中别处列出的。如本文中别处已经讨论的，研究受试者的分配不 必在100％的研究情况中是正确的。此外，其中分配有研究受试者的受试者 组是人工组，因为它们基于统计学考虑(即本发明方法应当以其为基础运行 的某个预先选择的可能性程度)建立。在本发明的一个方面，用于优化风险 评估的辅助是自动建立的，例如通过如本文中描述并公开的计算装置等辅 助。

在本发明方法的一个方面，所述方法进一步包括依照如本文中别处详细 列出的步骤c)中建立的结果推荐和/或管理受试者的步骤。

在前述方法的一个方面，通过本文中别处列出的一个或多个分析仪单元 实施步骤b)和/或c)。

此外，本发明涉及心脏肌钙蛋白和/或特异性结合患有缺血性中风的受试 者样品中的心脏肌钙蛋白的检测剂(和任选地利尿钠肽和/或特异性结合利尿 钠肽的检测剂)用于早期区别受试者患有心脏栓塞性缺血性中风还是患有非 心脏栓塞性缺血性中风的用途，其中已经在缺血性中风的症状发作后立即获 得所述样品。优选地，所述样品已经在中风的症状发作后不超过6小时获得。

本发明还涵盖心脏肌钙蛋白和/或特异性结合怀疑患有心房肌纤维震颤 的受试者样品中的心脏肌钙蛋白的检测剂(和任选地利尿钠肽和/或特异性结 合利尿钠肽的检测剂)用于诊断所述受试者中的心房肌纤维震颤的用途。优 选地，诊断间歇性心房肌纤维震颤。

如本文中使用的，术语“检测剂”指能够特异性识别并结合样品中存在 时本文中提及的生物标志物(心脏肌钙蛋白或利尿钠肽)的药剂。此外，所 述药剂应当容许由所述药剂和生物标志物形成的复合物的直接或间接检测。 可以通过将可检测标记物纳入药剂中实现直接检测。可以通过特异性结合包 含生物标志物和检测剂的复合物的别的药剂实现间接标记，其中所述别的药 剂能够产生可检测信号。可以用作检测剂的合适化合物是本领域中公知的。 优选地，检测剂是特异性结合生物标志物的抗体或适体。如本文中提及的抗 体包括多克隆和单克隆抗体两者，及能够结合抗原或半抗原的其片段，诸如 Fv、Fab和F(ab)₂片段。还涵盖的是单链抗体和人源化杂合抗体，其中组合展 现出期望的抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人接受者抗体的序 列。

本发明进一步涉及用于在患有缺血性中风的受试者中早期区别受试者 患有心脏栓塞性缺血性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风的装置，所述 装置包含：

a)分析单元(或分析仪单元)，其包含容许测定所述心脏肌钙蛋白量的 针对心脏肌钙蛋白的检测剂(和任选地针对利尿钠肽的检测剂，其容许测定 所述利尿钠肽的量)；和

b)评估单元(或分析仪单元)，其包含已经执行算法的数据处理器，所 述算法用于比较由所述分析单元测定的量与数据库中存储的一个或多个参 照量以区别受试者患有心脏栓塞性缺血性中风还是患有非心脏栓塞性缺血 性中风，其中参照量从来自参照受试者的样品得到，所述参照受试者如用于 区别受试者患有心脏栓塞性缺血性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风 的方法的背景中在本文中别处描述的，且所述算法是如所述方法的背景中限 定的算法。

本发明进一步涉及用于在怀疑患有心房肌纤维震颤的受试者中诊断心 房肌纤维震颤，特别是间歇性心房肌纤维震颤的装置，所述装置包含：

a)分析单元(或分析仪单元)，其包含容许测定所述心脏肌钙蛋白量的 针对心脏肌钙蛋白的检测剂(和任选地针对利尿钠肽的检测剂，其容许测定 所述利尿钠肽的量)；和

b)评估单元(或分析仪单元)，其包含已经执行算法的数据处理器，所 述算法用于比较由所述分析单元测定的量与数据库中存储的一个或多个参 照量以诊断心房肌纤维震颤，特别是间歇性心房肌纤维震颤，其中参照量从 来自参照受试者的样品得到，所述参照受试者如用于诊断心房肌纤维震颤 (特别是间歇性心房肌纤维震颤)的方法的背景中在本文中别处描述的，且 所述算法是如用于诊断心房肌纤维震颤(特别是心房肌纤维震颤)方法的背 景中限定的算法。

如本文中使用的，术语“装置”指包含彼此操作连接以容许依照本发明 方法诊断的前述单元的系统。可以用于分析单元的优选检测剂在本文中别处 公开。优选地，分析单元包含固定支持物上固定化形式的所述检测剂，其要 与包含要测定其量的生物标志物的样品接触。此外，分析单元还可以包含检 测仪，其测定与生物标志物特异性结合的检测剂的量。可以将测定量转送至 评估单元。所述评估单元包含数据处理元件，诸如计算机，其具有执行的算 法，用于实施测定量和合适参照之间的比较。合适的参照可以从要用于生成 参照量的受试者的样品得到，如上文别处描述的。诊断结果可以以参数诊断 原始数据的输出，优选以绝对或相对量给出。应当理解，这些数据可能需要 临床医生解读。然而，还涵盖专家系统装置，其中输出包括处理过的诊断原 始数据，其解读不需要专门的临床医生。优选地，本发明的装置可以用于以 自动化方式实施本发明的前述方法。

本公开内容的优选实施方案包括用于引导运用的系统，如本文中列出 的。系统的例子包括临床化学分析仪、凝血化学分析仪、免疫化学分析仪、 尿液分析仪、核酸分析仪，其用于检测化学或生物学反应的结果或监测化学 或生物学反应的进程。更具体地，本公开内容的例示性系统可以包括Roche  Elecsys^TMSystems和e免疫测定分析仪、Abbott Architect^TM和Axsym^TM分析仪、Siemens Centaur^TM和Immulite^TM分析仪、和Beckman Coulter  UniCelTM和AcessTM分析仪，等等。

系统的实施方案可以包括用于实施本公开内容的一个或多个分析仪单 元。本文中公开的系统的分析仪单元经由已知的有线连接、蓝牙、LANS、 或无限信号中的任一种与本文中公开的计算装置可操作通信。另外，依照本 公开内容，分析仪单元可以包含独立的装置，或较大仪器内的模块，其实施 一种或两种检测，例如为了诊断目的的样品定性和/或定量评估。例如，分析 仪单元可以实施或帮助样品和/或试剂的移液、剂量给药、混合。分析仪单元 可以包含试剂保持单元，用于保持试剂以实施测定法。例如，可以将试剂排 列为含有个别试剂或试剂组的容器或盒形式，其在贮存室或输送机内的合适 容器或位置中放置。检测试剂也可以为与样品接触的固体支持物上的固定化 形式。此外，分析仪单元可以包含针对特定分析可优化的过程和/或检测成分。

依照一些实施方案，分析仪单元可以配置为用于用样品光学检测分析 物，例如标志物。配置用于光学检测的例示性分析仪单元包含配置用于将电 磁能转化成电信号的装置，其包含单和多元件或阵列光学检测仪。依照本公 开内容，光学检测仪能够监测光学电磁信号，并且提供相对基线信号电出口 信号或应答信号，所述基线信号指示位于光程中的样品中分析物的存在和/ 或浓度。此类装置还可以包括例如光电二极管，包括雪崩光二极管、光电晶 体管、光电导检测仪、线性传感器阵列、CCD检测仪、CMOS检测仪，包括 CMOS阵列检测仪、光电倍增管、和光电倍增管阵列。依照某些实施方案， 光学检测仪，诸如光电二极管或光电倍增管可以含有别的信号调整或处理电 子学。例如，光学检测仪可以包含至少一个前置放大器、电子滤波器、或集 成电路。合适的前置放大器包括例如积分、互阻抗、和电流增益(电流反射 镜)前置放大器。

另外，依照本公开内容的一个或多个分析仪单元可以包含发射光的光 源。例如，分析仪单元的光源可以由至少一个光发射元件(诸如发光二极管、 电动辐射源，诸如白炽灯、电致发光灯、气体放电灯、高强度放电灯、激光) 组成，所述光发射元件用于用测试的样品测量分析物浓度或用于实现能量转 移(例如经由荧光共振能量转移或催化酶)。

此外，系统的分析仪单元可以包含一个或多个温育单元(例如用于将样 品或试剂维持规定的温度或温度范围)。在一些实施方案中，分析仪单元可 以包括用于使样品经受重复温度循环并用样品监测扩增产物量的变化的热 循环仪，包括实时热循环仪。

另外，本文中公开的系统的分析仪单元可以包含，或者在操作上连接至 反应容器或小杯补料单元。例示性的补料单元包括液体处理单元，诸如移液 单元，以将样品和/或试剂投递至反应容器。移液单元可以包含可再用的可清 洗针，例如钢针，或一次性移液尖端。分析仪单元可以进一步包含一个或多 个混合单元，例如摇动包含液体的小杯的摇动器，或混合小杯或试剂容器中 的液体的混合桨。

从上文得出结论，依照本公开内容的一些实施方案，可以通过计算装置 实施本文中公开并描述的方法的一些步骤的部分。例如，计算装置可以是通 用计算机或携带式计算装置。还应当理解，多个计算装置可以一起使用，诸 如通过网络或转移数据的其它方法，用于实施本文中公开的方法的一个或多 个步骤。例示性的计算装置包括台式计算机、膝上计算机、个人数据助理 (personal data assistants,“PDA”)，诸如BLACKBERRY牌装置、蜂窝装置 (cellular device)、平板电脑、服务器，等等。一般地，计算装置包含能够执 行多个指令(诸如软件程序)的处理器。

计算装置利用存储器。存储器是一种计算机可读介质，并且可以包含单 一存储装置或多个存储装置，例如其与计算装置在本地定位或计算装置通过 网络可存取。计算机可读介质可以是由计算装置可以存取的任何可用介质， 并且包括易失性和非易失性介质两者。此外，计算机可读介质可以是可移动 和不可移动介质中的一种或两者。作为例子而非限制，计算机可读介质可以 包含计算机存储介质。例示性的计算机存储介质包括但不限于RAM、ROM、 EEPROM、闪速存储器或任何其它存储器技术、CD-ROM、数字通用光盘 (DVD)或其它光盘存储、磁盒、磁带、磁盘存储器或其它磁性存储装置、或 任何其它介质，其可以用于存储能够被计算装置存取并且被计算装置的处理 器执行的多个指令。

依照本公开内容的实施方案，软件可以包括指令，该指令在由计算装置 的处理器执行时可以实施本文中公开的方法的一个或多个步骤。一些指令可 以适合于产生控制其它机器运行的信号，且如此可以经由那些控制信号运行 以转化远离计算机自身的材料。这些描述和表示是本领域技术人员使用的数 据处理手段，例如以将其工作的实质最有效传送给本领域其它技术人员。

多个指令还可以包含算法，其一般设想为产生期望结果的前后一致的步 骤顺序。这些步骤是那些需要物理量的物理操作的。通常，虽然不必要，这 些量采用电或磁性脉冲或信号形式，其能够被贮存、转移、转化、组合、比 较、及以其它方式操作。主要出于通常使用的原因，有时证明方便的是，以 数值、字符、显示数据、数字等提及这些信号作为指其中体现或表示此类信 号的物理项或表示。然而，应当记住所有这些和类似的项应当与合适的物理 量关联，并且在本文仅用作应用于这些量的方便标记。依照本公开内容的一 些实施方案，通过执行指令体现并实施用于实施本文中公开的一种或多种标 志物的测定量和合适的参照之间的比较的算法。结果可以以参数诊断原始数 据输出或以绝对或相对量给出。依照本文中公开的系统的多个实施方案，“诊 断”可以基于计算“量”与参照或阈值的所述比较由本文中公开的系统的计 算装置提供。例如，系统的计算装置可以提供指示特定诊断的词语、符号、 或数值形式的指标。

计算装置也可以利用输出装置。例如，例示性的输出装置包括传真机、 显示器、打印机、和文件。依照本公开内容的一些实施方案，计算装置可以 实施本文中公开的方法的一个或多个步骤，此后经由输出装置提供与方法的 结果、指标、比率或其它因素相关的输出。

本发明进一步涵盖在患有缺血性中风的受试者中早期区别受试者患有 心脏栓塞性缺血性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风的试剂盒，所述试 剂盒包含用于心脏肌钙蛋白的检测剂和反映参照量的标准品，所述参照量如 从来自已知患有心脏栓塞性中风的受试者和/或已知患有非心脏栓塞性中风 的受试者的样品得到的。

最后，本发明涵盖用于在怀疑患有心房肌纤维震颤的受试者中诊断心房 肌纤维震颤的试剂盒，所述试剂盒包含用于心脏肌钙蛋白(和任选地用于利 尿钠肽)的检测剂和反映参照量的标准品，所述参照量如从来自已知患有心 房肌纤维震颤的受试者和/或已知未患有心房肌纤维震颤的受试者的样品得 到的。

如本文中使用的，术语“试剂盒”指前述组分的集合，其优选分开或在 单一容器内提供。容器还包含用于实施本发明的方法的说明书。这些说明书 可以为手册形式或者可以由计算机程序代码提供，实施计算机程序代码能够 实施本发明方法中提及的比较，并且在计算机或数据处理装置上执行时相应 建立诊断。计算机程序代码可以在数据存储介质或装置，诸如光学存储介质 (例如压缩磁盘)上或直接在计算机或数据处理装置上提供。此外，优选地， 试剂盒可以包含反映如本文中别处详细描述并提及的参照量的标准品。优选 地，检测剂在载体，且优选测试条上固定化。

本发明的实施方案

在下文中，列出了本发明方法的优选实施方案。优选地，上文给出的定 义作必要修改后适用。

1.一种用于早期区别受试者患有心脏栓塞性缺血性中风还是患有非心 脏栓塞性缺血性中风的方法，其包括测定来自患有缺血性中风的受试者的样 品中的心脏肌钙蛋白量，其中已经在缺血性中风的症状发作后立即获得所述 样品。

2.实施方案1的方法，其进一步包括如下的步骤，即比较所述心脏肌钙 蛋白的量与参照量，由此区别所述受试者患有心脏栓塞性中风还是患有非心 脏栓塞性缺血性中风。

3.实施方案1和2的方法，其中已经在缺血性中风的症状发作后不超过24 小时，特别是不超过12小时从所述受试者获得已经在中风的症状发作后立即 获得的所述样品。

4.实施方案1和2的方法，其中已经在缺血性中风的症状发作后不超过6 小时，特别是不超过3小时从所述受试者获得已经在中风的症状发作后立即 获得的所述样品。

5.实施方案1至4中任一项的方法，其中所述参照量从已知患有心脏栓塞 性中风的受试者得到，且其中与所述参照量相比相同的心脏肌钙蛋白量，或 增加的心脏肌钙蛋白量指示所述受试者患有心脏栓塞性中风，

和/或

其中所述参照量从已知患有非心脏栓塞性缺血性中风的受试者得到，且 其中与所述参照量相比相同的心脏肌钙蛋白量，或减少的心脏肌钙蛋白量指 示所述受试者患有非心脏栓塞性缺血性中风。

6.实施方案1至5中任一项的方法，其进一步包括测定利尿钠肽，特别是 脑利尿钠肽，特别是BNP或NT-原BNP的量。

7.一种用于诊断怀疑患有心房肌纤维震颤的受试者中的心房肌纤维震 颤的方法，其包括测定来自所述受试者的样品中的心脏肌钙蛋白量。

8.实施方案7的方法，其进一步包括比较心脏肌钙蛋白量与参照量的步 骤。

9.实施方案7和8的方法，其中所述怀疑患有心房肌纤维震颤的受试者患 有缺血性中风，特别是心脏栓塞性中风，且其中在缺血性中风的症状发作后 立即获得所述样品。

10.实施方案9的方法，其中已经在缺血性中风的症状发作后不超过12 小时，特别是在缺血性中风的症状发作后不超过6小时或不超过3小时从所述 受试者获得来自所述受试者的所述样品。

11.实施方案7至10中任一项的方法，其中诊断间歇性心房肌纤维震颤。

12.实施方案7至11中任一项的方法，其进一步包括测定利尿钠肽，特别 是脑利尿钠肽，特别是BNP和NT-原BNP的量。

13.心脏肌钙蛋白和/或特异性结合受试者样品中的心脏肌钙蛋白的检 测剂用于早期区别受试者患有心脏栓塞性缺血性中风还是患有非心脏栓塞 性缺血性中风的用途，其中已经在缺血性中风的症状发作后立即获得所述样 品。

14.心脏肌钙蛋白和/或特异性结合怀疑患有心房肌纤维震颤的受试者 的样品中的心脏肌钙蛋白的检测剂用于诊断所述受试者中的心房肌纤维震 颤的用途。

15.一种用于在患有缺血性中风的受试者中早期区别受试者患有心脏栓 塞性缺血性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风的装置，所述装置包含：

a)分析单元，其包含容许测定心脏肌钙蛋白量的针对心脏肌钙蛋白的检 测剂(和任选地针对利尿钠肽的检测剂，其容许测定所述利尿钠肽的量)；和

b)评估单元，其包含已经执行算法的数据处理器，所述算法用于比较 由所述分析单元测定的量与数据库中存储的一个或多个参照量以区别受试 者患有心脏栓塞性缺血性中风还是患有非心脏栓塞性缺血性中风，其中所述 一个或多个参照量从来自实施方案5中限定的受试者的样品得到，且所述算 法是如实施方案5中限定的算法。

说明书中引用的所有出版物通过提及完整并入本文。

以下实施例应当仅例示本发明。无论如何，它们不应解释为限制本发明 的范围。

实施例1：肌钙蛋白T、GDF-15和NT-原BNP的测定

使用Roche的电化学发光ELISA三明治式测试Elecsys肌钙蛋白T hs(高灵 敏性)STAT(短周转时间(Short Turn Around Time))测定法测定肌钙蛋白T。 测试采用两种特异性针对人心脏肌钙蛋白T的单克隆抗体。抗体识别心脏肌 钙蛋白T蛋白的中心部分中的两个表位(氨基酸位置125-131和136-147)，所 述中心部分由288个氨基酸组成(分析灵敏性低于1,0)。

使用Roche的电化学发光ELISA三明治式测试Elecsys原BNP II STAT(短 周转时间)测定法测定NT-原BNP。测试采用两种识别原BNP(1-108)的N端部 分(1-76)中的表位的单克隆抗体。

为了测定血清和血浆样品中的GDF-15浓度，采用Elecsys原型测试，其 使用GDF-15亲和层析纯化的、山羊抗人GDF-15多克隆IgG抗体，来自R&D  Systems(AF957)。在每个实验中，用来自R&D Systems的重组人GDF-15 (957-GD/CF)产生标准曲线。在标准血浆样品中测试用新批次或重组GDF-15 蛋白得到的结果，并且通过对此测定法引入调节因子校正高于10％的任何偏 差。来自同一患者的血清和血浆样品中的GDF-15测量在最后的稀释因子校 正后产生实际上相同的结果。测定法的检测限是200pg/ml。

实施例2：患者分组

对总共255名缺血性中风患者(平均年龄70岁)测试NT原BNP、肌钙蛋 白T和GDF 15。23名患者中存在短暂性缺血性中风(transitory ischemic  attack)，在61名患者中诊断轻度中风(minor stroke)，并且在108名患者中发现 重度中风。另外，如上文描述的，实施颈动脉(caotoid)和经颅超声及心电描 记术和超声心动图显像，并且依照TOAST标准分类患者。此外，实施7天 HOLTER ECG以鉴定常规心电图上不被注意的心房肌纤维震颤。

实施例3：结果

获得以下结果(指示中值数值、25.百分位数和75.百分位数)：

如先前描述的，心脏栓塞性中风与升高的NT-原BNP水平有关，GDF 15 没有显著促成中风分类，然而，灵敏性肌钙蛋白T促成了中风分类，由此排 除分开心脏和脑B型利尿钠肽的困难。

这些数据进一步支持与心房肌纤维震颤的存在或缺乏相关的分类。结果 如下：

数据再次证明了AF与NT-原BNP和肌钙蛋白T关联，但是以低得多的程 度与GDF 15关联。要用于分类的NT-原BNP的限度也得到如下实情支持，即 中值NT-原BNP水平从呈现(331pg/ml)升高至24小时随访至437pg/ml，其在 30％增加的范围中。此升高是由于心脏原因或从脑中释放的程度是不清楚 的。比较而言，随访中肌钙蛋白T没有显著增加。如此，肌钙蛋白T水平仍然 稳定。

总之，发现肌钙蛋白T是一种在中风原因的鉴定/分离中的有力的工具。 此方法也可以与B型利尿钠肽组合用于中风预防。令人惊讶地，GDF 15对此 重要的临床问题提供很少的额外信息。

实施例4：病例研究

基于临床症状和随后的MRI，68岁龄男性诊断为TIA(短暂性缺血性中 风)。他的ECG是正常的。他的肌钙蛋白T是10.2pg/ml，他的NT-原BNP是 520pg/ml。超声心动图在没有血栓形成的心房中显示轻度左心室功能障碍。 基于TOAST标准，在消除其它可能性后，受试者诊断为心脏栓塞性中风。由 于心房内血栓形成，他接受Holter ECG达3天，揭示了阵发性心房肌纤维震 颤。然后，他被置于抗凝血剂治疗，因为他没有禁忌证。

72岁龄男性表现为轻度中风，其在通过CT扫描排除脑内出血后通过MRI 确认。他的肌钙蛋白T是4.1pg/ml，并且他的NT-原BNP是245pg/ml。颈动脉 超声(Carotis ultrasound)揭示了右颈动脉叉(right carotis fork)的80％狭窄。ECG 和超声心动图显像是正常的，除了轻度的舒张期功能障碍外。由于他不可能 具有AF，不实施Holter ECG。建议他考虑在更强烈评估脑内和脑外动脉后修 正阻塞的颈动脉。

52岁龄女性报告头晕和心悸，并且访视急救室。她的肌钙蛋白T是 3pg/ml，NT-原BNP是115pg/ml，ECG和超声心动图显像在正常内。由于症状 不指向脑事件或心房肌纤维震颤，没有进行进一步研究，其与肌钙蛋白T和 NT-原BNP结果一致。她在具有疑似焦虑综合征的情况下出院。

58岁男性对于急救室表现出其左臂的短暂虚弱。他的ECG是正常的，他 的肌钙蛋白T是11.1pg/ml，而NT-原BNP是435pg/ml。MRI排除中风，由于肌 钙蛋白T和NT-原BNP结果，之后实施了Holter ECG，揭示了阵发性AF。包括 TTE的后续Echo揭示了心房内血栓块。他诊断为阵发性心房肌纤维震颤，并 且在没有明显禁忌证的情况下进行了抗凝血剂治疗。

58岁龄男性对于急救室表现出在症状开始后2小时的缺血性中风，症状 包括右臂和腿的突然虚弱，他的肌钙蛋白T是12.5pg/ml，而NT-原BNP是 920pg/ml。通过食管超声心动图显像确认了疑似的心脏栓塞性中风，在左心 房中具有可见的血栓。与溶解疗法(Lysis therapy)有关的血管造影术确认了诊 断。溶解疗法是成功的，并且症状得到改善，患者置于抗凝血剂治疗。

58岁龄男性向他的医生表述头晕，他在过去8年患有糖尿病，并且他在 此生的大部分时间抽烟，过去10年已知动脉高血压。影像检查排除TIA，超 声心动图显像发现他左心房扩张而没有血栓形成，在呈现时，他的ECG是正 常的，并且记录窦性心律。他的肌钙蛋白是11pg/ml，NT-原BNP是480pg/ml。 几周后，患者置于Holter ECG，记录到间歇性心房肌纤维震颤。

结论：

具有心脏栓塞性中风的中风患者的鉴定是有意义的，因为它指导进一步 的诊断步骤和治疗，且甚至更重要地，预防未来的中风。已经显示了利尿钠 肽在表现为缺血性中风的患者中检测心脏栓塞性中风的候选者中的有用性。 然而，如本文显示的，利尿钠肽在中风过程期间可以变化，这限制其诊断潜 力，不进行实质性变化的肌钙蛋白T不是这种情况。

类似的推理适用于检测阵发性或间歇性心房肌纤维震颤。心房肌纤维震 颤在老年群体中更常见。由于诊断方法(Holter ECG和导致心房血栓的检测 方法，TEE)的利用是有限度的，患者选择(归入/排除)是重要的。这可以 通过测定肌钙蛋白T(和NT-原BNP)和使用合适的截留实现。

总之，发明人已经将肌钙蛋白T鉴定为缺血性中风及间歇性心房肌纤维 震颤中的重要诊断方法以指导进一步的诊断方法和治疗日程。