一种耐辐射曲霉及其在吸附铯137生物处理中的应用

摘要

本发明公开了一种耐辐射曲霉及其在吸附铯137生物处理中的应用。通过某地区取样，筛选、分离、筛选、生理生化鉴定获得曲霉（Aspergillussp.）F77CGMCCNo.8382，利用该菌在吸附铯生物处理中的应用，对Pb

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物菌种应用于生物吸附放射性核素技术领域，具体的，本发明涉及一种耐辐射曲霉及其在放射性核素吸附中应用的技术领域。

背景技术

城市化、工业化及人口增长造成全球性能源危机，可持续发展需求使得人类越来越依赖于新能源。核能以其极低的二氧化碳排放和巨大的发展潜力而越来越受到众多国家的重视。核能高速发展的同时，也给全球环境造成巨大的压力，使放射性污染成为当前重大的环境问题之一，特别是以切尔诺贝利和日本福岛核电站为代表的核事故向环境释放了大量的放射性污染物，造成当地及周边环境严重的放射性污染，对生态环境和人类健康造成长期巨大的潜在威胁。

作为生态系统的重要组成部分，微生物种群数量大、分布广、比表面积大、繁殖快，对环境变化的适应能力强，对放射性辐射表现出高度的耐受性。利用生物作用清除、修复和治理放射性污染具有选择性强、处理时间短、成本低，不造成二次污染和不破坏生态环境等优点，近年来已成为放射性污染治理的热点研究技术之一。

铯137(Cs¹³⁷) 是重要的裂变产物之一，也是核弹、核武器试验和核反应堆内核裂变的副产品之一，其半衰期较长，具有较高的迁移性，易通过生物链转移造成辐射危害，它会释放伽玛射线，在环境放射性污染修复中备受关注。铯137的半衰期较长达30年，会在环境或生态系统中存留、积累和迁移，造成严重的环境污染和生态危害。如果透过进食或呼吸，摄入了铯137，或受到沉降在地面上的铯137所照射，都会对身体有较持久的影响。

在治理放射性环境污染方面，传统方法是工程法、化学法。工程法是物理性地收集和隔离放射性物质的方法，化学法是采用特殊的化学品来固定和清除放射性污染。上述方法虽然已得到成功的应用，如日本的广岛和长崎两个城市、马绍尔群岛共和国的比基尼环礁核试验场和澳大利亚的马拉林加核试验场的修复与重建，但其成本很高，难以用于大面积辐射区的修复，因此，工程与化学的方法局限性很大。生物修复是利用特殊的生物富集和固定放射性污染物的方法，主要是微生物和植物，特别是微生物功能利用最受关注,因其成本低，适合于大面积修复，因而生物修复放射性污染成为当前研究的热点。

研究表明：微生物不仅可通过溶解和沉淀、生物吸附和吸收、氧化还原等作用来治理环境中的放射性核素污染,并且可以通过改变植物根际微环境 ,从而提高植物对重金属离子和放射性核素的吸收、挥发或固定的效率。相关的研究也取得了积极进展，如Jana Sitte^[1] 等研究证明放射性核素铀（U）在土壤中的迁移率受环境中微生物及环境因子的影响，Eva-Maria Burkhardt^[2]研究表明Fe(III)还原菌的增生有利于包括U在内的重金属离子由土壤向地下水迁移。 C.Hwang 和D.Moreels^[3]等的研究表明，细菌菌群可促使可溶态U（VI）向稳定的U（IV）转化，Beyenal^[4]等研究显示硫酸盐还原菌可固定U，Copplestone^[5]等分离获得可大量积累¹³⁷Cs、^238+239+240Pu等放射性核素的微生物菌株，Hu^[6]等的研究表明许多微生物都能吸附U，如Pseudomonas aeruginosa CSU、Aspergillus fumigatus 和Saccharomyces cerevisiae。Entry^[7]等研究发现施用AM菌根菌可促进行植物对¹³⁷Cs、⁹⁰Sr的积累，Oneidensis希瓦氏菌MR-1，可以有效将可溶性U⁶⁺、Cr⁶⁺和Tc⁷⁺还原为不溶性U⁵⁺、Cr³⁺和Tc⁴⁺。

利用微生物修复放射性环境污染已经有成功的例子，Groudev^[8]在2001年利用土著微生物对保加利亚南部含有放射性元素铀、镭和钍同重金属铜、镉和铅污染土壤,进行原位修复，经过8个月的时间，污染物的水平下降到人体安全范围。

利用微生物修复放射性的污染环境必须考虑到以下两个方面:第一，必须是强耐辐射的微生物;第二，微生物修复环境时不能威胁到公共安全，也不能产生二次污染。由于大多数的细菌对放射性比较敏感，因此它们修复放射性污染环境的能力会受到较大的限制。因此，需要从自然环境中去分离具有辐射抗性的微生物，或者通过基因工程技术来改造一些微生物使之获得辐射抗性。目前尚无有关耐辐射曲霉及其在放射性核素吸附中应用的报导。

发明内容

针对目前国内外尚无关于耐辐射曲霉及其在放射性核素吸附中应用的相关报道，特别是没有耐辐射曲霉在铯生物处理中的应用相关报道。本发明目的旨在于提供一种耐辐射曲霉及其在吸附Cs¹³⁷生物处理中的应用，特别是本发明提供一种利用耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382在吸附铯生物处理中的应用。

本发明采用的主要技术方案：

本发明从新疆巴音郭楞蒙古自治州地区污染环境中取样，以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出一株编号为F77的菌株，经过微生物菌种的生理生化特性、菌落形态、菌种的分子水平等系列试验验证确定，该菌种是一种耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，获得保藏号为CGMCC No. 8382，利用该菌种在放射性铯生物处理中应用，通过试验证明该菌种耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382对于Ni⁺，Cr^2+，、Zn²⁺、Co²⁺、 Pb²⁺、Hg²⁺六种离子均具有耐受特性，其中对Pb²⁺、Zn ²⁺_，Ni⁺的耐受浓度最大，分别可达1000 mg/L和500 mg/L，500 mg/L；对Co²⁺， Cr²⁺， Hg²⁺的耐受性次之，都可达200 mg/L；特别是在放射性核素铯吸附中应用获得显著明显的技术效果，从而证明了该菌种在吸附铯生物处理中具有良好的的应用前景。

本发明具体提供一种利用曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382。本发明所使用的曲霉（Aspergillus sp.）由新疆农业科学院微生物应用研究所从新疆巴音郭楞蒙古自治州地区某地放射性污染土壤中取样分离，以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出一株编号为F77的菌株于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101, 保藏日期是2013年10月22日，保藏号是CGMCC No.8382；该菌株培养温度28-30℃，最适培养温度28℃左右；该菌种生长于PDA培养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水IL，pH自然，经28℃、48h培养， 将菌种F77通过插片和水压片的镜检观察，该菌株初生菌丝白色，呈疏松绒毛状，分隔，菌落表面粽叶绿色。孢子梗和孢子同色，孢子近圆形，成串着生在膨大的孢子梗顶端周围，呈放射状分布，无分生小梗。根据以上形态特征，初步鉴定该菌株为半知菌纲丛梗孢目丛梗孢科单梗曲霉属的一个种。参照《真菌鉴定手册》进行鉴定，结合对F77菌株进行形态学，生理生化鉴定，命名为耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）。

该菌株曲霉（Aspergillus sp.）F77在PDA培养基，Wort培养基生长良好，经Biolog  FF鉴定板试验证明F77可以利用吐温80，N-乙酰基-?-D-葡萄糖胺，核糖醇，L-阿拉伯糖，D-阿拉伯醇，熊果苷，D-纤维二糖，  D-木糖，苹果酸，糊精  ，赤藻糖醇，D-葡萄糖酸，a-D-葡萄糖，D-甘露醇，?-甲基-D-葡萄糖苷，6-O-D-吡喃葡萄糖酰，D-呋喃果糖，D-葡萄醛酸，丙三醇，肝糖，麦芽三糖，奎尼酸，L-谷氨酸，腺苷-5一磷酸盐，a-D-葡萄糖-1-磷本盐，D-核糖，水杨苷，D-山梨醇，L-山梨糖，水苏糖，K-海藻糖，松二糖，木糖醇，y-氨基丁酸，溴代琥珀酸，反丁烯二酸，?-羟基丁酸，y-羟基丁酸，P-羟苯乙酸，a-酮戊二酸，D-苹果酸，D-葡萄糖二酸，癸二酸，  琥珀酸，琥珀酸甲基酯，L-丙胺酸酰胺，L-丙胺酸，L-丙胺酰氨基乙酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，甘氨酰-L-谷氨酸，L-苯基柄氨酸，脯氨酸，焦谷氨酸，  L-丝氨酸，L-苏胺酸，2-氨基乙醇，腐苷，腺苷。

本发明通过总DNA的提取、ITS1基因的PCR扩增和测序，根据测序结果，用Blast搜索软件从GenBank、EMBL等数据库中调出相似性较高的相关菌株的ITS1基因序列，用CLUSTAL X 进行多序列比对，并采用 Saitou和Nei 的邻接法（Neighbor Joining）用MEGA 5.0软件进行系统进化树的构建和同源性比较。经测定，耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382的ITS1基因序列为600bp。

通过上述结果及ITS1基因同源分析、系统发育分析结果，将纯化的菌株耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382进行系统进化树的构建及多样性分析，菌种编号为F77与Aspergillus flavus strain PT18同源性最高，但两者还存在明显的差异，显示不同属性的菌种，本发明将菌种编号为F77菌株鉴定为曲霉（Aspergillus sp.）。

同时，本发明具体提供一种利用耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382进行放射性铯生物处理中应用技术方案:分别在含有10mg/L的稳定铯离子的PDA培养基中加入1ml（6772.95 贝克）放射性铯母液，和2ml（13545.9贝克）放射性铯母液，接种F77，培养至最适的生长时间，收集样品。分别通过ICP-MS和液闪测定菌株在生长过程中对稳定性铯和放射性铯的吸附。通过试验表明，菌种F77对于放射性铯存在下，对稳定的铯的吸附率明显下降，只有19.3%，而在一倍放射性铯和两倍放射性铯存在下，对稳定性铯吸附率差异不大，对于放射性铯的吸附率差异也不大，都达40%以上。 

本发明所用的菌株曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382对其中对Pb²⁺、Zn ²⁺，Ni⁺的耐受浓度最大，分别可达1000 mg/L和500 mg/L，500 mg/L；对Co²⁺ Cr²⁺，Hg²⁺的耐受性次之，都可达200 mg/L；在放射性核素铯吸附中应用获得显著明显的技术效果，从而证明了该菌种在吸附铯生物处理中具有良好的的应用前景。

本发明进而提供耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382的分离和培养方法。

1. 分离培养基采用：PDA培养基。

2. 分离和筛选条件：采取梯度稀释法，称取10g土壤样品于90mL无菌生理盐水中，30°C活化30min后进行梯度稀释，选取10^-2、10^-3、10^-4稀释液分别涂布于分离培养基淀粉PDA培养基平板，每个处理3个重复，置30°C培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。

经培养筛选确定的耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382在PDA培养基上菌株菌丝疏松绒毛状，分隔，菌落表面粽叶绿色。可以利用吐温80，N-乙酰基-?-D-葡萄糖胺，核糖醇，L-阿拉伯糖，D-阿拉伯醇，熊果苷，D-纤维二糖，  D-木糖，苹果酸，糊精，赤藻糖醇，D-葡萄糖酸，a-D-葡萄糖，D-甘露醇，?-甲基-D-葡萄糖苷，6-O-D-吡喃葡萄糖酰，D-呋喃果糖，D-葡萄醛酸，丙三醇，肝糖，麦芽三糖，奎尼酸，L-谷氨酸，腺苷-5’一磷酸盐，a-D-葡萄糖-1-磷本盐，D-核糖，水杨苷  D-山梨醇，L-山梨糖，水苏糖，K-海藻糖，松二糖，木糖醇    ，y-氨基丁酸，溴代琥珀酸   ，反丁烯二酸，?-羟基丁酸，y-羟基丁酸，P-羟苯乙酸   a-酮戊二酸，D-苹果酸，D-葡萄糖二酸，癸二酸，琥珀酸，琥珀酸甲基酯，L-丙胺酸酰胺，L-丙胺酸，L-丙胺酰氨基乙酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，甘氨酰-L-谷氨酸，L-苯基柄氨酸 脯氨酸，焦谷氨酸，L-丝氨酸，L-苏胺酸，2-氨基乙醇，腐苷，腺苷。

通过实施本发明具体的技术方案，实现本发明内容达到以下有益效果：

本发明提供的耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382及其在铯离子吸附中的应用，Ni⁺，Cr²⁺，、Zn²⁺、Co²⁺、 Pb²⁺、Hg²⁺六种离子均具有耐受特性，其中对Pb²⁺、Zn ²⁺，Ni⁺的耐受浓度最大，分别可达1000 mg/L和500 mg/L，500 mg/L；对Co²⁺， Cr²⁺， Hg²⁺的耐受性次之，都可达200 mg/L通过本法可以利用菌体的生长吸附铯离子，和放射性铯，也可以直接使用干菌体吸附，最大吸附能力可达44.5mg/g干菌体。

附图说明

图1所示为曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382的菌落形态水压片图。

图2所示为曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382系统发育树状图。

图3曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382对酸度的耐受性图。

图4曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382吸附时间对铯吸附行为的影响图。

图5曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382铯初始浓度对吸附效果的影响图。

图6曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382吸附等温式拟合曲线图。

图7 钾对曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382生长和吸附铯的影响图。

图8曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382pH对吸附效果的影响图。

图9 不同菌体量对曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382吸附铯离子的影响图。

图10吸附时间对于对曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382吸附铯离子的影响图。

图11 温度对曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382菌体对铯离子吸附的影响图。

图12曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382对稳定铯和放射性铯的吸附率图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，当然，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明要求保护的范围。

本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备：

培养基选用：PDA培养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水IL，pH自然。

主要仪器与试剂：MSSPX-250型生化培养箱，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，SW-CJ-1F B型单人双面净化工作台，E360K离心机，恒温摇床HWY-100。PCR仪 Eppendorf No:5345，电泳仪Bio-Rad Mode 200/2.0，凝胶成像仪United-Bio,GK-330C plus，PCR预混液(TaKaRa Biotechnology)，其余试剂均为分析纯。超声波破碎仪为美国Sonics，VC 130。XseriesⅡ型电感耦合等离子体质谱（ICP-MS），美国THERMO公司；Seven Easy Plus S20P型精密pH计，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DHG-924OA型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；THZ-82气浴恒温振荡箱，江苏金坛诚辉仪器厂；GMSX-280压力蒸汽灭菌器，北京永光明医疗仪器有限公司。试剂均为分析纯，水为超纯水，18.2 MΩ·cm。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：曲霉（Aspergillus sp.）F77CGMCC No. 8382的分离、培养

1. 分离：本发明所使用的耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77由新疆农业科学院微生物应用研究所从新疆巴音郭楞蒙古自治州地区某地放射性污染土壤中取样分离，利用传统的平板培养法分离出土层中的微生物，平板划线法纯化菌株，以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出一株编号为F77的菌株。

分离步骤：依据梯度稀释法，称取10g土壤样品于90mL无菌生理盐水中，30°C于恒温振荡箱活化30min后进行梯度稀释，选取10^-2、10^-3、10^-4稀释液分别涂布于PDA培养基的平板，每个处理3个重复，置30°C培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于新的分离培养基PDA培养基，直至无杂菌落。将纯化后的菌株一部分采用冻干安瓿管、甘油管和液氮等方式保藏，一部分保存于4°C直接用于后续研究。

2. 培养条件：将纯化的菌株接种到马铃薯固体培养基斜面上，于30℃培养6天，放入4℃冰箱中保存备用。

具体的：该菌株培养温度28-30℃，最适培养温度30℃左右；该菌种生长于PDA培养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水IL，pH自然，经30℃、48h培养。

本发明所使用的耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101,保藏日期为2013年10月22日，菌种保藏号为CGMCC No.8382，该菌株培养温度28-30℃，最适培养温度30℃左右；该菌种生长于PDA培养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水IL，pH自然，经30℃、48h培养。菌种F77通过插片和水压片的镜检观察，该菌株初生菌丝白色，疏松绒毛状。孢子堆粽叶绿色，孢子近圆形，成串着生在膨大的孢子梗顶端四周，成放射状分布，无分生小梗。参见附图1。根据以上形态特征，初步鉴定该菌株为半知菌纲丛梗孢目丛梗孢科单梗曲霉属的一个种。参照《真菌鉴定手册》进行鉴定，结合对F77菌株进行形态学，生理生化鉴定，命名为曲霉（Aspergillus sp.）。

该菌株曲霉（Aspergillus sp.）F77在PDA培养基，Wort培养基生长良好，经Biolog  FF鉴定板试验证明F77可以利用吐温80，N-乙酰基-?-D-葡萄糖胺，核糖醇，L-阿拉伯糖，D-阿拉伯醇，熊果苷，D-纤维二糖，  D-木糖，苹果酸，糊精，赤藻糖醇，D-葡萄糖酸，a-D-葡萄糖，D-甘露醇，?-甲基-D-葡萄糖苷，6-O-D-吡喃葡萄糖酰，D-呋喃果糖，D-葡萄醛酸，丙三醇，肝糖，麦芽三糖，奎尼酸， L-谷氨酸，腺苷-5ˊ一磷酸盐， a-D-葡萄糖-1-磷本盐，D-核糖，水杨苷，D-山梨醇，L-山梨糖，水苏糖，K-海藻糖，松二糖，木糖醇，y-氨基丁酸， 溴代琥珀酸，反丁烯二酸，?-羟基丁酸，  y-羟基丁酸，P-羟苯乙酸，a-酮戊二酸，D-苹果酸，D-葡萄糖二酸，癸二酸， 琥珀酸  ，琥珀酸甲基酯， L-丙胺酸酰胺，   L-丙胺酸，L-丙胺酰氨基乙酸，L-天冬酰胺， L-天冬氨酸，甘氨酰-L-谷氨酸，L-苯基柄氨酸，脯氨酸，焦谷氨酸，L-丝氨酸，L-苏胺酸， 2-氨基乙醇，腐苷，腺苷。结果见表1。

表1：温度、pH等因素对菌株F77生长的影响

温度（℃）41525303235生长情况-++++++++++++温度（℃）384550   生长情况++--   pH123456生长情况--++++++pH78910  生长情况++++--  NaCl浓度0％1％2％3％4％5％生长情况+++++++++++++NaCl浓度6％7％8％9％10％ 生长情况----- 氨苄青霉素μg/ml5060708090100生长情况------

3．菌种描述：本发明所述的耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382在PDA培养基培养5d后，通过插片和水压片的镜检观察，该菌株菌丝疏松绒毛状，分隔，菌落表面呈粽叶绿色，孢子梗和孢子同色，孢子近圆形，成串着生在膨大的孢子梗顶端周围，呈放射状分布，无分生小梗。耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382菌落形态图参见附图1。

实施例二：曲霉（Aspergillus sp.）F77CGMCC No. 8382分子水平鉴定

1. DNA提取：真菌提取方法如下： 

（1）200 mg菌体， 液氮研磨， 加入3 ml 3% CTAB提取缓冲液； 65℃水浴45 min， 4℃4000 r/min离心20 min。

（2）取上清转到离心管中， 加入4 μl 10 mg/ml蛋白酶， 37℃，水浴1 h。 

（3）加入800 μl Tris饱和酚， 摇匀， 13000 r/min离心10min； 取上清。

（4）加入等体积的氯仿/异戊醇， 摇匀，13000 r/min离心10 min； 取上清。

（5）加10 mg/ml的RNA酶， 37 ℃水浴过夜处理。

（6）加入800 μl氯仿/异戊醇， 摇匀， 13000 r/min离心10 min； 取上清。

（7）加600 μl异戊醇， -20℃沉淀30 min， 收集沉淀， 75%酒精，冲洗， 超净台真空干燥。

（8） 100 μl TE 溶解DNA， -20 ℃保存备用。加入1 μl的RNA酶， 37 ℃水浴1 h； 加入400 μl氯仿/异戊醇 （24∶1）， 12000 r/min离心10 min， 重复2次。

2. ITS1基因基因扩增及测序，用真菌 ITS1基因基因通用引物进行扩增：

引物ITS11：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' 

ITS14： 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 

PCR 扩增反应体系为50 μL，反应条件为：95°C，5 min；95°C，45 S，57°C， 30 S，72°C，90S，30Cycles； 72°C，7min。扩增产物(约 600 bp)，PCR扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增产物进行测序，将菌株F77 的ITS1基因序列进行测定，经测定，曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382 ITS1基因序列为600bp，参见附后提供的基因序列表SEQUENCE LISTING。

3. ITS1 序列比对及系统发育分析

本发明通过总DNA的提取、ITS1基因基因的PCR扩增和测序。根据测序结果，用Blast搜索软件从GenBank、EMBL等数据库中调出相似性较高的相关放线菌菌株的ITS1基因基因序列，用CLUSTAL X 进行多序列比对，并采用 Saitou和Nei 的邻接法（Neighbor Joining）用MEGA 5.0软件进行系统进化树的构建。结果参见附图2所示，从树状图中可以看出，该菌株与Aspergillus flavus strain PT18在同一分支，表明二者的亲缘关系最近，比对结果表明，F77与黄曲霉菌（Aspergillus flavus PT18）同源性最高，依据微生物分类方法，将菌种编号为F77菌株初步鉴定为曲霉（Aspergillus sp.）。

基于ITS1基因 序列扩增和PCR 产物测序，获得600bp 序列，经GenBank \ Blast 同源序列比对分析，其与现有技术所报道的黄曲霉(Aspergillus) 同源性较高；从GenBank 中获取标准菌株ITS1基因序列，进行同源进化分析，构建系统进化树，结果参见附图2；结果显示，F77 菌株隶属于曲霉属，与黄曲霉菌（Aspergillus flavus PT18）亲源关系最近，但两者还存在明显的差异，显示不同属性的菌种，确定菌株F77为耐辐射曲霉菌株，本发明命名为曲霉（Aspergillus sp.）。

实施例三：曲霉（Aspergillus sp.）F77CGMCC No. 8382的抗辐射能力

微生物治理环境放射性污染需满足两个条件，即在辐射环境中能够生存并对污染核素具有较高的吸附选择性。所用真菌曲霉F77是放射性核素污染土壤中提取，斜面培养后，经⁶⁰Co放射源γ射线辐照，辐照剂量累积为10 kGy。通过辐照样品和非辐照样品培养比对，发现其生长不受辐照的影响，即曲霉F77具有很强的抗辐射能力。F77的辐射特性（γ辐射）以Ferreira 等^[9]已建立的方法做了验证。菌在PDA液体培养基培养至稳定期，4℃离心后以生理盐水洗涤后，以生理盐水里悬浮浓度控制在 1×10⁷–10⁸ c.f.u/ ml,分为每份2ml，在⁶⁰Co 下以 0.167 kGy/ min的剂量率在室温下进行照射。照射剂量以 2.0 kGy 的幅度从0Gy升到10.0 kGy。照射过的样品经稀释后涂布至PDA 平板上在30℃培养3-5天后看是否有存活，以检测F77对于γ辐射的耐受特性。试验表明本发明提供的曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382经10 kGy的辐照剂量照射能正常生长，具有较强的耐辐射性。

实施例四：曲霉（Aspergillus sp.）F77CGMCC No. 8382对酸的耐受性

微生物的生命活动、物质代谢与酸有密切关系，不同微生物生长过程对环境的要求不一。生长环境决定微生物的生物量，从而影响其对金属离子的吸附。酸性溶液中，金属元素多以离子形式存在，利于其被生物吸附和吸收。为此，考察了曲霉F77对酸的耐受性。在温度为30℃、培养时间为70 h条件下，曲霉F77生物量（干菌体质量）与培养基溶液pH的关系可参见附图3中。

由附图3可见，曲霉F77生物量随培养基溶液pH的增大而增加，pH<2.5时，干菌质量均在0.6 g以下，说明酸抑制了曲霉F77的生长。pH 4.5时，生物量达到最大值，对应的干菌质量为1.02 g。当pH>4.5后，生物量不再增加。一些研究者认为，微生物的生命活动、物质代谢与酸有密切关系，适量的酸利于微生物的生长，过高或过低的酸对微生物生长是不利的。

主要表现在：(1)溶液中的过多的氢离子可能改变微生物表面的电荷性质，影响其对营养物质的吸收；(2)酸除直接影响微生物细胞外，还可影响培养基中某些物质的离子化作用，从而间接影响微生物，(3)酶只有在最合适的酸度下才能发挥其最大活性，酸度的变化可使酶的活性降低，进而影响微生物细胞内的生物化学过程。

由此可见，曲霉F77的生物量随着pH值增大而增加。pH<2.5时，曲霉F77的生长明显受到抑制；pH>4.5时，其氢离子减少对微生物的生长几乎没有什么影响；在pH=4.5时，干菌的质量达到最大值1.02 g。

实施例五：曲霉（Aspergillus sp.）F77CGMCC No. 8382对稳定的铯离子的吸附动力学研究

1.曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382吸附实验方法

曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382吸附实验采取以下过程：移取100 mL PDA培养基溶液于500 mL锥形瓶中，根据实验需要定量加入铯离子溶液，接种适量F77菌种悬浊液(20 mL无菌水与斜面上的菌种均匀混合)， 180 rpm，30℃震荡培养至实验所需时间。培养后溶液离心，上清液用ICP-MS测定铯离子浓度，所得菌体在60℃条件下烘至恒重，用于计算生物量。

单位吸附量和吸附率的计算方法：

用单位吸附量（qe）和吸附率（R）表征微生物对铯的吸附情况，计算方法分别示于式（1）、（2）中。

 

q_e=(C₀-C_t)×V÷m          (1)

R=（C₀-C_t）÷C₀×100%       (2)

其中，C0为溶液中铯的初始浓度，mg/L；Ct为吸附t时间后溶液中铯的浓度，mg/L；V为吸附溶液体积，L；m为曲霉F77的干菌质量，g。

2. 曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382吸附动力学研究

在吸附温度为30℃、pH 6.5，铯离子浓度为10 mg/L的条件下，吸附率随着时间而急速增长，在70 h左右达到吸附平衡，吸附率在70%左右，此后吸附率随时间变化不大参见附图4。这主要是由于随着微生物对铯离子吸附增加，细胞表面对铯离子的吸附逐渐达到饱和，细胞壁上对其产生的斥力增强，造成金属离子进一步进入到细胞表面的阻力增大，而后达到相对平衡阶段。随着培养时间的延长，微生物对铯的吸附率略有降低，表明随着营养物质消耗殆尽，菌体开始死亡，甚至出现自溶现象，打破固液吸附平衡，造成菌体吸附率下降。

采用假二级动力学方程：模拟曲霉F77的吸附动力学，表示如下：

t÷q_t=1÷(kq²_e)+1÷q_e×t        (5)

其中：t为振荡时间，h；qt为t时刻曲霉F77对铯的吸附量，mg/g；k为假二级反应速率常数，g﹒mg^-1﹒h^-1；qe为平衡时曲霉F77对铯的吸附量，mg/g。以t/qe对t作图得一直线，参见附图4中小图所示，由直线的斜率和截距求得k=0.091 g﹒mg^-1﹒h^-1，qe=0.943 mg/g，相关系数R2=0.991，说明曲霉F77对铯的吸附符合假二级动力学模型。。

可见，曲霉F77成长速度很快，经过70 h后停止生长并对铯离子吸附达到平衡，约200 h后微生物出现自溶现象，造成铯吸附率下降。

实施例六：铯离子初始浓度对曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382吸附的影响

在吸附温度为30℃、pH 6.5、培养时间为70 h的条件下，将曲霉F77接种于含不同浓度铯离子（0.1、1.0、10.0、100、200、500 mg/L）培养液中，吸附量随铯离子浓度变化参见附图5所示。

随着铯离子浓度的升高，曲霉F77对铯的吸附量也逐渐增大，在所测试铯离子浓度范围内，单位吸附量与铯离子浓度正相关，在铯浓度为500 mg/L时，曲霉F77对铯的单位吸附量为30 mg/g，但未达到最大吸附量，说明曲霉F77对铯离子有较强的吸附作用。菌体微小，其比表面积大，增大溶液中金属离子的浓度，增加了金属离子与菌体间的碰撞几率，有助于菌体对铯的吸附。此外，随着溶液中金属离子浓度的增大，固液两相之间的传质阻力被克服，提高了金属离子与菌体之间的碰撞几率，利于菌体对金属离子的吸附。

在实验铯离子浓度范围内，曲霉F77对铯的吸附率均在60%以上，表明曲霉F77对铯有较强的吸附能力。多数情况下，微生物对放射性核素的吸附过程符合Freundlich等温吸附公式，用Freundlich方程对实验数据进行拟合：

     Q_e=K_FC_e^1/n                    (3)

两边取对数得：

 1gq_e=1gK_F+1÷n×1gC_e          (4)

其中，KF为Freundlich吸附系数；qe为平衡吸附容量，mg/g；Ce为吸附平衡质量浓度，mg/L。将lgqe对lgCe作图，示于附图6中，得到相关系数R2为0.998的直线，说明曲霉F77对铯的吸附过程可以用Freundlich等温吸附方程很好地描述，由截距计算得到KF=0.25。

可见，曲霉F77对铯有较高的吸附率，在研究铯初始浓度范围内，曲霉F77对铯的吸附率大于60%，吸附量在铯浓度为500 mg/L时达到30 mg/g，其吸附行为更符合Freundlich方程，其KF=0.25。

实施例七：钾离子对曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382吸附的影响

环境介质中共存离子是影响微生物对目标离子吸附的重要因素之一。钾广泛存在于各种环境介质中，同时也是微生物生长的必需元素，对微生物的生长有较大影响。由于钾与铯同属碱金属元素，具有相似的理化性质，这样钾与铯之间必然存在吸附吸收竞争关系。在吸附温度为30℃、pH 6.5、铯离子浓度为10 mg/L、培养时间为70 h的条件下，考察了溶液中不同浓度钾（5 mg/L~20000 mg/L）对曲霉F77生长和吸附铯的影响，结果参见附图7。

由参见附图7所示，随着溶液中钾离子浓度的增大，曲霉F77的生物量也不断增加，当钾的浓度为10000 mg/L时，生物量（干重）达到最高1.411 g。随着钾浓度的增大，铯的吸附量明显下降。当溶液中的钾浓度大于5000 mg/L后，铯的吸收率仅为15%左右，但不再降低。这是因为随着铯和钾的竞争交换达到平衡，铯的吸收率趋于平缓。 

可见，钾离子有利于曲霉F77的生长，当钾离子的浓度为10000 mg/L时，生物量（干重）达到最高1.411 g。但当钾离子浓度超过铯浓度约30倍时，曲霉F77对铯的吸附率明显降低。在钾离子浓度大于5000 mg/L时，曲霉F77对铯的吸附率只有15%左右。参见附图7

实施例八：影响曲霉（Aspergillus sp.）F77CGMCC No. 8382吸附因素研究

采用的培养基：PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，pH自然。制作Cs⁺浓度分别20mg/L PDA培养基，并留取一部分未接菌种的初始培养基作对照样，以测得培养基中Cs⁺真实值。

从斜面上挑取菌体制成菌悬液，往上述含有不同浓度Cs⁺的PDA培养基中分别接种实验菌株孢子悬液，180rpm，培养温度为30℃，摇床培养培养72h后，1号滤纸过滤培养液，分离菌体和滤液，分别经电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测样，计算菌株吸附Cs⁺能力。影响吸附因素研究试验如下：

1.pH对吸附的影响：溶液酸度是影响曲霉F77吸附的主要因素之一。体系中大量存在的氢离子，改变微生物表面性质，影响对金属离子的吸附。为此，考察了体系酸度对曲霉F77吸附铯的影响。在温度为30℃、铯浓度为10 mg/L、培养时间为70 h的条件下，不同pH培养基溶液中曲霉F77对铯的吸附情况可参见附图8中。

曲霉F77对铯的吸附与溶液pH值呈正相关，吸附率随溶液pH升高而迅速地增大。在2<pH<3.5时，铯几乎不被吸附。一般认为，氢离子与金属阳离子间存在竞争吸附作用^[10]。溶液中的氢离子占据了曲霉F77表面的功能性吸附基团（如羟基、氨基、羧基等），影响微生物对铯的吸附。pH>3.5时，铯的吸附率迅速增大，这和曲霉F77生长趋势相一致，说明随着菌株生长量得增加，曲霉F77表面吸附位点急剧增加，增多了铯与吸附基团的相互作用。而pH>5后，吸附率约70%后增长趋于平缓。说明随着溶液pH升高，曲霉F77表面的吸附位点逐渐饱和，因而吸附率不再增大。为获得最佳的吸附效果，后续吸附实验均在pH 5以上的溶液中进行。

由此可见，氢离子是铯离子重要的吸附抑制剂，在2.0<pH<3.5时，铯几乎没有被吸附，在pH>5.0的弱酸性体系中，曲霉F77对铯的吸附率达到70%。

2. 菌体量对于吸附的影响：为了确定筛选出的菌株对铯离子的吸附是边生长边吸附还是生长后的菌体吸附，做了菌体吸附实验，通过PDA培养基大量培养收集菌体。首先进行了菌体质量对于吸附的影响。

分别称取不同质量的菌体（0.1g，0.2 g，0.5 g，0.8 g，1 g，1.2 g，1.5 g）分别置于15ml铯离子浓度为20mg/l的溶液体系内，吸附过夜，取样经ICP-MS测定，结果表明：菌体的吸附率，均小于生长吸附率，确定了筛选出的菌株对铯的吸附的吸附方式是边生长边吸附。随着菌体量增加，吸附率也缓慢增加，当达到一定量时，吸附率不再有变化，即达到平衡。随着菌体量的增加，在固定金属离子浓度状态下，单位菌体的吸附量是降低的。参见附图9。

3. 吸附时间对于菌体吸附的影响：称取0.5g菌体，分别震荡悬浮于铯离子浓度为20mg/l的10ml溶液体系内，间隔1h取样。样品经ICP-MS测定，结果表明菌体吸附率远远低于生长吸附，随着时间的增加吸附率并没有显著增加，只是在一定的值范围上下波动，菌体吸附很可能是个瞬间过程，参见附图10。

4.温度对于菌体吸附的影响：称取0.5g菌体，震荡悬浮于铯（锶）离子浓度为20mg/l的10ml溶液体系内，分别置于10℃-90℃水浴中，吸附1h取样。样品经ICP-MS测定。

对于F77菌株，随着温度的上升吸附率反而下降，证明温度对于F77菌体吸附铯离子有显著地影响。参见附图11。

实施例九：曲霉（Aspergillus sp.）F77CGMCC No. 8382耐重金属特性

将本发明菌株曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382接种于装有5mlPDA液体培养基的种子试管中，于30℃培养，200rpm振荡培养36h后，按2%接种量接种于分别含有不同浓度的Ni⁺，Cr²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、 Pb²⁺、Hg²⁺ PDA液体发酵瓶中，装添量为500ml三角瓶装100ml PDA液体培养基，于 30℃培养，220rpm振荡培养72h，观察菌种的生长情况；可以得出菌株曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC No. 8382对Ni⁺，Cr²⁺，、Zn²⁺、Co²⁺、 Pb²⁺、Hg²⁺六种离子均具有耐受特性，其中对Pb²⁺、Zn ²⁺，Ni⁺的耐受浓度最大，分别可达1000 mg/L和500 mg/L，500 mg/L；对Co²⁺， Cr²⁺， Hg²⁺的耐受性次之，都可达200 mg/L；PDA培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，pH自然）。经28℃、48h培养。， 

实施例十：曲霉（Aspergillus sp.）F77CGMCC No. 8382对稳定銫离子与放射性铯吸附试验

为测定F77对于放射性铯和稳定性铯的吸附是否有差异，设计了以下实验方案，分别在含有10mg/L的稳定铯离子的PDA培养基中加入1ml（6772.95 贝克）放射性铯母液，和2ml（13545.9贝克）放射性铯母液，接种F77，培养至最适的生长时间，收集样品。分别通过ICP-MS和液闪测定菌株在生长过程中对稳定性铯和放射性铯的吸附。

表2：菌株对放射性铯-生长吸附试验设计

由附图12所示，菌种F77在放射性铯存在下，对稳定的铯的吸附率明显下降，而在一倍放射性铯和两倍放射性铯存在下，对稳定性铯吸附率差异不大，对于放射性铯的吸附率差异也不大。 

综上所述，通过上述系列实验验证，通过本发明利用耐辐射曲霉（Aspergillus sp.）F77 CGMCC NO.8382菌体的生长吸附铯离子，和放射性铯，也可以直接使用干菌体吸附，最大吸附能力可达44.5mg/g干菌体。

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                                        SEQUENCE LISTING

<110>  新疆农业科学院微生物应用研究所

<120>  一种耐辐射曲霉及其在吸附铯137生物处理中的应用

<130>  一种耐辐射曲霉及其在吸附铯137生物处理中的应用

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  600

<212>  DNA

<213>  Aspergillus sp.F77 CGMCC No. 8382

<220>

<221>  ITS1

<222>  (1)..(600)

<400>  1

cttcccgtaa agggtacctg cggaaggatc attaccgagt gtagggttcc tagcgagccc     60

aacctcccac ccgtgtttac tgtaccttag ttgcttcggc gggcccgcca ttcgtggccg    120

ccgggggctc tcagccccgg gcccgcgccc gccggagaca ccacgaactc tgtctgatct    180

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ttgtcacccg ctctgtaggc ccggccggcg cttgccgaac gcaaatcaat cttttccagg    540

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