一种利用过敏原表位单克隆抗体评估食物致敏性的方法

摘要

一种利用过敏原表位单克隆抗体评估食物致敏性的方法，按以下步骤：（1）用常规方法获得过敏原蛋白抗体和分别针对各致敏表位的单克隆抗体；（2）用过敏原蛋白抗体包被酶标板，封闭后加入待检测样品，再加入针对各致敏表位的单克隆抗体，测得各致敏表位的数量；（3）计算致敏性强度；（4）采用与待检测样本来源相近、致敏性得到公认的食物/蛋白样品在相同条件下处理，获得参照，与对照样品对比，即可判断待检测样本的致敏性。本发明通过制备过敏原蛋白的抗体，实现食品及其过敏原蛋白的致敏性评估，摆脱了致敏性评估对过敏患者血清的依赖，也有利于实现评估的标准化。

说明书

技术领域

本发明属于食品技术领域，涉及一种食物过敏的安全性检测方法。

背景技术

食物过敏作为世界各地普遍存在的一个食品安全问题，其发病率在不断增长，引起了人们的广泛关注。以花生为例，花生及其制品是FAO/WHO认定的八大类食物过敏食品之一。近二十年来，花生过敏症的发病率呈明显上升趋势，1而且花生过敏患者的症状一般比较严重，由花生引起的食物过敏反应中有20%可能是致命性的，这些严重制约了花生在食品工业中的应用。

目前对食物过敏原的检测严重依赖生物学样本，包括抗抗血清，抗体等，对食物致敏性的评估则完全依赖于抗血清和动物（人体）实验。受到生物学样本数量和一致性的约束，对食物致敏性的定量评价难以实现标准化。相对于血清样品，单克隆抗体的制备技术已经成熟，能够实现批量化生产。

蛋白质的功能是由其结构决定的，这提示我们结构检测的结果可用于评价蛋白功能。作为食物过敏原的蛋白，其致敏功能主要是由过敏原表位的结构来实现。过敏原表位，包括线性表位和构象性表位，是食物过敏反应发生的物质基础，过敏原表位存在及数量直接影响蛋白致敏性的强弱。截止目前，已经有很多过敏原蛋白的结构及过敏原表位都被揭示。这些线性表位的确定为利用结构分析起致敏性提供了方向。通过基于单克隆抗体的ELISA可以测定过敏原蛋白致敏表位数量，再根据各表位激发致敏反应的强弱，推断整个食物样品致敏性的强弱，评估食品安全风险的高低。过敏原蛋白各表位的致敏能力可以通过其刺激导致的过敏反应强弱得出，这一能力的强弱可以用敏原蛋白致敏表位的致敏强度系数k来表征。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用过敏原表位单克隆抗体评估食物致敏性的方法，是一种不依赖血清学样本的食物致敏性评估方法，即利用针对过敏原表位的单克隆抗体分析食物中过敏原蛋白线性表位的数量和活性，并据此判断食物的致敏性强弱。

本发明是通过以下步骤实现的。

1、用常规方法获得过敏原蛋白抗体和分别针对各致敏表位的单克隆抗体。

2、用双抗夹心法分别测定样品中所含致敏表位的数量。具体步骤为，首先用过敏原蛋白抗体包被酶标板，封闭后加入待检测样品，再加入针对各致敏表位的单克隆抗体。再经显色反应后可以测得各致敏表位的数量。

3、计算致敏性强度A=k₁C₁+ k₂C₂+ k₃C₃+ k₄C₄+ …+ k_iC_i，其中k_i为过敏原蛋白致敏表位i的致敏强度系数，C_i为过敏原蛋白致敏表位i的数量。

4、采用与待检测样本来源相近、致敏性得到公认的食物/蛋白样品在相同条件下处理，获得其A值作为参照，与对照样品对比，即可判断待检测样本的致敏性。

本发明通过制备过敏原蛋白的抗体，实现食品及其过敏原蛋白的致敏性评估，摆脱了致敏性评估对过敏患者血清的依赖，也有利于实现评估的标准化。

具体实施方式

实施例1：热加工后花生过敏原蛋白Ara h 2的致敏性评估。

将纯化的花生Ara h 2样品置于沸水中，热处理10分钟，而后利用过敏原表位存在评估食物致敏性检测其致敏性。具体的实施过程包括如下步骤。

1、按照常规方法制备Ara h 2抗体。购买分别针对Ara h 2蛋白上10个致敏表位的单克隆抗体。

2、用双抗夹心法分别测定样品中所含致敏表位的数量。首先用Ara h2多克隆抗体包被酶标板，封闭后加入待检测样品，再加入针对Ara h 2中10个致敏表位的单克隆抗体。再经显色反应后可以测得到Ara h 2蛋白上10个过敏原致敏表位的数量，三个主要过敏原致敏表位，即aa27-36，aa57-66，aa65-74的数量分别每摩尔Ara h 2为0.71摩尔，0.65摩尔，0.76摩尔，其他7个过敏原致敏表位aa15-24，aa21-30，aa39-48，aa49-58, aa115-124，aa1275-136，aa143-152的数量则分别为每摩尔Ara h 2为0.68摩尔，0.47摩尔，，0.75摩尔0.83摩尔，0.92摩尔，0.76摩尔，0.74摩尔。

3、计算致敏性强度A=k₁C₁+ k₂C₂+ k₃C₃+ k₄C₄+ …+ k_iC_i，C即为步骤2所得的浓度，k表示各致敏表位的致敏性强弱，根据已有文献和实验可知，对于三个主要致敏表位即aa27-36，aa57-66，aa65-74，其强度值k，分别为5.5，17，23，其他表位的致敏强度值k均为1。由此可以计算得A值为37.58。

4、采用与待检测样本来源相近、致敏性得到公认的蛋白样品——未经加工的Ara h 2蛋白，在相同条件下处理，即ELISA定量各过敏原蛋白致敏表位的数量，计算获得其A值为43.61，与对照样品对比，经热加工后，Ara h 2蛋白样品的致敏性有14%左右的降低。