一种赣州慢生根瘤菌及其用途

摘要

本发明公开了一种赣州慢生根瘤菌及其用途。赣州慢生根瘤菌（Bradyrhizobium ganzhouense sp.nov.）RITF806于2014年2月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014044。本发明是从黑木相思根瘤中分离筛选出的赣州慢生根瘤菌（Bradyrhizobium ganzhouense sp.nov.），该类菌株能与黑木相思（Acacia melanoxylon）、网脉相思（Acacia aneura）和灰木相思（Acacia implexa）等结瘤共生，具有强的抗逆性，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域：

本发明属于微生物领域，具体涉及一种赣州慢生根瘤菌及其用途。 

背景技术：

大气中含有78%的氮气，动植物不能直接利用，自然界只有部分原核微生物具有直接利用大气中氮气的能力，将其还原成氨，这就是固氮作用。世界上的人口、资源、环境已成为当今全球性的问题，被称为“绿色革命”的生物固氮日益受到重视，尤其在林业上的应用。由于林业具有生产周期长，立地条件复杂等特点，使林业的施肥并不像农业那样的方便、有效。因此，生物固氮成为林木所需氮素的重要来源。 

一些发达国家的林业生产中，相当程度上依赖生物固氮的贡献，重视固氮微生物资源的开发与利用。由于物价的上涨、保护环境意识的提高，生物制剂以其物美价廉、环保而独受青睐。世界上许多国家都把研究和开发微生物肥料及制品作为一项长远的计划。 

相思树种（Acacia）是我国引种的重要速生树种，它不仅速生而且适应性广，耐干旱痔薄，速生丰产，能产生根瘤，有固氮作用，具有良好的改良土壤性能，从其引进试种到目前的规模化种植，已在林业产业和生态环境建设中发挥了重大作用。针对研究的进展和林业生产应用需要，选择合适的根瘤菌微生物肥料，减少化学肥料的施放，可实现经济效益及生态效能的双赢，并能带动林业技术进步。 

菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈是优良菌株的选育问题。林业生产迫切需求固氮能力强、抗逆性强的微生物肥料生产用菌株。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种高效固氮结瘤的，能与黑木相思、网脉相思和灰木相思共生结瘤的新菌种—赣州慢生根瘤菌（Bradyrhizobium ganzhouense sp.nov.）RITF806，该菌于2014年2月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014044。 

本发明还提供了赣州慢生根瘤菌（Bradyrhizobium ganzhouense sp.nov.）RITF806在制备固氮微生物菌剂和生物有机肥中的应用。 

本发明是从黑木相思根瘤中分离筛选出的赣州慢生根瘤菌（Bradyrhizobium ganzhouense sp.nov.），该类菌株能与黑木相思（Acacia melanoxylon）、网脉相思（Acacia aneura）和灰木相思（Acacia implexa）等结瘤共生，具有强的抗逆性，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。 

本发明的赣州慢生根瘤菌(Bradyrhizobium ganzhouense)RITF806于2014年2月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014044。 

附图说明：

图1是赣州慢生根瘤菌的16S rRNA与参比菌株的系统发育树 

图2是采用最大似然法构建的系统发育树，其是以赣州慢生根瘤菌和慢生根瘤菌属内较相近种群的持家基因recA(355nt),glnII(497nt)和atpD(391nt)的序列拼接构建的。 

图3是慢生根瘤菌属代表菌株极性酯的组成，1：赣州慢生根瘤菌RITF806菌株；4：Bradyrhizobium huanghuaihaiense CCBAU23303^T菌株 

图4是黑木相思幼苗接种赣州慢生根瘤菌RITF806； 

图5是赣州慢生根瘤菌RITF806的透射电镜照片。 

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。 

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

YMA培养基：甘露醇10.0g，谷氨酸钠0.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.2g，NaCl0.01g，酵母粉0.5g，琼脂粉17g，蒸馏水1000mL，pH7.0。灭菌备用。 

Jensen’s无氮营养液：K₂HPO₄0.05g，NaCl0.05g，MgSO₄·7H₂O0.05g，CaHPO₄0.25g，FeCl₃0.05g，1mL微量元素溶液（H₃BO₃2.86g/L，MnSO₄·H₂O2.08g/L，ZnSO₄·7H₂O0.022g/L，CuSO₄·7H₂O0.08g/L，NaMoO₄0.11g/L），蒸馏水1000mL。灭菌备用。 

实施例1：赣州慢生根瘤菌RITF806、RITF807、RITF211的分离与鉴定 

一、根瘤菌的分离 

菌株分离自江西省赣州12年生黑木相思的根瘤。根瘤用自来水冲洗干净表面泥沙，于95%酒精浸泡15-30秒后，放入0.1%升汞溶液中表面消毒3-5分钟，无菌水冲洗7-8次。将经表面消毒后的根瘤放在两片无菌载玻片之间，用力挤压使根瘤破碎，用无菌接种针沾取根瘤液在YMA平板上划线，28～30℃恒温培养箱培养至菌落出现，挑取典型菌落纯化及鉴定。由此纯化得到根瘤菌RITF806、RITF807和RITF211。 

二、根瘤菌的鉴定 

从以下几个方面鉴定根瘤菌RITF806、RITF807和RITF211： 

1、形态学鉴定 

将上述步骤一分离并纯化的根瘤菌RITF806、RITF807及RITF211培养至对数生长期，且菌落大小稳定时，进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。 

对于处于对数生长期的所述根瘤菌，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。 

结果表明，上述步骤一分离纯化的3株根瘤菌RITF806、RITF807及RITF211为革兰氏阴性菌，菌落圆形凸起，乳白色，半透明，表面光滑，边缘整齐；菌体杆状，1.29～3.32×0.50～0.60μm，无芽孢。其透射电镜照片如图5所示。 

2、生理生化特征分析 

参考《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社，2011.）和《微生物学实验》（沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验（第三版）.北京：高等教育出版社，1999）测定上述根瘤菌的生理生化特征。 

所述根瘤菌的生理生化特征测定结果如下： 

根瘤菌RITF211、RITF806、RITF807的菌落黏稠，边缘整齐；在BTB培养基上产碱；与石蕊牛奶反应产碱；菌株能利用吐温80、D-果糖、α-D-葡萄糖、D-甘露醇、β-甲基-D-葡萄糖苷、松二糖、甲基丙酮酸、柠檬酸、D-半乳糖醛酸、D，L-乳酸作为唯一碳源；能在葡糖醛酰胺、羟基-L-脯氨酸作为唯一氮源的培养基上生长；能在以下抗生素浓度（μg/ml）的培养基上生长：氨苄青霉素5～300、氯霉素5～300、红霉素5～100、硫酸新霉素5～300、盐酸四环素5；能在含有1%以下染料的YMA培养基上生长：盐酸吖啶、脱氧胆酸钠、刚果红、藻红、溴百里酚蓝、龙胆紫、中性红、亚硝酸钠；过氧化氢酶实验、脲酶试验、氧化酶试验、 硝酸盐还原反应阳性；L-苯丙氨酸脱氨酶试验、3-酮基乳糖试验、耐尔蓝还原反应、亚甲蓝还原反应阴性；不能在肉汤培养基上生长。 

3、16S rRNA序列测定及系统发育分析 

常规方法培养根瘤菌RITF806、RITF807和RITF211，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16S rRNA通用引物，27F：5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’，1492R：5’－TACGGTTACCTTGTTACGACTT－3’进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为：95℃变性1min、56.7℃1min、72℃延伸1.5min，共30个循环。DNA测序由英潍捷基（上海）生物技术公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAMAN软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库在线完成。 

根瘤菌RITF806（SEQ ID NO.1）、RITF807（SEQ ID NO.2）和RITF211（SEQ ID NO.3）的16S rRNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。用16S rRNA基因的邻接法建树（1250nt)的系统发育树（图1），显示了Bradyrhizobium ganzhouense sp.nov.RITF806和其他慢生根瘤菌种群之间的亲属关系。根瘤菌RITF806、RITF807、RITF211菌株的3个蛋白质编码持家基因recA、glnII、atpD系统发育树见图2。根瘤菌RITF806、RITF807、RITF211菌株与其它慢生根瘤菌之间的16S rRNA和3个蛋白质编码持家基因的相似性范围见表1。 

表1Bradyrhizobium ganzhouense种内菌株以及与其它慢生根瘤菌之间的16S RNA和3个蛋白质编码持家基因的相似性 

^*对齐区域长度(bp):16S rRNA gene(1250),recA(355),glnII(497)and atpD(391) 

三个菌株:RITF806^T,RITF807and RITF211. 

4、DNA同源性分析 

利用常规方法大量提取3株根瘤菌RITF806、RITF807、RITF211以及参比菌株DNA。选取的参比菌株在基因型和表现型方面与供试根瘤菌较为相似，分别是Bradyrhizobium cytisi CTAW11^T、Bradyrhizobium huanghuaihaiense CCBAU23303^T、Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110^T、Bradyrhizobium rifense CTAW71^T、Bradyrhizobium canariense LMG22265^T、Bradyrhizobium japonicum USDA6^T、Bradyrhizobium betae PL7HG1^T。采用复性速率法对菌株 的DNA同源性进行测定。结果见表2。 

表2.供试根瘤菌与相近参比菌株的DNA同源性 

结果表明，所述的3株根瘤菌RITF806、RITF807、RITF211之间的DNA同源性高于78%，而与参比菌株同源性低于70%，属于根瘤菌的新种。菌株RITF211、RITF806、RITF807的（G+C）mol%含量分别为62.8、64.6、65.2，结果与相近参比菌株的（G+C）mol%含量值（62.7-65.1mol%）相一致。 

5、菌株脂肪酸测定 

脂肪酸种类及含量测定采用MIDI Sherlock微生物鉴定系统，菌株RITF806细胞中含有9种脂肪酸，其中16:0和Summed Feature8含量最高（表3）。 

表3.Bradyrhizobium ganzhouense RITF806^T和相近慢生根瘤菌的脂肪酸类型 

*Summed feature3=16:1ω6c/16:1ω7c. 

Summed feature8=18:1ω6c/18:1ω7c. 

该数据是用MIDI系统检测所得，数据库为TSBA6。菌株:1,B.ganzhouense RITF806^T;2,B.cytisi CTAW11^T;3,B.diazoefficiens USDA110^T;4,B.rifense CTAW71^T;5,B.huanghuaihaiense CCBAU23303^T.-,未检测到. 

6、极性酯测定结果 

慢生根瘤菌属代表菌株极性酯的组成见图3。根据图可知，代表菌株RITF806含有的极性酯主要为双磷脂酰甘油（DPG）、氨基脂（AL）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰乙醇胺（PE）、卵磷脂（PC）以及未知的极性脂（L）。参比菌株Bradyrhizobium huanghuaihaiense CCBAU23303^T中还检测出磷脂酰单甲基乙醇胺（PL），而PL在代表菌株RITF806中不存在，且二者含有的氨基脂（AL）种类不同。 

5、生长特性分析 

进行了菌株最适温度和最适pH及耐盐生长实验。采用YMA培养基，分别在4℃、10℃、28℃、37℃、60℃培养观察、记录菌株的温度适应性，每个处理3次重复。调整YMA培养基酸度分别在pH4、pH5、pH7、pH9、pH10、pH11及pH12，每个处理3次重复，培养、观察、记录菌株的最适pH。在YMA培养基中加入NaCl，使其终浓度分别为1%、2%、3%、4%和5%，每个处理3次重复，培养、观察、记录菌株的生长。 

结果表明，所述的3株根瘤菌的最适生长温度为28℃，最适生长pH为7。能在4℃、10℃、28℃、37℃条件下生长，经过60℃和70℃热激10分钟后培养不能生长，最适生长温度为28℃；pH耐受范围均为5-12，最适pH为7.0；NaCl耐受范围为0-5%，3%以上生长较差。 

鉴于上述形态、生理生化特征、16S rRNA序列测定及系统发育分析、DNA同源性分析及脂肪酸、极性脂含量等结果，将步骤一分离纯化得到的3株根瘤菌鉴定为赣州慢生根瘤菌（Bradyrhizobium ganzhouense sp.nov.）。该种的模式菌株-赣州慢生根瘤菌（Bradyrhizobium ganzhouense sp.nov.）RITF806已于2014年2月26日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏单位地址是：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014044。 

实施例2、赣州慢生根瘤菌（Bradyrhizobium ganzhouense）RITF806接种黑木相思效应 

一、菌液培养 

将赣州慢生根瘤菌RITF806菌株在YMA斜面上活化后转入YMA液体培养基，28-30℃摇床振荡培养（转速150转/分钟）至对数生长后期。 

二、接种 

苗木采用黑木相思组培苗，基质用无灭菌的黄心土，选用直径为12cm的塑料盆，盆底部放双层滤纸，加入黄心土至盆面1.5cm处。取长势接近的相思组培瓶苗，用蒸馏水将根部琼脂清洗干净后栽种于盛有黄心土的塑料盆中，每盆移栽1株苗，育苗期间按照常规育苗方法管理。移栽1个月后进行接种，每个盆内注入上述菌液(菌体浓度为10⁸CUF/mL)5mL，对照（CK）不接种。试验采用单因素随机区组设计，每个处理30次重复。接种5个月后观察结瘤及生长情况。 

三、测定及计算方法 

1、统计植株苗高、地上部分和地下部分干重、根瘤数量、根瘤干重。 

2、生物量测定采用植物样品在80℃烘至恒重称干重，样品含氮量用凯氏定氮法测定。 

3、总氮量、固氮量及固氮效益的计算：总氮量=植株生物量×氮含量；固氮量=接菌植株的总氮量-对照植株的总氮量；固氮效益=固氮量/总氮量×100%。 

结果如图4、表4和表5所示，黑木相思接种赣州慢生根瘤菌RITF806后，能促进苗木的生长，提高其结瘤数量、苗高、地上部分和地上部分干重，分别比对照提高81.09-152.9%（表4）；固氮效益达到61.47%（表5）。 

表4黑木相思接种赣州慢生根瘤菌RITF806的生长指标 

表5黑木相思接种赣州慢生根瘤菌RITF806的固氮效应 

实施例3、赣州慢生根瘤菌（Bradyrhizobium ganzhouense）RITF806、RITF211和RITF807菌株接种黑木相思、网脉相思和灰木相思。 

一、菌液培养 

将赣州慢生根瘤菌RITF806、RITF211和RITF807菌株分别在YMA斜面上活化后转入YMA液体培养基，28-30℃摇床振荡培养（转速150转/分钟）至对数生长后期。 

二、种子处理与萌发 

首先用浓硫酸浸泡种子半小时，然后将浓硫酸倒出，再用无菌水洗涤7～8次后，用无菌水浸泡到种子膨胀。将处理过的种子放在无菌培养皿中（内垫无菌滤纸加无菌水保湿），置于30℃培养箱中发芽。 

三、接种及苗木培养 

待种子发芽后，将种子种入装有无菌蛭石（用Jensen’s无氮水培液拌湿，铝箔封口，121℃灭菌1h）的试管中，每管1株，于28℃人工气候箱中培养2～3天后将菌液浇入试管中，每管2ml，每株菌接10株苗，然后放入人工气候箱中培养，光照强度7000lux,温度维持在26℃左右，光照时间12h。生长过程中，每5天浇一次无菌水。培养3个月后，观察结瘤及生长情况。 

四、测定及计算方法 

1、统计植株瘤数、瘤重、鲜重等。 

2、生物量测定采用植物样品在80℃烘至恒重称干重，样品含氮量用凯氏定氮法测定。 

3、总氮量、固氮量及固氮效益的计算：总氮量=植株生物量×氮含量；固氮量=接菌植株的总氮量-对照植株的总氮量；固氮效益=固氮量/总氮量×100%。 

结果显示，黑木相思、灰木相思及网脉相思接种赣州慢生根瘤菌RITF806、RITF211和RITF807后，能促进幼苗的结瘤数量，促进幼苗的生长（表6-9）。黑木相思接种赣州慢生根瘤菌提高苗木鲜重14.40-55.18%；灰木相思接种赣州慢生根瘤菌提高苗木鲜重27.18-36.91%；网脉相思接种赣州慢生根瘤菌提高苗木鲜重14.06-49.40%。 

表6黑木相思接种赣州慢生根瘤菌的生长指标 

表7黑木相思接种赣州慢生根瘤菌的固氮效应 

表8灰木相思接种赣州慢生根瘤菌的生长指标 

表9网脉接种赣州慢生根瘤菌的生长指标