精品肝素和制备精品肝素的方法

摘要

本文涉及一种精品肝素和制备精品肝素的方法。其中制备精品肝素的方法包括：将粗品肝素溶解到水中，制备肝素溶液，向肝素溶液中加入硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B，与半乳糖胺杂质进行酶反应；除去肝素溶液中的硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B。

说明书

技术领域

本文涉及精品肝素和制备所述精品肝素的方法。

背景技术

肝素是由己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖 以1→4糖苷键交替形成的粘多糖，具有六糖或八糖的重复单位的线性链状 结构，其分子量为3000-37000Da之间，在医药方面作为抗凝试剂和抗栓试 剂使用。此外，肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生 物学功能(Maurice Petitou,Benito Casu,Ulf Lindah.1976–1983,a critical  period in the history of heparin:the discovery of the antithrombin binding site. Biochimie85(2003)83–89)。

粗品肝素经过纯化之后可以药用，纯化过程包括一系列的一般分离步骤 以及使外来物质失活的步骤。其中分离步骤利用了肝素的物化性质，比如高 阴离子密度，水溶性以及对于热、酸、碱和氧化剂的相对高活性(Marco  Guerrini,Zhenqing Zhang,Zachary Shriver,etc.Orthogonal analytical  approaches to detect potential contaminants in heparin.PNAS，2009，106(40)： 16956–16961)。

在历史上药品级别的肝素是基于血浆凝固试验来定义的，而不是其分子 性质。目前这种状态已经改变，这是因为肝素污染危机和更加精妙的多糖分 析手段的出现。世界上的多家标准品机构，包括美国药典和欧洲药典，已经 开始用基于规定的生化方法，比如核磁共振(NMR)、毛细管电泳(CE)、高效 液相色谱(HPLC)来测定肝素的结构和电荷性质。2007年末到2008年初的硫 酸软骨素污染肝素钠事件，导致了很多国家的肝素在血液透析的过程中出现 过敏反应，比如急性低血压，并导致超过140位病人死亡(Kishimoto TK，等 人(2008)Contaminated heparin associated with adverse clinical events and  activation of the contact system.N Engl J Med358:2457–2467；Guerrini M，等 人(2008)Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated  with adverse clinical events.Nat Biotechnol26:669–675；Blossom DB，等人 (2008)Outbreak of adverse reactions associated with contaminated heparin.N  Engl J Med359:2674–2684)。

肝素中另一种杂质为过硫酸软骨素。过硫酸软骨素(OSCS)每个双糖单位 含有4个硫，如下式1所示，到目前为止，双糖含有4个硫元素在自然界中 还没有发现，结构也不同于其他的粘多糖(GAG)不纯物质。OSCS的出现也 开始使各国重视肝素的其他污染物，如硫酸皮肤素(DS)、透明质酸(HA)和所 谓的边角料，这些也可以被过硫酸化而出现在肝素中。所以肝素粗品的精制 工艺显得越来越重要。

式1过硫酸软骨素

由粗品肝素制备精品肝素的过程主要是除去粗品肝素中的杂质的过程。 粗品肝素中的杂质主要有蛋白质、核酸类物质和杂多糖。通常，在去除杂质 过程中只使用一种除杂方法很难达到很好的效果，实际操作过程中，会将多 种除杂的方法结合起来使用，这样会导致步骤复杂、肝素收率低。

粗品肝素中的主要多糖成分是肝素，除此之外其还有其他相关的多糖 (GAGs)，例如包括硫酸皮肤素(DS)、硫酸软骨素(CS，包括硫酸软骨素A(CS-A) 和硫酸软骨素C(CS-C))和软骨素，这些物质由于与肝素本身的物理性质和化 学性质非常相似，因此难以将其从粗品肝素中除去。上述这些相关的多糖(杂 多糖)一般称为半乳糖胺杂质。对于半乳糖胺杂质的去除也是肝素纯化的关 键问题之一，在现有的纯化操作过程中，往往通过调节不同的乙醇浓度，通 过多步进行的分级沉淀方法去除半乳糖胺杂质，其中相关的多糖主要以硫酸 皮肤素形式存在，对其的去除尤其困难。

如上所述，已有的肝素纯化方法去除肝素中半乳糖胺杂质(主要是软骨 素、CS-A、CS-C、DS)主要是用乙醇进行多级沉淀，由于肝素和其他半乳糖 胺杂质的结构、分子量、醇溶性很接近，所以单纯靠乙醇沉淀难以进行分离， 需要多级分离才能达到比较理想的分离效果，所以造成肝素的收率下降，而 且乙醇的用量大，经济成本和时间成本较高。

发明内容

鉴于上述问题，本申请的发明人进行了深入地研究，提出了如下的方案 解决了上述问题。

本文的一个方面提供一种精品肝素。具体来说：

(1).一种精制的精品肝素，其中，所述精品肝素所含的半乳糖胺杂质为 5质量%以下、可以为3质量%以下、进一步可以为1质量%以下、再进一 步优选为0.8质量%、0.5质量%、0.3质量%、优选为0.1质量%以下。

(2).根据(1)所述的精品肝，其中，所述精品肝素的羊血浆效价为150 IU/mg以上、可以为160IU/mg以上、可以为170IU/mg以上。

(3).根据(1)或(2)所述的精品肝素，其中，精品肝素配制为4mg/mL的肝 素溶液时，在260nm处的吸光度为0.1以下，在280nm处的吸光度为0.1以 下。

本文的另一个方面涉及一种制备精品肝素的方法(纯化肝素的方法)，具 体来说：

(4).一种制备精品肝素的方法，其包括：

向含粗品肝素的肝素溶液中加入下列酶中的至少一种与半乳糖胺杂质 进行酶反应，上述酶为硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B。

(5).根据(4)所述的方法，其中，所述硫酸软骨素酶AC是与MBP融合 的硫酸软骨素酶AC，即MBP-ChonAC(SEQ ID NO:1)，所述硫酸软骨素酶B 是与MBP融合的硫酸软骨素酶B，即MBP-ChonB(SEQ ID NO:2)。

(6).根据(4)所述的方法，其中，向肝素溶液中添加胰酶停止酶反应。

(7).根据(4)所述的方法，其中，还包括下列的提纯步骤：

除杂质步骤；

乙醇沉淀步骤；

氧化步骤

冷冻干燥。

(8).根据(7)所述的方法，其中，所述除杂质步骤和乙醇沉淀步骤重复进 行两次或三次以上。

(9).根据根据(7)所述的方法，其中，在最后一次乙醇沉淀之前进行氧化 并脱色。

(10).根据(7)所述的方法，其中，除杂质步骤包括向肝素溶液中添加氯 化钙以除去杂质，并进一步添加无水碳酸钠以除去钙离子。

(11).根据(9)所述的方法，其中，利用H₂O₂对肝素溶液进行氧化并脱色。

(12).根据(4)～(11)中任一项所述的方法，其中，

所述硫酸软骨素酶B和粗品肝素的比例为：500IU-50000IU硫酸软骨素 酶B/kg粗品肝素，优选的比例为1000IU-20000IU硫酸软骨素酶B/kg粗品 肝素，进一步优选3000IU-12000IU硫酸软骨素酶B/kg粗品肝素，最优选为 5000IU-10000IU硫酸软骨素酶B/kg粗品肝素；

所述硫酸软骨素酶AC和粗品肝素的比例为：300IU-30000IU硫酸软骨 素酶AC/kg粗品肝素，优选的比例为1000IU-15000IU硫酸软骨素酶AC/kg 粗品肝素，进一步优选2000IU-10000IU硫酸软骨素酶AC/kg粗品肝素，最 优选为3000IU-6000IU硫酸软骨素酶AC/kg粗品肝素。

(13).根据(4)～(12)中任一项所述的方法，其中，获得所述粗品肝素的肝 素原料为来自动物组织的基本上含有肝素的原料，优选来源于猪、牛、羊组 织的肝素，更优选来源于猪小肠粘膜的肝素。

具体实施方式

以下，对本文的实施方式进行具体说明。

如无特殊说明，本说明书中的术语的含义与本领域技术人员一般理解的 含义相同，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。本文中，所涉及的数 值一般指重量或重量百分比，除非特殊说明。

<精品肝素>

本文的一个方面提供一种精制的精品肝素。精品肝素通常以肝素钠的干 燥粉末的形式存在。

该精品肝素的羊血浆效价为150IU/mg以上，可以为160IU/mg以上， 还可以为170IU/mg以上，并且所述精品肝素所含的半乳糖胺杂质为5质量 %以下，可以为3质量%以下，进一步可以为1质量%以下，再进一步优选 为0.8质量%，0.5质量%，0.3质量%，0.1质量%以下。在本文中，对于半 乳糖胺杂质的下限没有具体限定，可以是所采用的检测方法的极限值，例如 可以是0.01质量%或以上。

上文中的羊血浆效价也称为aPTT(activeated partial thromboplastin time) 效价，是利用活化部分凝血酶时间法测定的效价。在此，效价越高表明抗凝 血活性越强。所述活化部分凝血酶时间法可以参照欧洲药典7.0版的第 208-209页，关于肝素的2.7.5章(European pharmacopoeia7.0p208-209,2.7.5 assay of heparin)。具体的测定方法参见本文实施例部分的描述。aPTT效价 的单位为IU/mg，其中将标准品肝素钠BRP(购买自European Directorate for  Quality Medicines，EDQM，欧洲药品质量管理局)的aPTT效价(H0200000) 定义为1010IU/mL。

其中本文所述的半乳糖胺杂质是指包括硫酸皮肤素(DS)、硫酸软骨素 (CS)和软骨素等含有半乳糖胺单糖的杂质的总和。可以根据本文实施例部分 所述的半乳糖胺杂质检测方法来检测本文得到的精品肝素所含的半乳糖胺 杂质的浓度。半乳糖胺杂质的含量是描述肝素精品纯度的指标，含量越少表 示肝素纯度越高，其所含有的杂多糖的含量越少，这种肝素作为药物使用时 更容易预测量效关系、是更加安全的(这是因为半乳糖胺杂质有可能被硫酸 化后变为OSCS从而引起过敏反应)。

欧洲药典,关于肝素的2.7.5章(European pharmacopoeia7.0p208-209, 2.7.5assay of heparin)中规定的aPTT效价是相对于标准品对照进行测定、并 用生物统计方法：平行线原理3×3计算而得出。

半乳糖胺杂质含量的测定值是半乳糖胺占总糖胺的含量，即半乳糖胺占 肝素样品中总糖胺(即半乳糖胺+葡萄糖胺)的比值，也就是糖胺的相对含量。 半乳糖胺杂质含量通过：半乳糖胺/(半乳糖胺+葡萄糖胺)来计算。

另外，本文涉及的精品肝素在260nm处的吸光度为0.1以下，在280nm 处的吸光度为0.1以下，在本文中所测定的吸光度是测定浓度为4mg/mL的 精品肝素溶液的吸光度而得到的数值。

在本领域中，通常利用260nm处的吸光度表征核酸类物质的浓度，利 用280nm处的吸光度表征蛋白质类物质的浓度。在本文中，可以利用本领 域已知的方法测定精品肝素在260nm处的吸光度，以及在280nm处的吸光 度。具体的测定方法可以参见实施例部分描述的方法。根据中国药典2010 (CP2010)的规定要求A260≤0.1，A280≤0.1。本文涉及的精品肝素满足药典要 求，即浓度为4mg/mL的肝素溶液，满足A260≤0.1，A280≤0.1(参见中国药 典2010第二部366-367页)。

<制备精品肝素的方法>

本文的另一个方面涉及一种制备精品肝素的方法(纯化肝素的方法)，其 包括：

向含粗品肝素的肝素溶液中加入下列中的至少一种硫酸软骨素酶：硫酸 软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B，与半乳糖胺杂质进行酶反应。

(粗品肝素)

本文的粗品肝素是指含有肝素的原料，因此只要是主要含肝素的原料即 可，通常粗品肝素的aPTT效价为80～100IU/mg左右，粗品肝素通常是从动 物组织(主要是猪小肠粘膜)中提取的未经过纯化和脱色的肝素(从小肠粘膜 等组织中提取的步骤见文献可以参考Haiying Liu，et al.Lessons learned from  the contamination of heparin.Nat.Prod.Rep.,2009,26,313–321)。在本文中的 粗品肝素是指未经本文所述的方法进行纯化的肝素，其中粗品肝素含有作为 多糖成分的肝素，以及其它的半乳糖胺杂质，例如硫酸皮肤素(DS)、硫酸软 骨素(CS，包括硫酸软骨素A(CS-A)和硫酸软骨素C(CS-C))和软骨素。当然 粗品肝素也可以是经过了通常的纯化和脱色步骤除去了其它多种杂质和颜 色但尚未除去上述半乳糖胺杂质的肝素产品，在本文中涉及的半乳糖胺杂质 主要包括硫酸皮肤素(DS)、硫酸软骨素(CS，包括硫酸软骨素A(CS-A)和硫 酸软骨素C(CS-C))和软骨素。本文中的肝素粗品通常是指半乳糖胺杂质含量 为10质量%以上，为15质量%以上，为20质量%以上，以及进一步为30 质量%以上，40质量%以上的各种肝素。

粗品肝素可以是市场上购买的肝素的粗产品，例如可以为购买自四川广 元申达实业有限公司和山东郓城绅联生物技术有限公司等。本文的粗品肝素 可以是来自动物的肝素原料，动物的肝素可以是来源于猪、牛、羊组织的肝 素，更优选来源于猪小肠粘膜的肝素。在本文的方法中，通常将粗品肝素溶 解在溶剂(例如水)中以进行与下述硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B的 反应。

(硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B)

在该方法中，硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B可以是通过任何方法 获得的硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B。该硫酸软骨素酶AC和硫酸软 骨素酶B可以是购买的酶产品，也可以利用能够生产硫酸软骨素酶AC和硫 酸软骨素酶B的细菌菌体、该细菌菌体的细胞提取物、也可以是细胞提取物 经提纯得到的含酶溶液、以及经纯化得到的酶。上述能够生产硫酸软骨素酶 AC和硫酸软骨素酶B的细菌例如有肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus或 Flavobacterium heparinum)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)和嗜水气单 孢菌(Aeromonas liquefaciens)。

例如，硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B来自肝素黄杆菌。

硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B可以是购买的酶产品，例如购买自 Sigma、IBEX等公司的硫酸软骨素酶AC，以及购买自Sigma、IBEX等公司 的硫酸软骨素酶B。

其中，来自肝素黄杆菌的硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B可以通过 直接使用肝素黄杆菌菌体、菌体的细胞提取物、或细胞提取物经初步纯化后 得到的含酶溶液。也可以利用该硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B分别在 大肠杆菌中重组表达后得到的经基因工程操作的酶。

在本文中，硫酸软骨素酶AC可以是与MBP融合的硫酸软骨素酶，即 MBP-ChonAC。该MBP-ChonAC的氨基酸残基序列如SEQ ID No:1所示， 其DNA序列如SEQ ID No:3所示，关于MBP-ChonAC的详细描述可以参 考申请号为201110358185.x的中国专利申请。

在本文中，硫酸软骨素酶B可以是与MBP融合的硫酸软骨素酶，即 MBP-ChonB。该MBP-ChonB的氨基酸残基序列如SEQ ID No:2所示，其 DNA序列如SEQ ID No:4所示，关于MBP-ChonB的详细描述可以参考申 请号为201110358134.7的中国专利申请。

MBP-ChonAC和MBP-ChonB可以是以具有该酶基因的细菌的粗培养 液、该粗培养液的细胞提取物、或者是根据简单的纯化方法得到的酶粗产品、 或者进一步纯化得到的酶产品形式被利用。

在上述方法中，使硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B与粗品肝素 反应，反应过程中硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B降解肝素原料中 的硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、软骨素以及硫酸皮肤素。本文对于具体的 反应条件没有特别地限定，只要是硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B 能够发挥活性，有效地降解硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、软骨素、以及硫 酸皮肤素的反应条件即可，本领域技术人员可以根据所使用的酶和原料进行 适当地选择。反应可以在20～40℃的条件下，可以在25～35℃的条件下进行， 以及在pH为7～8.5，可以在7～7.5的条件下进行。在一个具体的实施方式中， 反应温度为30℃，pH为7.5，并利用氯化钠和氯化钙，调节pH。

对于上述反应进行的时间也没有具体限定，只要是能够将粗品肝素中的 硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、软骨素、以及硫酸皮肤素充分降解皆可。所 述充分降解是指在反应进行的过程中通过紫外可见光分光光度计检测反应 体系在232-235nm处的吸光度，当吸光度不再变化时，认为其中硫酸软骨素 A、硫酸软骨素C、软骨素以及硫酸皮肤素已经被充分降解。因此仅需要根 据不同的酶量、不同的操作条件，选择适当的反应时间即可，本领域技术人 员可以适当地调节。在一个具体的实施方式中，反应进行的时间为0.5～5小 时。

在上述方法中，在添加硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B进行酶 解反应。此外，在反应过程中，可以先添加一定量的硫酸软骨素酶AC和/ 或硫酸软骨素酶B进行反应，反应一段时间后在补充一定量的硫酸软骨素酶 AC和/或硫酸软骨素酶B再进行一段时间的反应。

另外，硫酸软骨素酶B和粗品肝素的比例为：500IU-50000IU硫酸软骨 素酶B/kg粗品肝素，比例可以为1000IU-20000IU硫酸软骨素酶B/kg粗品 肝素，进一步可以为3000IU-12000IU硫酸软骨素酶B/kg粗品肝素，可以为 5000IU-10000IU硫酸软骨素酶B/kg粗品肝素。

硫酸软骨素酶AC和粗品肝素的比例为：300IU-30000IU硫酸软骨素酶 AC/kg粗品肝素，比例可以为1000IU-15000IU硫酸软骨素酶AC/kg粗品肝 素，进一步可以为2000IU-10000IU硫酸软骨素酶AC/kg粗品肝素，可以为 3000IU-6000IU硫酸软骨素酶AC/kg粗品肝素。

其中硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B的1IU定义为：在30℃，pH 值为7.5的条件下能产生1μmol4,5-不饱和糖醛酸的酶量。

在本文的方法中，通常是将粗品肝素溶解在水中，使粗品肝素溶液的浓 度为1g/L～500g/L，也可以为50g/L～200g/L。

在本文所述的方法中，由于肝素的分子量在12000～15000道尔顿左右， 而经硫酸软骨素酶AC和/或B反应而降解后的半乳糖胺杂质是基本上以二 糖形式存在的低分子经降解的半乳糖胺杂质，其分子量一般在2000道尔顿 以下，例如1000道尔顿以下，例如约为400～500道尔顿，由于肝素的分子 量明显不同于降解后的半乳糖胺杂质，因此可以容易地在后续步骤中利用分 子量的差异从混合物中分离出目标产品肝素。

在本文的方法中，向肝素溶液中添加胰酶停止酶反应。对于添加胰酶停 止酶反应的条件可以根据本领域已知的条件来进行设定。在一个具体的实施 方式中，调节结束了酶反应后的肝素溶液的pH为8.9，控制温度为48℃， 加入0.6%(W/W)的胰酶，并基本上保持pH为8.9，胰酶酶解一共进行5.5 小时。

在利用胰酶终止酶反应之后，进一步除去所添加的硫酸软骨素酶AC和 /或硫酸软骨素酶B，此时，该步骤除了除去了所述的硫酸软骨素酶之外，还 可以除去粗品肝素中其它的蛋白质。

在本文中在还可以包括：除杂质步骤、乙醇沉淀步骤、氧化步骤，以及 冷冻干燥步骤。除杂质步骤和乙醇沉淀步骤重复进行两次或三次以上，可以 为重复进行两次。其中这些提纯步骤中的一些也可以在本文所述方法之前进 行，可以先除去一些杂质后再利用本文中的方法来除去粗品肝素中的半乳糖 胺杂质。

去除杂质的方法有调pH值、盐沉淀、醇沉淀、酶解和离心等方法。脱 色方法主要是氧化脱色，使用的氧化剂有高猛酸钾、过氧化氢。在氧化脱色 的过程中，部分杂质也会被去除掉。

目前已有大量的文献报道了这些除杂质和氧化脱色等步骤。调pH值的 方法例如，通常可以将肝素钠溶液pH值调节至1.5左右，可以沉淀出大部 分酸性蛋白质。考虑到肝素钠在温热和酸性条件下容易失活，使用亚硫酸氢 钠作为保护剂以防止肝素钠失活。上述这些去除杂质和氧化脱色的方法可以 结合和选择使用。

李红心等人发现使用高速低温离心去除沉淀的蛋白质，与硅藻土作助滤 剂的过滤除杂蛋白的方法进行比较，得到的精品肝素钠的效价损失降低到最 低程度(参见李红心，精品肝素钠的制备及效价分析(J).陕西科技大学学报， 2005，23(5):32-34)。

此外，罗喜牛使用三氯化铝作为除杂剂，结合调pH值的方法，与常规 法比较，操作明显简化，除杂效果佳(罗喜牛，肝素钠的三氯化铝精制工艺(J). 中国医药工业杂志，1998，29(10):441-442)。

考虑利用酶的作用专一特点，并结合调节pH值和氧化除蛋白质的方法， 李红心建立了胰蛋白酶酶解除蛋白质的方法，实验结果表明，采用该方法去 除粗品肝素钠中的杂蛋白，对肝素钠效价和效价回收率的影响均较小。罗喜 牛等人采用D-254树脂吸附法除去调节酸性、碱性不易除尽的核酸、蛋白质 杂质(罗喜牛，沈静，徐烈贤等，D-254树脂在肝素钠精制过程中的应用(J). 中国医药工业杂志，1998，29(5):200-202)。张万忠等人将酶解法和氧化法除 杂结合起来，在粗品肝素钠中加入胰蛋白酶对杂蛋白进行酶解，再结合过氧 化氢氧化除杂，以提高精品肝素钠的效价和效价回收率(张万忠，张辉，李 文秀等，肝素钠精制工艺研究(J).沈阳化工学院学报，2002，16(3):191-194)。

在本文的一个实施方式中除杂质步骤包括向肝素溶液中添加氯化钙以 除去杂质，并进一步添加无水碳酸钠以除去钙离子。在一个具体的实施方式 中，胰酶酶解结束后，加入CaCl₂常温反应30分钟，升温至80～85℃，然后 用NaOH调pH为9.3，10000g离心10分钟。将冷却得到溶液至40℃以下， 调节pH为10.3，10000g离心10分钟。向离心后的溶液中加入3.0%(W/V) 无水碳酸钠，48℃反应30分钟，10000g离心10分钟。

在进行一次除杂质步骤后，对得到的溶液进行一次乙醇沉淀。乙醇沉淀 的方法是本领域技术人员已知的乙醇沉淀方法。通常可以采用30～70%的乙 醇溶液进行分级分离，静置一段时间后，收集沉淀。

此外，在最后一次乙醇沉淀之前进行氧化脱色，其中利用H₂O₂对肝素 溶液进行氧化并脱色。在进行脱色的过程中，可以不断地补充H₂O₂进行氧 化脱色。氧化过程可以进行一次或两次或多次。

在本文中列举了通过乙醇沉淀分离方法进一步纯化肝素产品，此外也可 以利用膜分离、重力梯度离心等各种本领域技术人员常用的方法来进行进一 步的分离纯化。

脱色之后得到精品肝素的溶液，此时，可以通过对该肝素溶液进行冷冻 干燥以获得精品肝素粉末。冷冻干燥的方法可以参考本领域中通常采用的方 法，在本文的一个具体的实施方式中用0.45um微孔滤膜进行过滤，用冰醋 酸调节溶液pH6.0，用0.22um微孔滤膜进行过滤，过滤后进行冻干24小时， 得到精品肝素粉末。

在本文中为了获得精品肝素，除杂质步骤和乙醇沉淀步骤重复进行两次 或三次以上。

通过上述本文的制备精品肝素的方法得到质量收率可以通过：(精品肝 素质量/粗品肝素质量)×100%来计算。

通过上述本文的制备精品肝素的方法得到效价收率可以通过：质量收率 ×(精品肝素aPTT/粗品肝素aPTT)×100%来计算。

利用本文的制备精品肝素的方法的效价收率通常在70%以上。

利用本文的制备精品肝素的方法的质量收率通常在35%以上。

通过上述本文所述的方法可以获得本文的精品肝素，即羊血浆效价为 150IU/mg以上，优选为160IU/mg以上，进一步优选为170IU/mg以上的 精品肝素，并且所述精品肝素所含的半乳糖胺的杂质为5质量%以下，优选 为3质量%以下，进一步优选为1质量%以下，再进一步优选为0.8质量%， 0.5质量%，0.3质量%，0.1质量%以下。

此外，还可以是该精品肝素在260nm处的吸光度为0.1以下，在280nm 处的吸光度为0.1以下。

实施例

下面结合具体实施例对本文作进一步说明，但本文并不限于以下实施 例。此外，在实施例中使用的是MBP-ChonAC和MBP-ChonB作为硫酸软 骨素酶AC和硫酸软骨素酶B的代表，本领域技术人员应当理解，任何形式 的硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B均可以用于实现本发明的目的。除非 另有说明，实施例中涉及的百分比为质量百分比，份数为质量份数。

半乳糖胺杂质检测方法

1.溶液制备

(1)流动相(14mM的氢氧化钾溶液)：量取1mol/L的氢氧化钾溶液14ml， 于1000ml的容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得14mM的氢氧化钾溶 液。

(2)氨基葡糖对照溶液：称取USP盐酸氨基葡萄糖对照品(USP  Glucosamine Hydrochloride RS)16mg于10ml容量瓶中，加5N盐酸溶液溶解 并定容至刻度，摇匀即得1.6mg/ml的USP盐酸氨基葡萄糖溶液。

(3)半乳糖胺对照溶液：称取USP盐酸氨基半乳糖对照品(USP Galactosa 分钟e Hydrochloride RS)1.6mg于100ml容量瓶中，加5N盐酸溶液溶解并定 容至刻度，摇匀即得16μg/ml的USP半乳糖胺溶液。

(4)对照溶液：氨基葡糖对照溶液和半乳糖胺对照溶液等体积混合。

(5)水解标准溶液：转移10ml标准溶液于20ml带有螺帽的玻璃管中， 密闭，100℃加热6小时。冷却至室温，转移溶液于1000ml容量瓶中，用水 稀释至刻度。

(6)样品溶液：称取24mg待测肝素样品于20ml玻璃管中，加5N的盐 酸10ml溶解，密闭。

(7)水解样品溶液：100℃加热样品溶液6小时，冷却至室温，转移溶液 于1000ml容量瓶，用水稀释至刻度。

2液相系统

模式：HPIC

检测器：脉冲电流检测器，按照下表设计

步骤 时间(s) 电压(V) 过程 1 0.00 +0.1 － 2 0.20 +0.1 开始 3 0.40 +0.1 结束 4 0.41 -2.0 － 5 0.42 -2.0 － 6 0.43 +0.6 － 7 0.44 -0.1 － 8 0.50 -0.1 －

柱子：3mm×30mm保护柱及3mm×15cm柱，L69填料；

柱温：维持柱温为30℃；

流速：0.5ml/分钟；

预平衡：至少用流动相冲洗60分钟；

进样体积：10μl；

洗脱：流动相冲洗10分钟；

柱子清洗：用100mM氢氧化钾至少冲洗10分钟；

平衡：每次进样前至少用流动相冲洗10分钟；

3系统适应性

(1)样品：水解对照溶液

(2)系统适应性要求

分离度：半乳糖胺峰与氨基葡萄糖峰的分离度要不小于2；

柱效：对氨基葡萄糖来说，理论塔板数不小于2000；

拖尾因子：对半乳糖胺峰与氨基葡萄糖峰来说，介于0.8～2.0之间。

4检测

(1)样品：水解对照溶液及水解样品溶液

(2)记录液相图谱，并且测量半乳糖胺峰与氨基葡萄糖峰保留时间时的 峰响应值，计算在水解对照溶液中，半乳糖胺峰对氨基葡萄糖峰响应比值 (GalN_R)：

${\mathrm{GalN}}_R=\frac{{\mathrm{GalN}}_B}{{\mathrm{GalN}}_W}\times \frac{{\mathrm{GlcN}}_W}{{\mathrm{GlcN}}_B}$

其中GalN_B：水解对照溶液中半乳糖胺峰面积；

GalN_W：对照溶液中半乳糖胺对照品的称样量mg；

GlcN_B：水解对照溶液氨基葡萄糖峰面积；

GlcN_W：对照溶液中氨基葡萄糖对照品的称样量mg。

5计算氨基己醣中半乳糖胺含量W%

氨基己醣中半乳糖胺含量$W\%=\frac{{\mathrm{GalN}}_U/{\mathrm{GalN}}_R}{{\mathrm{GalN}}_U/{\mathrm{GalN}}_R+{\mathrm{GlcN}}_U}\times 100\%$

其中GalN_U：水解样品溶液中半乳糖胺峰面积；

GalN_R：半乳糖胺峰对氨基葡萄糖峰响应比值；

GlcN_U：水解样品溶液中氨基葡萄糖峰面积。

6可接受的标准

水解样品溶液中半乳糖胺峰面积占总氨基己糖峰面积的百分比：≤1%

吸光度的测定方法

秤取100mg待测肝素样品于25ml容量瓶中，加去离子水至刻度，充分 溶解。用1cm光程石英比色皿在紫外可见分光光度计(Gold Spectramlab54, 上海棱光技术)上测定吸光度(以去离子水调零)。分别测定260nm(用于表征 核酸的浓度)和280nm(用于表征蛋白质的浓度)吸光度。

活化部分凝血酶时间法(羊血浆效价的检测方法)

1)溶液配制

空白：0.9%的氯化钠溶液，分别为B1-B2；

标准：用0.9%的氯化钠溶液溶解肝素钠BRP(是标准品，购买自European  Directorate for Quality Medicines，EDQM，欧洲药品质量管理局)(H0200000) 至三个浓度梯度S1-S3分别为1.2、1.44、1.728IU/ml；

样品：首先估计待测样品的效价，然后按照估计效价用0.9%的氯化钠 溶液溶解至三个浓度梯度T1-T3分别为1.2、1.44、1.728IU/ml。

2)测定步骤

标记14个EP管按顺序B1、S1、S2、S3、T1、T2、T3、T1、T2、T3、 S1、S2、S3、B2放在冰浴上，加入融化的绵羊血浆(山东苍山向明生化助剂 厂)1.0mL和1.0mL标准品或者样品或者空白，注意不要产生气泡；

转移14个EP管至37℃水浴保持90秒之后加入1.6mL合适浓度的含有 磷脂和激活剂鞣花酸的APTT试剂(希森美康医用电子(上海)有限公司)，使 空白的再钙化时间不超过60秒；

加入APTT试剂之后在37℃水浴保温240秒之后加入在37℃水浴预热 的3.7g/L的氯化钙溶液2mL，立即记录血凝时间(600nm波长下吸光度变化 为值为最大值的一半时的时间)。

用生物检定统计法中的量反应平行线原理3×3法，计算效价和实验误 差，平均可信限率(FL%)应不得大于15%。

实施例1

将40g购自四川广元申达实业有限公司的粗品肝素钠溶解于400ml去离 子水中，加入0.3%(w/v)的氯化钠、0.22%(w/v)的氯化钙，调节pH7.5，加入 硫酸软骨素酶B(MBP-ChonB)200IU在30℃反应0.5小时后再加入200IU在 30℃反应1.5小时。反应结束后加入2.7%(W/V)NaCl，调节pH为8.9，控制 温度48℃，加入0.6%(W/W)的胰酶，每小时调节pH为8.9，酶解5.5小时。 胰酶酶解结束后，加入2.78%(W/V)的CaCl₂常温反应30分钟，升温80～85℃， 用20%的NaOH调pH为9.3，10000g离心10分钟。将料液放凉到40℃以 下，调pH10.3，10000g离心10分钟。离心后的料液加入3.0%(W/V)无水碳 酸钠，48℃反应30分钟，10000g离心10分钟。离心后的料液，用6mol/L 的HCl，调pH6.2，控制乙醇度数42%进行分级分离，静置20分钟，收集沉 淀。将沉淀加纯化水267ml溶解，加入1.5%(W/V)NaCl，用20%的NaOH 调pH为9.5，加入2.7%(W/V)的CaCl₂，升温80～85℃，反应30分钟，将料 液放凉到40℃以下。料液中加入2.7%(W/V)无水碳酸钠，常温反应30分钟， 10000g离心10分钟。将离心后的料液，用20%的NaOH调pH10.2，控制温 度28℃，加入体积2.5%(V/V)浓度为30%的H₂O₂，加入时间分别为0小时、 2小时、4小时、12小时、14小时，氧化24小时。氧化过程进行三次之后， 将氧化后的料液用6mol/L的HCl，调pH6.2，控制乙醇度数42%进行分级， 静置20分钟。用0.45μm微孔滤膜进行过滤，用冰醋酸调节溶液pH6.0，用 0.22μm微孔滤膜进行过滤，过滤后进行冻干24小时，得到16.1g精品肝素。

根据上述的方法对实施例1得到的精品肝素进行检测，检测结果如下：

精品肝素检测结果：

(1)精品肝素吸光度检测：A260=0.098，A280=0.075，满足药典规定的 A260≤0.1，A280≤0.1。

(2)羊血浆效价检测：粗品肝素aPTT效价为96.043IU/mg，精品肝素 aPTT效价为175.25IU/mg。

(3)质量收率=(精品肝素质量/粗品肝素质 量)×100%=(16.1/40)×100%=40.25%。

(4)效价收率=质量收率×(精品肝素aPTT/粗品肝素 aPTT)×100%=40.25%×(175.25/96.043)=73.44%。

(5)半乳糖胺杂质检测：用CarboPac PA20分析柱检测半乳糖胺杂质， 粗品肝素为21.9%，精品肝素为0.274±0.022%，精品满足药典规定的≤1%标 准。

实施例2

将40g购自四川广元申达实业有限公司的粗品肝素钠溶解于400ml去离 子水中，加入0.3%(w/v)的氯化钠、0.22%(w/v)的氯化钙，调节pH7.5，加入 硫酸软骨素酶AC(MBP-ChonAC)120IU在30℃反应0.5小时后再加入120IU 在30℃反应1.5小时。反应结束后加入2.7%(W/V)NaCl，调节pH为8.9， 控制温度48℃，加入0.6%(W/W)的胰酶，每小时调节pH为8.9，酶解5.5 小时。胰酶酶解结束后，加入2.78%(W/V)的CaCl₂常温反应30分钟，升温 80～85℃，用20%的NaOH调pH为9.3，10000g离心10分钟。将料液放凉 到40℃以下，调pH10.3，10000g离心10分钟。离心后的料液加入3.0%(W/V) 无水碳酸钠，48℃反应30分钟，10000g离心10分钟。离心后的料液，用 6mol/L的HCl，调pH6.2，控制乙醇度数42%进行分级分离，静置20分钟， 收集沉淀。将沉淀加纯化水267ml溶解，加入1.5%(W/V)NaCl，用20%的 NaOH调pH为9.5，加入2.7%(W/V)的CaCl₂，升温80～85℃，反应30分钟， 将料液放凉到40℃以下。料液中加入2.7%(W/V)无水碳酸钠，常温反应30 分钟，10000g离心10分钟。将离心后的料液，用20%的NaOH调pH10.2， 控制温度28℃，加入体积2.5%(V/V)浓度为30%的H₂O₂，加入时间分别为0 小时、2小时、4小时、12小时、14小时，氧化24小时。氧化过程进行三 次之后，将氧化后的料液用6mol/L的HCl，调pH6.2，控制乙醇度数42%进 行分级，静置20分钟。用0.45μm微孔滤膜进行过滤，用冰醋酸调节溶液 pH6.0，用0.22μm微孔滤膜进行过滤，过滤后进行冻干24小时，得到16.5g 精品肝素。

根据上述的方法对实施例2得到的精品肝素进行检测，检测结果如下：

精品肝素检测结果：

(1)精品肝素吸光度检测：A260=0.090，A280=0.061，满足药典规定的 A260≤0.1，A280≤0.1。

(2)羊血浆效价检测：粗品肝素aPTT效价为96.043IU/mg，精品肝素 aPTT效价为173.75IU/mg。

(3)质量收率=(精品肝素质量/粗品肝素质 量)×100%=(16.5/40)×100%=41.25%。

(4)效价收率=质量收率×(精品肝素aPTT/粗品肝素 aPTT)×100%=41.25%×(173.75/96.043)=74.62%。

(5)半乳糖胺杂质检测：用CarboPac PA20分析柱检测半乳糖胺杂质， 粗品肝素为21.9%，精品肝素为0.232%，精品满足药典规定的≤1%标准。

实施例3

将40g购自四川广元申达实业有限公司的粗品肝素钠溶解于400ml去离 子水中，加入0.3%(w/v)的氯化钠、0.22%(w/v)的氯化钙，调节pH7.5，加入 硫酸软骨素酶AC(MBP-ChonAC)120IU和硫酸软骨素酶 B(MBP-ChonB)200IU在30℃反应0.5小时后再加入120IU MBP-ChonAC和 200IU MBP-ChonB在30℃反应1.5小时。反应结束后加入2.7%(W/V)NaCl， 调节pH为8.9，控制温度48℃，加入0.6%(W/W)的胰酶，每小时调节pH 为8.9，酶解5.5小时。胰酶酶解结束后，加入2.78%(W/V)的CaCl₂常温反 应30分钟，升温80～85℃，用20%的NaOH调pH为9.3，10000g离心10 分钟。将料液放凉到40℃以下，调pH10.3，10000g离心10分钟。离心后 的料液加入3.0%(W/V)无水碳酸钠，48℃反应30分钟，10000g离心10分钟。 离心后的料液，用6mol/L的HCl，调pH6.2，控制乙醇度数42%进行分级分 离，静置20分钟，收集沉淀。将沉淀加纯化水267ml溶解，加入 1.5%(W/V)NaCl，用20%的NaOH调pH为9.5，加入2.7%(W/V)的CaCl₂， 升温80～85℃，反应30分钟，将料液放凉到40℃以下。料液中加入2.7%(W/V) 无水碳酸钠，常温反应30分钟，10000g离心10分钟。将离心后的料液， 用20%的NaOH调pH10.2，控制温度28℃，加入体积2.5%(V/V)浓度为30% 的H₂O₂，加入时间分别为0小时、2小时、4小时、12小时、14小时，氧 化24小时。氧化过程进行三次之后，将氧化后的料液用6mol/L的HCl，调 pH6.2，控制乙醇度数42%进行分级，静置20分钟。用0.45μm微孔滤膜进 行过滤，用冰醋酸调节溶液pH6.0，用0.22μm微孔滤膜进行过滤，过滤后 进行冻干24小时，得到15.8g精品肝素。

根据上述的方法对实施例3得到的精品肝素进行检测，检测结果如下：

精品肝素检测结果：

(1)精品肝素吸光度检测：A260=0.095，A280=0.077，满足药典规定的 A260≤0.1，A280≤0.1。

(2)羊血浆效价检测：粗品肝素aPTT效价为96.043IU/mg，精品肝素 aPTT效价为178.23IU/mg。

(3)质量收率=(精品肝素质量/粗品肝素质 量)×100%=(15.8/40)×100%=39.5%

(4)效价收率=质量收率×(精品肝素aPTT/粗品肝素 aPTT)×100%=39.5%×(178.23/96.043)=73.30%。

(5)半乳糖胺杂质检测：用CarboPac PA20分析柱检测半乳糖胺杂质， 粗品肝素为21.9%，精品肝素为0.087±0.024%，精品满足药典规定的≤1%标 准。

对比例1

将40g购自四川广元申达实业有限公司的粗品肝素钠溶解于400ml去离 子水中，加入3%(W/V)NaCl，调节pH为8.9，控制温度48℃，加入0.6%(W/W) 的胰酶，每小时调节pH为8.9，酶解5.5小时。胰酶酶解结束后，加入3%(W/V) 的CaCl2常温反应30分钟，升温80～85℃，用20%的NaOH调pH为9.3， 10000g离心10分钟。将料液放凉到40℃以下，调pH10.3，10000g离心10 分钟。离心后的料液加入3.0%(W/V)无水碳酸钠，48℃反应30分钟，10000g 离心10分钟。离心后的料液，用6mol/L的HCl，调pH6.2，控制乙醇度数 42%进行分级分离，静置20分钟，收集沉淀。将沉淀加纯化水267ml溶解， 加入1.5%(W/V)NaCl，用20%的NaOH调pH为9.5，加入2.7%(W/V)的CaCl2， 升温80～85℃，反应30分钟，将料液放凉到40℃以下。料液中加入2.7%(W/V) 无水碳酸钠，常温反应30分钟，10000g离心10分钟。将离心后的料液， 用20%的NaOH调pH10.2，控制温度28℃，加入体积2.5%(V/V)浓度为30% 的H₂O₂，加入时间分别为0小时、2小时、4小时、12小时、14小时，氧 化24小时。将氧化后的料液用6mol/L的HCl，调pH6.2，控制乙醇度数42% 进行分级，静置20分钟，收集沉淀。将沉淀加纯化水137ml溶解，加入 1.5%(W/V)NaCl，用20%的NaOH调pH为10.2，控制温度28℃，加入体积 2.0%(V/V)浓度为30%的H₂O₂，加入时间分别为0小时、2小时、4小时、 12小时，氧化24小时。将氧化后的料液用6mol/L的HCl，调pH6.2，控制 乙醇度数42%进行分级，静置20分钟，收集沉淀。将分级后的沉淀加120ml 纯化水溶解，料液加入1.5%(W/V)NaCl，用20%的NaOH调pH为10.2，控 制温度28℃，加入体积1.5%(V/V)浓度为30%的H₂O₂，加入时间分别为0 小时、2小时、4小时，氧化24小时。将氧化后的料液用6mol/L的HCl， 调pH6.2，控制乙醇度数42%进行分级，静置20分钟，收集沉淀。将分级 后的沉淀加107.2ml纯化水溶解，调pH6.2，控制乙醇度数42%进行分级， 静置30分钟。用0.45μm微孔滤膜进行过滤，用冰醋酸调节溶液pH6.0，用 0.22μm微孔滤膜进行过滤，过滤后进行冻干24小时，得到18.5g精品肝素。

根据上述的方法对对比例1得到的精品肝素进行检测，检测结果如下：

产品肝素检测结果：

(1)精品肝素吸光度检测：A260=0.030，A280=0.019，满足药典规定的 A260≤0.1，A280≤0.1。

(2)羊血浆效价检测：粗品肝素aPTT效价为96.043IU/mg，精品肝素 aPTT效价为143.87IU/mg。

(3)质量收率=(精品肝素质量/粗品肝素质 量)×100%=(18.5/40)×100%=46.25%。

(4)效价收率=质量收率×(精品肝素aPTT/粗品肝素 aPTT)×100%=46.25%×(143.87/96.043)=69.28%。

(5)半乳糖胺杂质检测：用CarboPac PA20分析柱检测半乳糖胺杂质， 粗品肝素为21.9%，精品肝素为11.146±0.081%，不满足药典规定的≤1%标 准。

表1实施例1～3和对比例的比较

根据表1所列举的数据可以知道利用硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素 酶B可以除去粗品肝素中的多种难以除去的杂质，尤其是半乳糖胺杂质，例 如硫酸皮肤素(DS)、硫酸软骨素(CS，包括硫酸软骨素A和硫酸软骨素C) 以及软骨素，从而使得得到的精品肝素中的半乳糖胺杂质显著地低于对比例 中的肝素产品。此外，精品肝素的效价也显著提高。此外本文涉及的制备精 品肝素的方法在进行了两次乙醇沉淀之后，就可以获得良好的精品肝素。简 化了目前纯化肝素产品时使用的繁杂的方法。

以上全面描述了本发明的优选实施例，但是可对它们进行各种替代和修 改。因此，不应参照以上描述来决定本发明的范围，而是应参照所附权利要 求书及其全部等同物来决定本发明的范围。任何特征，(不论是否为优选)均 可与任何其他特征(不论是否为优选)相结合。本发明的权利要求书不应被理 解为具有方法+功能的限制，除非在某一权利要求中通过术语“…的方法”明 确地列举出此类限制。将本文中出现的参考文献并入作为参考。