一种小牛血去蛋白提取物组合物及其注射剂和制法

摘要

本发明公开了一种小牛血去蛋白提取物的制法，包括如下步骤：a)缓化；b)酸沉；c)低温冷冻、升温溶解、离心，取上清液；d)碱沉；e)重复c)步骤；f)将步骤e)的上清液醇沉、离心，取上清液；g)将步骤f)的上清液超滤、真空浓缩，得浓缩超滤液；h)将步骤g)的浓缩超滤液超滤，收集超滤液，即得。本发明所提供的制法，既不破坏生物活性、又不引入外源离子、能有效去除其中杂蛋白；由该小牛血去蛋白提取物制得的注射剂，不会引发过敏反应，安全度高，能有效治疗脑中风、脑外伤、脑功能不全及脑痴呆等脑细胞代谢障碍性疾病，改善细胞氧含量和微循环；注射剂的制备方法，能充分保证最终产品的质量稳定性和安全度，保证制剂的药用效果，消除现有制剂的副作用。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及一种小牛血去蛋白提取物及其注射剂和制 法。

技术背景

小牛血去蛋白提取物水针剂，曾用名：血活素注射液，系由新鲜小牛血或血 清经去蛋白、浓缩、超滤或透析等工艺制得的含有无机物及小分子有机物的灭菌 水溶液。可增强组织细胞对氧及葡萄糖摄取与利用，改善细胞乏氧状态和机体内 环境，增加心、脑、肝等脏器的血流量，改善微循环。用于脑缺血、脑痴呆、脑 外伤及大脑功能不全等脑细胞代谢障碍性疾病的治疗。目前，已公开了一些有关 小牛血去蛋白提取物的制备工艺，多数工艺采用乙醇沉淀、酶解、高温、酸碱等 方法去除杂蛋白，也有用柱层析除杂的方法。这些方法都存在去除蛋白不完全的 问题，临床使用时会由于杂蛋白未有效去除而发生不良反应，其中的有机物类物 质如氨基酸、小肽、核苷酸、嘌呤等发生聚合为大分子物质而易引起过敏反应； 而且酶解、高温、酸碱等方法去除杂蛋白时，还存在破坏其中原有的生物活性、 降低其药用价值的缺点；另外，酸碱法去除杂蛋白还会引入外源离子，这都会降 低其药用价值；另外，由于工艺重现性不好，而难以大规模生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种既不破坏生物活性、又不引入外源离子、能有效去 除其中杂蛋白的的小牛血去蛋白提取物的制法，及由该小牛血去蛋白提取物制得 的注射剂及制法。

本发明的小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤：

a)将小牛血在30-40℃缓化20min，得缓化后的小牛血；

b)向步骤a)得到的缓化后的小牛血中加入盐酸溶液进行酸沉，调整pH至 3.5～4.0，得酸化后的小牛血；所述盐酸溶液是纯化水与质量分数为36％～38％的 盐酸按照1∶1的体积比配制的；

c)将步骤b)得到的酸化后的小牛血在-25℃下低温冷冻24h，然后再以1℃ /min的升温速度升温至60℃，并60℃恒温1h，待冷冻后的小牛血融化后，在离 心机转速为15000转/分钟的情况下进行离心分离12min，收集上清液，备用；

d)向步骤c)得到的上清液中加入质量分数为20％的NaOH溶液，调节pH 值至8.0～8.5，得碱化后的上清液；

e)将步骤d)得到的碱化后的上清液在-20℃下低温冷冻24h，然后再以1℃ /min的升温速度升温至40℃，并40℃恒温1h，待冷冻后的小牛血融化后，在离 心机转速为13000转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；

f)将步骤e)得到的上清液置于配液罐内，在70r/min的搅拌速度下，按照 上清液与乙醇溶液的体积比为1∶2的比例，缓慢加入质量分数为80％的乙醇溶 液，在离心机转速为13000转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；

g)将步骤f)得到的上清液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤， 所得超滤液在真空度为-0.1MPa、60℃恒温下进行真空浓缩，浓缩至体积为原超 滤液体积的1/15，得浓缩超滤液；

h)将步骤g)得到的浓缩超滤液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行 超滤，收集超滤后的液体，然后置于配液罐中在70r/min的搅拌速度下混合30min， 即得小牛血去蛋白提取物。

步骤c)、e)对小牛血进行冷冻、融化的循坏，可以促使细胞内外的有效物质 充分释放，不破坏有效成分的生物活性、保证有效成分的充分提取；步骤c)以1℃ /min的升温速度升温至60℃，并60℃恒温1h，对冷冻的小牛血进行融化，不仅 可以有效地、完全地去除其中的杂蛋白，而且不会破坏有效成分的生物活性，同 时具有杀菌作用，能对牛源性病毒充分灭活，保证了小牛血去蛋白提取物的安全 性；步骤e)以1℃/min的升温速度升温至40℃，并40℃恒温1h，可以进一步去 除杂蛋白，灭活牛源性病毒；步骤f)中进一步用乙醇以一定的比例对步骤b)得 到的上清液进行混合，进一步去除杂蛋白，充分保证了杂蛋白去除的完全性；超 滤柱的使用，进一步保证了杂蛋白去除的完全性。

本发明的小牛血去蛋白提取物的制备方法，不仅能有效地、完全地去除其中 的杂蛋白，而且不会破坏有效成分的生物活性，同时具有杀菌作用，能对牛源性 病毒充分灭活，保证了小牛血去蛋白提取物的安全性；另外工艺重现性好，利于 大规模生产。

由本发明的的制备方法制得的小牛血去蛋白提取物制得的注射剂，包括粉针 剂和水针剂。

为了方便存放和运输，将由本发明的的制备方法制得的小牛血去蛋白提取物 制成粉针剂和水针剂，存放和携带方便，便于运输。

本发明的注射剂为粉针剂，粉针剂包括下列重量份的原料：

小牛血去蛋白提取物  4000

冻干保护剂          200

注射用水           4000，

所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3∶1的重量份数比组成。

冻干保护剂的加入，可有效保证最终的冻干剂中活性成分的生物活性，特别 是海藻糖与PEG以3∶1的重量份数比作为冻干保护剂，在保证有效保证最终的冻 干剂中活性成分的生物活性的同时，也具有稳定作用，使最终制得的冻干剂生物 活性高、性质稳定。

本发明的注射剂为水针剂，水针剂包括下列重量份的原料：

小牛血去蛋白提取物  600

注射用水            400。

本发明的注射剂的制备方法，包括如下步骤：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度大于等于1.0560 补加注射用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对小牛血去 蛋白提取物进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对小牛血去蛋 白提取物进行超滤至稀配罐中，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0260～1.0560 补加注射用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加10％的氢氧化钠溶液调节pH值至 6.8～7.3，搅拌10min至均匀，取样检测，得澄明度合格的稀配液；

e)向步骤d)得到的澄明度合格的稀配液中，边搅拌边加入海藻糖与PEG， 混合均匀，然后经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；

f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0.3的紫外线照射1min，得处理 后的除菌稀配液；

g)灌装：将清洗灭菌后的缓冲罐与硅胶管、陶瓷泵、灌装针头、分药器、 胶塞震荡器用无菌操作法连接安装到灌装机上，对步骤f)得到的处理后的除菌 稀配液进行灌装，得灌装稀配液；

h)冻干：将步骤g)得到的灌装稀配液置于冻干机内进行冻干，得注射剂， 即粉针剂。

对小牛血去蛋白提取物先浓配后稀配，得到的最终产品中，小牛血去蛋白 提取物分散均匀，最终产品质量稳定；灭菌处理可以保证最终产品的安全性；制 备方法工艺简单，工艺可重复性好，利于大规模生产。

现有的小牛血去蛋白提取物药物，患者使用后易出现兴奋、睡眠质量差等 副作用，本发明在制备小牛血去蛋白提取物的粉针剂过程中，通过对制备工艺的 改进，解决了该技术问题，防止了患者使用后易出现兴奋、睡眠质量差等副作用。 其对制备工艺的改进是：在步骤f)中，将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为 0.3的紫外线照射1min。

优选地，本发明的注射剂的制备方法，步骤e)中，除菌过滤器上、下游压 力的压差不超过0.08Mpa。

在这个参数设置范围内，可以有效保证除菌效果，保证最终产品的安全性。

优选地，本发明的注射剂的制备方法，步骤f)中，灌装过程每30分钟抽检 装量一次，每个针头抽检2支，罐装量为3.95～4.05ml/支。

可以有效地保证最终产品的质量，保证其安全性和稳定性。

优选地，本发明的注射剂的制备方法，步骤g)中，冻干过程的干燥设置如下：

冷冻控制：设定导热油温度-45℃～-50℃，持续时间90分钟；设定导热油温 度-10℃持续时间15分钟；设定导热油温度-45℃～-50℃，持续时间180分钟；

后箱预冷：设定后箱温度为-45℃～-50℃；

预抽真空：设定干燥箱预抽真空度为0.15mPa；

升华干燥：

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为-15℃，持续时间840分 钟；

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为-10℃，持续时间180分 钟；

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为-5℃，持续时间180分钟；

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为0℃，持续时间180分钟；

解析干燥：

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为5℃，持续时间120分钟；

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为15℃，持续时间120分 钟；

设定干燥箱真空度为0.05mPa，导热油温度为36℃，持续时间360分钟。

冻干过程中各个阶段的温度设置对冻干的效果影响很大，如上的设置可保证 小牛血去蛋白提取物的生物活性和制剂的冻干效果，保证最终产品的质量。

本发明的注射剂的制备方法，包括如下步骤：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度大于等于1.0260 补加注射用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对补加注射 水后的小牛血去蛋白提取物溶液进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿 的膜片对其进行超滤至稀配罐中，搅拌10min至均匀，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0242～1.0260 补加注射用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加5％的氢氧化钠溶液调节pH值至6.7～7.1， 搅拌10min至均匀，取样检测，得合格的稀配液；

e)将步骤d)得到的合格的稀配液，经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲 罐，得除菌稀配液；

f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0.3的紫外线照射1min，得处理 后的除菌稀配液；

g)灌装：将清洗灭菌后的硅胶管、陶瓷泵、灌封针头、分液器在A级保护 下用无菌操作法连接安装到灌封机上，对步骤f)得到的处理后的除菌稀配液进 行灌装，得灌装稀配液；

h)灭菌：用推板将步骤g)得到的灌装稀配液，足够紧凑的装入周转盘中， 把周转盘整齐装满灭菌车，进行灭菌，得注射剂，即水针剂。

对小牛血去蛋白提取物先浓配后稀配，得到的最终产品中，小牛血去蛋白 提取物分散均匀，最终产品质量稳定；灭菌处理可以保证最终产品的安全性；制 备方法工艺简单，工艺可重复性好，利于大规模生产。

现有的小牛血去蛋白提取物药物，患者使用后易出现兴奋、睡眠质量差等 副作用，本发明在制备小牛血去蛋白提取物的粉针剂过程中，通过对制备工艺的 改进，解决了该技术问题，防止了患者使用后易出现兴奋、睡眠质量差等副作用。 其对制备工艺的改进是：在步骤f)中，将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为 0.3的紫外线照射1min。

优选地，本发明的注射剂的制备方法，步骤g)中，灭菌条件为115℃、30 分钟。

在这种灭菌条件设置下，对水针剂的灭菌效果最好，产品的稳定性和安全度 高。

本发明的有益效果为：

本发明所提供的小牛血去蛋白提取物的制法，既不破坏生物活性、又不引入 外源离子、能有效去除其中杂蛋白；由该小牛血去蛋白提取物制得的注射剂，不 会引发过敏反应，安全度高，能有效治疗脑中风、脑外伤、脑功能不全及脑痴呆 等脑细胞代谢障碍性疾病，改善细胞氧含量和微循环；注射剂的制备方法，能充 分保证最终产品的质量稳定性和安全度，保证制剂的药用效果，防止患者使用后 出现兴奋、睡眠质量差等副作用。

附图说明

图1为对照组耳缘静脉组织照片(×200倍)；

图2为给药组耳缘静脉组织照片(×200倍)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1小牛血去蛋白提取物的制法

一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤：

a)将小牛血在35℃缓化20min，得缓化后的小牛血；

b)向步骤a)得到的缓化后的小牛血中加入盐酸溶液进行酸沉，调整pH至 4.0，得酸化后的小牛血；所述盐酸溶液是纯化水与质量分数为37％的盐酸按照 1∶1的体积比配制的；

c)将步骤b)得到的酸化后的小牛血在-25℃下低温冷冻24h，然后再以1℃ /min的升温速度升温至60℃，并60℃恒温1h，待冷冻后的小牛血融化后，在离 心机转速为15000转/分钟的情况下进行离心分离12min，收集上清液，备用；

d)向步骤c)得到的上清液中加入质量分数为20％的NaOH溶液，调节pH 值至8.0～8.5，得碱化后的上清液；

e)将步骤d)得到的碱化后的上清液在-20℃下低温冷冻24h，然后再以1℃ /min的升温速度升温至40℃，并40℃恒温1h，待冷冻后的小牛血融化后，在离 心机转速为13000转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；

f)将步骤e)得到的上清液置于配液罐内，在70r/min的搅拌速度下，按照 上清液与乙醇溶液的体积比为1∶2的比例，缓慢加入质量分数为80％的乙醇溶 液，在离心机转速为13000转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；

g)将步骤f)得到的上清液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤， 所得超滤液在真空度为-0.1MPa、60℃恒温下进行真空浓缩，浓缩至体积为原超 滤液体积的1/15，得浓缩超滤液；

h)将步骤g)得到的浓缩超滤液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行 超滤，收集超滤后的液体，然后置于配液罐中在70r/min的搅拌速度下混合30min， 即得小牛血去蛋白提取物。

实施例2粉针剂

处方：

小牛血去蛋白提取物  4000g

冻干保护剂          200g

注射用水            4000g

所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3∶1的重量份数比组成；

制法：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度1.0560补加注射 用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对小牛血去蛋白提取 物进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对小牛血去蛋白提取物 进行超滤至稀配罐中，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0260补加注射 用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加10％的氢氧化钠溶液调节pH值至6.8， 搅拌10min至均匀，取样检测，得澄明度合格的稀配液；

e)向步骤d)得到的澄明度合格的稀配液中，边搅拌边加入海藻糖与PEG， 混合均匀，然后经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；所述 除菌过滤器上、下游压力的压差为0.08Mpa；

f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0.3的紫外线照射1min，得处理 后的除菌稀配液；

g)灌装：将清洗灭菌后的缓冲罐与硅胶管、陶瓷泵、灌装针头、分药器、 胶塞震荡器用无菌操作法连接安装到灌装机上，对步骤e)得到的处理后的除菌 稀配液进行灌装，得灌装稀配液；灌装过程每30分钟抽检装量一次，每个针头 抽检2支，罐装量为4.00ml/支；

h)冻干：将步骤f)得到的灌装稀配液置于冻干机内进行冻干，得冻干剂； 冻干过程中干燥设置如下：

冷冻控制：设定导热油温度-45℃，持续时间90分钟；设定导热油温度-10℃ 持续时间15分钟；设定导热油温度-45℃，持续时间180分钟；

后箱预冷：设定后箱温度为-45℃；

预抽真空：设定干燥箱预抽真空度为0.15mPa；

升华干燥：

设定干燥箱真空度为0.10mPa，导热油温度为-15℃，持续时间840分钟；

设定干燥箱真空度为0.10mPa，导热油温度为-10℃，持续时间180分钟；

设定干燥箱真空度为0.10mPa，导热油温度为-5℃，持续时间180分钟；

设定干燥箱真空度为0.10mPa，导热油温度为0℃，持续时间180分钟；

解析干燥：

设定干燥箱真空度为0.10mPa，导热油温度为5℃，持续时间120分钟；

设定干燥箱真空度为0.10mPa，导热油温度为15℃，持续时间120分钟；

设定干燥箱真空度为0.05mPa，导热油温度为36℃，持续时间360分钟。

实施例3粉针剂

处方：

小牛血去蛋白提取物  4000g

冻干保护剂          200g

注射用水            4000g

所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3∶1的重量份数比组成；

制法：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度1.0580补加注射 用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对小牛血去蛋白提取 物进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对小牛血去蛋白提取物 进行超滤至稀配罐中，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0560补加注射 用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加10％的氢氧化钠溶液调节pH值至7.3， 搅拌10min至均匀，取样检测，得澄明度合格的稀配液；

e)向步骤d)得到的澄明度合格的稀配液中，边搅拌边加入海藻糖与PEG， 混合均匀，然后经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；所述 除菌过滤器上、下游压力的压差为0.06Mpa；

f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0.3的紫外线照射1min，得处理 后的除菌稀配液；

g)灌装：将清洗灭菌后的缓冲罐与硅胶管、陶瓷泵、灌装针头、分药器、 胶塞震荡器用无菌操作法连接安装到灌装机上，对步骤e)得到的处理后的除菌 稀配液进行灌装，得灌装稀配液；灌装过程每30分钟抽检装量一次，每个针头 抽检2支，罐装量为4.00ml/支；

h)冻干：将步骤f)得到的灌装稀配液置于冻干机内进行冻干，得冻干剂； 冻干过程中干燥设置如下：

冷冻控制：设定导热油温度-50℃，持续时间90分钟；设定导热油温度-10℃ 持续时间15分钟；设定导热油温度-50℃，持续时间180分钟；

后箱预冷：设定后箱温度为-50℃；

预抽真空：设定干燥箱预抽真空度为0.15mPa；

升华干燥：

设定干燥箱真空度为0.30mPa，导热油温度为-15℃，持续时间840分钟；

设定干燥箱真空度为0.30mPa，导热油温度为-10℃，持续时间180分钟；

设定干燥箱真空度为0.30mPa，导热油温度为-5℃，持续时间180分钟；

设定干燥箱真空度为0.30mPa，导热油温度为0℃，持续时间180分钟；

解析干燥：

设定干燥箱真空度为0.30mPa，导热油温度为5℃，持续时间120分钟；

设定干燥箱真空度为0.30mPa，导热油温度为15℃，持续时间120分钟；

设定干燥箱真空度为0.05mPa，导热油温度为36℃，持续时间360分钟。

对照实施例1粉针剂

处方：

小牛血去蛋白提取物  4000g

注射用水            4000g

制法：

除步骤e)为“将步骤d)得到的澄明度合格的稀配液，经0.22μm筒式除 菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液”不同于实施例2中的步骤e)，其余步骤 均与实施例2相同。

对照实施例2粉针剂

处方：

小牛血去蛋白提取物  4000g

冻干保护剂          200g

注射用水            4000g

所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3∶1的重量份数比组成；

制法：

除不含有实施例2中的步骤f)，即“将步骤e)得到的除菌稀配液用波长 为0.3的紫外线照射1min，得处理后的除菌稀配液”，其余步骤均于实施例2相 同。

实施例4水针剂的制法

粉针剂的制法，包括如下步骤：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度1.0260补加注射 用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对补加注射水后的小 牛血去蛋白提取物溶液进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对 其进行超滤至稀配罐中，搅拌10min至均匀，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0242补加注射 用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加5％的氢氧化钠溶液调节pH值至6.7， 搅拌10min至均匀，取样检测，得合格的稀配液；

e)将步骤d)得到的合格的稀配液，经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲 罐，得除菌稀配液；

f)灌装：将清洗灭菌后的硅胶管、陶瓷泵、灌封针头、分液器在A级保护 下用无菌操作法连接安装到灌封机上，对步骤e)得到的除菌稀配液进行灌装， 得灌装稀配液；

g)灭菌：用推板将步骤f)得到的灌装稀配液，足够紧凑的装入周转盘中， 把周转盘整齐装满灭菌车，进行灭菌，即得水针剂；灭菌条件为115℃、30分钟。

实施例5水针剂的制法

粉针剂的制法，包括如下步骤：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度1.0280补加注射 用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对补加注射水后的小 牛血去蛋白提取物溶液进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对 其进行超滤至稀配罐中，搅拌10min至均匀，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0260补加注射 用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加5％的氢氧化钠溶液调节pH值至7.1， 搅拌10min至均匀，取样检测，得合格的稀配液；

e)将步骤d)得到的合格的稀配液，经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲 罐，得除菌稀配液；

f)灌装：将清洗灭菌后的硅胶管、陶瓷泵、灌封针头、分液器在A级保护 下用无菌操作法连接安装到灌封机上，对步骤e)得到的除菌稀配液进行灌装， 得灌装稀配液；

g)灭菌：用推板将步骤f)得到的灌装稀配液，足够紧凑的装入周转盘中， 把周转盘整齐装满灭菌车，进行灭菌，即得水针剂；灭菌条件为115℃、30分钟。

为说明这一情况，现通过试验例进一步说明本发明的效果如下：

试验例1过敏试验

1.试验对象：

豚鼠，雄性18只，体重250-350g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

随机平均分成三组，分别为给药组6只、生理盐水组6只、阳性对照组6只， 按无菌操作。

2.试验方法：

给药组：隔日腹腔注射本发明的小牛血去蛋白提取物0.5ml/只；首次注射后 的第14天，随机选取其中的3只，静脉注射本发明的小牛血去蛋白提取物1ml/ 只；首次注射后的第21天，取剩余的3只，静脉注射本发明的小牛血去蛋白提 取物1ml/只；

生理盐水组：隔日腹腔注射生理盐水0.5ml/只；首次注射后的第14天，随 机选取其中的3只，静脉注射生理盐水1ml/只；首次注射后的第21天，取剩余 的3只，静脉注射生理盐水1ml/只；

阳性对照组：隔日腹腔注射1％新鲜鸡蛋清溶液各0.5ml/只；首次注射后的 第14天，随机选取其中的3只，静脉注射1％新鲜鸡蛋清溶液；首次注射后的第 21天，取剩余的3只，静脉注射1％新鲜鸡蛋清溶液1ml/只；

观察过敏反应现象，按表1进行过敏反应分级。

表1豚鼠过敏反应级数

反应级数2级以上(包括2级)时，可认为过敏试验不合格。

3.试验结果：

实验结果如表2所示。

表2小牛血去蛋白提取物过敏试验结果

如表2所示，重复使用本发明的小牛血去蛋白提取物，未引起豚鼠出现过敏 反应。

4.结论：本发明的小牛血去蛋白提取物，安全度高，对豚鼠无致敏反应。

试验例2体外溶血试验

1.试验对象：长耳白家兔1只。

2.试验药物：

本发明的小牛血去蛋白提取物，规格：400mg(总固体)；用注射用水溶解， 制成每1ml含40ng(总固体)的溶液，备用。

3.试验方法：

取家兔1只，心脏采血10毫升，用竹签搅拌去除纤维蛋白，将血转移到离 心管中，2000转/分，离心5分钟，除去上清液，加生理盐水至10ml，混匀后2000 转/分离心5分钟，弃去上清液，反复四次，将所得的红细胞按体积用生理盐水稀 释成2％混悬液备用。按表3加样，其中第6、7管分别为生理盐水对照管和溶血 的阳性对照管。将各管摇匀后，37摄氏度水浴内温育4小时，按表4标准判断各 管在4小时内是否出现溶血或凝聚。

表3体外溶血试验加样表

表4体外溶血结果判定

4.试验结果：

实验结果如表5所示。

表5小牛血去蛋白提取物体外溶血试验结果

如表5所示，本发明的小牛血去蛋白提取物各浓度4小时内对家兔红细胞均 无溶血或凝聚反应；生理盐水对照组各浓度4小时内对家兔红细胞均无溶血或凝 聚反应；阳性对照组在各个时间点均全溶血。

5.结论：本发明的小牛血去蛋白提取物在各浓度4小时内对家兔红细胞均无 溶血或凝聚反应。

试验例3静脉注射血管刺激性试验

1.试验对象：

长耳白家兔，雌雄兼用(雌未孕)8只，体重2.0-2.5kg，黑龙江黑龙江中医 药大学实验动物中心提供。

随机均分成两组，分别为给药组4只、对照组4只，按无菌操作。

2.试验药物：

本发明的小牛血去蛋白提取物，规格：400mg(总固体)；用注射用水溶解， 制成每1ml含40ng(总固体)的溶液，备用。

3.试验方法：

给药组：用一次性无菌输液器将本发明的小牛血去蛋白提取物经耳缘静脉以 5.0ml/Kg，、0.5ml/min静滴给药，每日一次，连续三天；

对照组：用一次性无菌输液器将生理盐水经耳缘静脉以5.0ml/Kg、0.5ml/min 静滴给药，每日一次，连续三天。

4.统计方法：

给药期间每日观察血管注射部位及整个外耳廓有无变化，在第三次给药后24 小时将动物处死，取给药处血管及周边组织，以5％甲醛溶液固定，切片，染色， 切片部位为进针部位向心端1cm及2cm处。

5.试验结果：

肉眼观察结果：给药组未见血管充血、出血、组织坏死；生理盐水对照组血 管也未见异常病理改变。

病理检查结果：如图1、2所示，给药组、生理盐水对照组动物耳缘静脉内 无血栓形成，血管内皮细胞及周围组织未见水肿、炎性浸润或坏死等异常改变。 表明本发明的小牛血去蛋白提取物对家兔静脉血管无刺激作用。

6.结论：本发明的小牛血去蛋白提取物对家兔静脉血管无刺激作用。

试验例4兴奋性试验

1.试验对象：

长耳白家兔，雌雄兼用(雌未孕)12只，体重2.0-2.5kg，黑龙江黑龙江中 医药大学实验动物中心提供。

随机平均分成三组，分别为试验组、对照组，按无菌操作。

2.试验方法：

试验组：将实施例2的粉针剂用注射用水配制成70％浓度的溶液；长耳白家 兔腹腔注射所得溶液40ml/只然后停药，停药后继续观察7天；分别在停药后第 4天和第7天记录其兴奋反应情况；

对照组：将对照实施例2的粉针剂用注射用水配制成70％浓度的溶液；长耳 白家兔腹腔注射所得溶液40ml/只然后停药，停药后继续观察7天；分别在停药 后第4天和第7天记录其兴奋反应情况；

观察兴奋反应现象，按表6进行兴奋性反应分级。

表6兴奋反应级数

反应级数2级以上(包括2级)时，可认为兴奋性试验不合格。

3.试验结果：

实验结果如表7所示。

表7兴奋性试验结果

如表7所示，试验组的粉针剂，未引起长耳白家兔出现兴奋性反应等副作用；

这表明，在制备本发明的小牛血去蛋白提取物的制剂时，对得到的除菌稀配 液用波长为0.3的紫外线照射1min处理，对制备的制剂效果影响很大，消除了现 有方法制得的小牛血去蛋白提取物药物在使用过程中，易出现兴奋、睡眠质量差 等副作用。

4.结论：本发明的小牛血去蛋白提取物制剂的制备方法，可以很好地消除现 有方法制得的小牛血去蛋白提取物制剂，在使用过程中，易出现兴奋、睡眠质量 差等副作用。

试验例5稳定性试验

1.加速试验

取实施例2的粉针剂，分成3批，分别编号为样品1、样品2和样品3，在 温度40℃±2℃下，相对湿度为75％±5％的条件下放置6个月，在试验期间1个 月、2个月、3个月、6个月末分别取样一次，按中国药典中的规定，检测粉针剂 的性状、葛根素的含量(标示量％)，结果发现，各项指标均无明显变化；

对照实施例1的粉针剂，做同样处理；结果发现，在第3个月，各项指标开 始有所变化，粉针剂颜色稍微加深、葛根素含量下降；在第6个月，各项指标出 现明显变化，粉针剂颜色加深、葛根素含量显著下降；

由实施例2与对照实施例1的加速试验可知，实施例2的粉针剂较对照实施 例1具有加速稳定性。

2.长期试验

取实施例2的粉针剂，分成3批，分别编号为样品1、样品2和样品3，在 温度25℃±2℃下，相对湿度为60％±10％的条件下放置24个月，在试验期间0 个月、3个月、6个月、9个月、12个月末分别取样一次，按中国药典中的规定， 检测粉针剂的性状、葛根素的含量(标示量％)，结果发现，各项指标均无明显 变化；

对照实施例1的粉针剂，做同样处理；结果发现，在第6个月，各项指标开 始有所变化，粉针剂颜色稍微加深、葛根素含量下降；各项指标出现明显变化， 粉针剂颜色加深、葛根素含量显著下降；

由实施例2与对照实施例1的长期试验可知，实施例2的粉针剂较对照实施 例1具有长期稳定性。

3.结论

由加速试验和长期试验可知，实施例2的粉针剂稳定性好，这说明冻干保护 剂的加入，明显地提高了粉针剂的稳定性。

试验例6临床试验急性缺血性脑血管病

1.病例选择：

共30例，其中男性18例，女性12例，年龄58-76岁，平均为70.2岁。所 有病例均详细询问病史，神经系统检查及颅脑CT扫描确诊，并作治疗前后血液 流变学检查。梗塞部位为单侧基底节区15例，单侧皮层或皮层下梗塞6例，双 侧病变或多发梗塞7例，大面积梗塞2例；

以上病例随机分为治疗组和对照组，各15例。

2.给药方式：

治疗组：5％葡萄糖250ml和本发明的小牛血去蛋白提取物30ml，静脉滴注， 26天；

对照组：低分子右旋糖酐500ml，静脉滴注，26天。

3.典型症状：功能缺损、病残。

4.诊断标准：

痊愈：临床症状完全消失，功能缺损减少率91-100％，病残程度为0-1级；

显效：临床症状基本消失，功能缺损减少率46-90％，病残程度为1-3级；

有效：临床症状减轻，功能缺损减少率18-45％；

无效：基本无变化或恶化，功能缺损减少率0-17％，或功能缺损增加。

5.试验结果：

治疗组和对照组的疗效比较结果见表8；

表8治疗组和对照组的疗效比较

治疗组和对照组比较具有显著差异(P＜0.01)。

6.效果判定：本发明的小牛血去蛋白提取物，有效率93.3％、痊愈率33.3％， 能有效治疗急性缺血性脑血管病，有效率和治愈率均较对照组高，疗效好，治愈 效果显著优于对照组。

试验例7临床试验提高长跑运动员运动能力

1.病例选择：

18名业余中长跑运动员均为男性，平均年龄16.2岁(15-19)，身高172.9± 5.3cm，体重58.9±6.3kg，平均训练年限为3.3年，其中4人达到国家田径二级 运动员的水平，14人达到国家田三级径运动员的水平。所有测试对象均身体健康， 无特殊病史，血压和心脏听诊均在正常范围。

2.给药方式：

采用随机平均分组、单盲交叉，重复进行2次相同的运动试验(一次使用本 发明的小牛血去蛋白提取物，另一次使用生理盐水)，两次试验间隔为2周。

3.测试指标：

在膝关节等速肌力测试中，测定120°/秒和240°/秒的膝关节伸、屈肌力的 最大力矩、总作功和耐力指数；

在跑台测试运动中，测定运动员的最大通气量、最大摄氧量和心率，各级负 荷后测血乳酸。

4.试验结果：

试验组和对照组的伸膝肌力试验结果见表9；

表9试验组和对照组的伸膝肌力试验结果(X±SD)

试验组和对照组比较具有差异(P＜0.05)。

6.效果判定：本发明的小牛血去蛋白提取物，相对于对照组，能提升运动员 的运动能力和耐力。

试验例8临床试验老年人脑血管性痴呆

1.病例选择：

老年人脑血管性痴呆20例。男性16例，女性4例。最小60岁，最大者86 岁，平均68.1岁；随机平均分为两组，治疗组1和治疗组2，每组10例。

2.给药方式：

治疗组1：使用本发明的小牛血去蛋白提取物，第1周中的第1天用400mg， 第2天用800mg，第3-6天用1200mg/天；第2、3周每周第1-5天用1200mg/天， 3周为一疗程；皆用生理盐水200ml稀释静点。

治疗组2：在第1、2、3周每周第1-5天用1200mg/天，应用生理盐水200ml 稀释静点。

3.典型症状：近记忆力减退、表情淡漠、反应迟钝、计算困难、定向力障 碍、强哭强笑、假性球麻痹、运动及感觉障碍、病理征等中枢神经损害。

4.诊断标准：

判定主要根据精神认识能力量表的检查结果，并参考其它量表检查的结果而 判定，评价方法采用打分方式。

明显显效：上升11分以上；

显效：上升6-10分；

有效：上升3-5分；

无效：上升0-2分。

5.试验结果：

老年人脑血管性痴呆治疗结果见表10，每例30分；*表示有差异，P＜0.05； **表示有显著性差异，P＜0.01。

表10老年人脑血管性痴呆治疗结果

疗前与疗后比较具有显著差异(P＜0.01)。

6.效果判定：本发明的小牛血去蛋白提取物，能有效治疗老年人脑血管性痴 呆，治愈效果显著。

试验例9临床试验糖尿病性周围神经病

1.病例选择：

选择符合WHO(1985年)糖尿病诊断标准的NIDDM性周围神经病的住院 病为60例力临床观察对象；随机按2∶1分为治疗组40例，对照组20例。

治疗组40例，男性26例，女性14例，年龄23～78岁(平均54.9±13.5岁)， 病程0.5～26年(平均9.1±7.1年)，BMI＞25有8例(20％)；

对照组20例，男性10例，女性10例，年龄33～73岁(平均58.5±9.4岁)， 病程0.5～20年(平均11.1±9.4岁)，BMI＞25有4例(20％)。

2.给药方式：

治疗组：使用本发明的小牛血去蛋白提取物水针剂50ml加入250ml氯化钠 注射液中静脉滴注，每日一次，15天为一疗程。

对照组：用VitB1 100mg和vVitB12 250μg肌肉注射，每日一次，15天为一 疗程。

3.典型症状：四肢疼痛、麻木、发凉，伴或不伴肌肉萎缩并经检查四肢神 经传导速度呈延迟、潜伏期延长，电压降低；同时除外由于大血管病变，免疫性， 外伤性及其它神经性疾病所致周围神经病变。

4.诊断标准：

痊愈：临床症状完全消失。

显效：临床症状基本消失。

有效：临床症状减轻。

无效：基本无变化。

5.统计方法：

临床结果的数据用微机的Systat软件处理，治疗前后数据进行t检验或X检 验，对疗效加以判断，两组结果数据进行t检验比较疗效。

6.试验结果：

治疗组和对照组的疗效比较结果见表11；

表11治疗组和对照组的疗效比较

治疗组和对照组比较具有显著差异(P＜0.01)。

6.效果判定：本发明的小牛血去蛋白提取物水针剂，好转率97％，能有效 治疗糖尿病性周围神经病，有效率较高，疗效好，治疗效果显著优于对照组。

试验例10临床试验脑梗塞

1.病例选择：

本组30例患者均为经CT或MRI证实为首次发病的项内动脉脑梗塞患者， 发病距开始治疗时间28小时至4天。患者随机分为爱治疗组15例，对照组15 例；两组患者平均年龄无明显差异；

治疗组15例，男8例，女7例，年龄46～80岁，平均52.43±12.13岁；

对照组15例，男9例，女6例，年龄43～74岁，平均51.35±10.65岁。

2.给药方式：

治疗组：使用本发明的小牛血去蛋白提取物水针剂1200mg+5％葡萄糖250ml 静脉滴注，每日1次，共26天。

对照组：低分子右旋糖酐500ml静脉滴注，每日1次，共26天，低分子右 旋糖酐用前做皮试。

3.典型症状：肢体发麻，运动不灵、言语不清、眩晕、视物模糊等征象。

4.诊断标准：

痊愈：功能缺损评分减少90-100％，病残程度0级。

显效：功能缺损评分减少46-89％，病残程度1-3级。

有效：功能缺损评分减少18-45％。

无效：功能缺损评分减少18％之内或增加。

5.试验结果：

治疗组和对照组治疗前后神经功能缺损变化结果见表12；

表12治疗组和对照组治疗前后神经功能缺损变化结果

治疗组和对照组比较具有显著差异(P＜0.01)；

由表12可知，用药前治疗组与对照组临床神经功能缺损评分比较无显著差 异。用药后两组评分均有下降，但治疗组下降更明显，前后相比差异有显著性 (P＜0.001)。两组间神经功能缺损积分减少值相比差异极为显著(P＜0.001)， 治疗组和对照组治疗前后血液流变学变化结果见表13；

表13治疗组和对照组治疗前后血液流变学变化结果

由表13可知，治疗组治疗后红细胞聚集指数、血浆粘度、全血粘度均显著 降低(P＜0.05)，而纤维蛋白原及红细胞压积治疗前后无显著差异。

治疗组和对照组的整体疗效比较见表14；

表14治疗组和对照组的整体疗效比较

由表14可知，治疗组的整体疗效显著优于对照组。

6.效果判定：本发明的小牛血去蛋白提取物水针剂，有效率86.7％，能有效 治疗脑梗塞，有效率和痊愈率高，疗效好，治疗效果显著优于对照组。

典型应用1：

李某，女，46岁，功能缺损、病残。多方治疗，效果均不理想。经详细询问 病史、神经系统检查及颅脑CT扫描确诊为急性缺血性脑血管病。治疗：5％葡萄 糖250ml和本发明的小牛血去蛋白提取物30ml，静脉滴注，26天，患者症状完 全消失，功能缺损减少率达91-100％，病残程度恢复为0-1级。跟踪调查发现一 年后无复发。

典型应用2：

曾某，男，70岁，记忆力减退、表情淡漠、反应迟钝、计算困难、定向力障 碍、强哭强笑、假性球麻痹、运动及感觉障碍、病理征等中枢神经损害。确诊为 老年人脑血管性痴呆。多方治疗，效果均不理想。治疗：使用本发明的小牛血去 蛋白提取物，第1周中的第1天用400mg，第2天用800mg，第3-6天用1200mg/ 天；第2、3周每周第1-5天用1200mg/天，3周为一疗程；皆用生理盐水200ml 稀释静点；一个疗程后，症状几乎消失。继续使用1个疗程，加以巩固。跟踪调 查发现一年后无复发。

典型应用3：

刘某，男，45岁，四肢疼痛、麻木、发凉，伴或不伴肌肉萎缩并经检查四肢 神经传导速度呈延迟、潜伏期延长，电压降低；同时除外由于大血管病变，免疫 性，外伤性及其它神经性疾病所致周围神经病变。经诊断为糖尿病性周围神经病。 多方治疗，效果均不理想。治疗：使用本发明的小牛血去蛋白提取物水针剂50ml 加入250ml氯化钠注射液中静脉滴注，每日一次，15天为一疗程；使用一个疗程 后，症状几乎消失。继续使用1个疗程，加以巩固。跟踪调查发现一年后无复发。

典型应用4：

曾某，女，79岁，肢体发麻，运动不灵、言语不清、眩晕、视物模糊。经诊 断为脑梗塞。多方治疗，效果均不理想。治疗：使用本发明的小牛血去蛋白提取 物水针剂1200mg+5％葡萄糖250ml静脉滴注，每日1次，共26天，症状几乎消 失。跟踪调查发现一年后无复发。