抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的PCR检测方法及试剂盒

摘要

本发明提供用于检测抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的特异性PCR引物对，包括用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-1基因的引物对（Seq ID No.1-2）以及用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-2基因的引物对（Seq ID No.3-4）。采用该引物的PCR检测方法具有极好的特异性和灵敏性，经特异性试验证明（图1、2）能够将播娘蒿的两个ALS基因扩增出来。由于PCR方法操作简便快捷，基于对核苷酸的检测，当季就可以取样检测，从取样到出结果仅需2～4天。其灵敏度和特异性能够实现对田间疑似抗ALS抑制剂播娘蒿的快速鉴定和突变位点的确认，从而指导生产实践中抗性杂草的科学治理。

说明书

技术领域

本发明涉及抗除草剂杂草检测技术，具体地说，涉及一种抗ALS 抑制剂类除草剂播娘蒿的PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase,简称ALS），也称乙酰羟酸 合酶（acetohydroxyacid synthase，简称AHAS），是诱导植物和微生物 体内缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成过程中关键性酶，也是一 种重要的除草剂靶标。ALS抑制剂类除草剂的开发及使用始于上世纪 80年代初，由于此类除草剂有超高活性、对人及动物低毒、环境友好 等明显的优势，受到广泛关注，目前已有50多个品种被开发和使用。 上世纪80年代开始，我国陆续在冬小麦田推广使用苯磺隆、甲磺隆、 氯磺隆、噻吩磺隆、二甲碘磺隆、氟唑磺隆、啶磺草胺等，2009年仅 苯磺隆在我国的产量就达230多吨（有效成分），相当于麦田化除面积 2亿多亩。苯磺隆作为小麦田最经济、有效的优秀除草剂，对控制播 娘蒿、荠菜等阔叶杂草起到了非常重要的作用。但由于该类除草剂分 子靶标单一，长期使用易引起杂草抗药性，近些年来，以常规剂量喷 施苯磺隆无法有效防除播娘蒿的问题在我国河北、陕西、山东、河南、 山西等地的一些麦田非常突出，并且发现，有些麦田抗苯磺隆的播娘 蒿对双氟磺草胺、氯磺隆等ALS抑制剂也产生了交互抗性。麦田杂草 对上述几种ALS抑制剂产生交互抗性，使这些农田不能继续使用该类 除草剂，而在生产中由于农民对杂草抗药性的认识上的不足，盲目增 大用药剂量，不仅增加了成本，使药害风险加大，严重影响农民收入 和国家粮食安全。因此，目前迫切需要一个简便，快速的抗药性杂草 检测鉴定方法。

我国抗药性杂草的研究起步较晚，传统的抗药性杂草检测通常采 用室内生物测定法，既对田间采集的疑似抗性的杂草的种子在室内进 行培养，在一定叶龄喷施除草剂后，调查株防效和地上部分生物量来 计算抗性指数。这种方法能够客观地评价某种杂草对相应除草剂的抗 性情况，但也有其局限性，主要表现在以下两方面：一是不能当季、 当时进行检测，二是占地多、时间长、工作量大。随着分子生物学技 术在杂草抗药性机理研究方面的应用，越来越多的杂草的抗药性机理 得到明确。其中，播娘蒿对苯磺隆等ALS抑制剂类除草剂产生抗性的 原因已明确为编码苯磺隆靶标的ALS保守区某一位点发生点突变引 起的。研究中发现，播娘蒿具有两个ALS基因，分别命名为B-ALS-1 和B-ALS-2，这两个基因都具有功能，任意一个基因在保守区发生突 变，都能够引起抗药性产生。因此，可以通过分子生物学手段检测其 靶标酶ALS的保守区突变位点来检测播娘蒿是否发生抗药性。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的PCR 检测方法。

本发明的另一目的是提供一种用于检测抗ALS抑制剂类除草剂 播娘蒿的试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明首先提供用于检测抗ALS抑制剂类 除草剂播娘蒿的特异性PCR引物对，包括用于特异性扩增播娘蒿 B-ALS-1基因的引物对以及用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-2基因的引 物对，引物序列如下：

1）用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-1基因的引物对：

正向引物B-ALS-1F：5’-TCTATCTCTCGCTCCTCTCC-3’

反向引物B-ALS-1R：5’-CAAACAAACAGCAGTAGCG-3’

2）用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-2基因的引物对：

正向引物B-ALS-2F：5’-CTTCTTCTCCTCCAACGA-3’

反向引物B-ALS-2R：5’-GCCATCTCCTTCCGTTATGA-3’

本发明还提供含有上述引物对的用于检测抗ALS抑制剂类除草 剂播娘蒿的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR 反应缓冲液等中的至少一种。

更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供一种抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的PCR检测方 法，其利用上述引物对或试剂盒检测抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿。

前述方法，包括以下步骤：

1）提取样品中的DNA；

2）以步骤1）中提取的DNA为模板，进行PCR扩增反应；

3）分析PCR产物。

PCR反应体系以20μl计为：

PCR反应条件为：94℃3分钟；94℃1分钟，56℃1分钟，72℃ 1分钟，共30个循环；72℃10分钟。

本发明根据播娘蒿的两个ALS基因序列信息（GenBank登录号： KC417457.1和FJ715633.1）设计出特异性引物B-ALS-1F/B-ALS-1R和 B-ALS-2F/B-ALS-2R，采用该引物的PCR检测方法具有极好的特异性 和灵敏性，经特异性试验证明（图1、2）能够将播娘蒿的两个ALS基 因扩增出来。由于PCR方法操作简便快捷，基于对核苷酸的检测，当 季就可以取样检测，从取样到出结果仅需2～4天。其灵敏度和特异性 能够实现对田间疑似抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的快速鉴定和突 变位点的确认，从而指导生产实践中抗性杂草的科学治理。

本发明提供的用于检测抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的试剂盒， 可对田间采集的疑似抗性的播娘蒿进行快速检测。可以替代一直沿用 的生物测定的传统检测方法，并适于在其他抗药性杂草的监测领域中 广泛推广应用，实用性强，可满足田间抗药性杂草快速诊断的需要。

附图说明

图1为本发明实施例2中利用特异性检测引物 B-ALS-1F/B-ALS-1R对不同播娘蒿DNA的PCR扩增结果；其中，1为 DNA Marker（DL2000）；2-7号为引物对B-ALS-1F/B-ALS-1R扩增6个 播娘蒿样品的结果。

图2为本发明实施例2中利用特异性检测引物 B-ALS-2F/B-ALS-2R对不同播娘蒿DNA的PCR扩增结果；其中，1为 DNA Marker（DL2000）；2-7号为引物对B-ALS-1F/B-ALS-1R扩增6个 播娘蒿样品的结果。

图3为本发明实施例3中利用B-ALS-1F/B-ALS-1R引物对扩增敏 感性播娘蒿PCR产物测序结果；其中，B-ALS-1基因的第197位为CCT。

图4为本发明实施例3中利用B-ALS-2F/B-ALS-2R引物对扩增敏 感性播娘蒿PCR产物测序结果；其中，B-ALS-2基因的第197位为CCT。

图5为本发明实施例3中利用B-ALS-1F/B-ALS-1R引物对扩增敏 感性播娘蒿PCR产物测序结果；其中，B-ALS-1基因的第574位为TGG （反向互补序列）。

图6为本发明实施例3中利用B-ALS-2F/B-ALS-2R引物对扩增敏 感性播娘蒿PCR产物测序结果；其中，B-ALS-2基因的第574位为TGG （反向互补序列）。

图7为本发明实施例3中利用B-ALS-1F/B-ALS-1R引物对扩增抗 药性播娘蒿PCR产物测序结果；其中，B-ALS-1基因的第197位由CCT 突变为TCT。

图8为本发明实施例3中利用B-ALS-1F/B-ALS-1R引物对扩增抗 药性播娘蒿PCR产物测序结果；其中，B-ALS-1基因的第197位由CCT 突变为GCT。

图9为本发明实施例3中利用B-ALS-2F/B-ALS-2R引物对扩增抗 药性播娘蒿PCR产物测序结果；其中，B-ALS-2基因的第197位由CCT 突变为ACT。

图10为本发明实施例3中利用B-ALS-2F/B-ALS-2R引物对扩增抗 药性播娘蒿PCR产物测序结果；其中，B-ALS-2基因的第574位由TGG 突变为TTG（反向互补序列）。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验 手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1用于检测抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的PCR引物的合 成

在GenBank数据库中查询播娘蒿的两个ALS基因，即B-ALS-1(K  C417457.1)和B-ALS-2(FJ715633.1)基因序列，根据查询到的序列信 息，利用引物设计生物学软件，设计分别用于特异性扩增B-ALS-1和 B-ALS-2基因的PCR引物，引物序列如下：

1）用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-1基因的引物对：

B-ALS-1F：5’-TCTATCTCTCGCTCCTCTCC-3’（Seq ID No.1）

B-ALS-1R：5’-CAAACAAACAGCAGTAGCG-3’（Seq ID No.2）

2）用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-2基因的引物对：

B-ALS-2F：5’-CTTCTTCTCCTCCAACGA-3’（Seq ID No.3）

B-ALS-2R：5’-GCCATCTCCTTCCGTTATGA-3’（Seq ID No.4）

引物合成由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

实施例2抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的PCR检测方法

实验材料：采自不同地区的播娘蒿（Descuminia sophia）。

实验方法：

1、播娘蒿DNA的制备

取播娘蒿新鲜叶片200mg，采用液氮研磨，常规CTAB法提取各 播娘蒿叶片DNA。

2、用于检测播娘蒿B-ALS-1和B-ALS-2突变位点的特异性引物， 引物序列见实施例1。

3、用于检测播娘蒿ALS突变位点的PCR反应体系

PCR反应体系，其中10×PCR反应缓冲液2μL，15mM MgCl₂0.5μL，2.5mM dNTPs1μL，10μM引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶1U， DNA模板1μL，其余为灭菌双蒸水，终体积为20μL。

4、用于检测播娘蒿ALS突变位点的PCR扩增程序

94℃预变性3min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min， 共30个循环；最后72℃延伸10min。

5、PCR产物的鉴定

取3μL PCR产物，用1%（重量/体积）琼脂糖凝胶电泳分离，经 溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。

6、PCR产物测序

引物对B-ALS-1F/B-ALS-1R的PCR扩增产物用引物B-ALS-1F和 B-ALS-1R、引物对B-ALS-2F/B-ALS-2R的PCR扩增产物用B-ALS-2F 和B-ALS-2R分别正反向测序。测序由北京六合华大基因科技股份有 限公司完成。对测序结果进行比对分析。

实验结果：

检测特异性引物对B-ALS1F/B-ALS1R和B-ALS-2F/B-ALS-2R对 不同播娘蒿PCR扩增结果（图1、2）显示这两对引物具有很好的特异 性，能够分别扩增出B-ALS-1（扩增目的片段约2162bp）和B-ALS-2 （扩增目的片段约1778bp）。对两对引物扩增出来的敏感和抗药性播 娘蒿的PCR产物分别测序，在相应位点能够找到序列上的差异（图 3～10）。

实施例3PCR法检测田间抗ALS抑制剂的播娘蒿

检测方法如下：

1、样品采集与DNA制备

为验证PCR检测方法的可行性，在疑似发生抗药性播娘蒿的农田 采集样品，在实验室进行检测。从疑似发生抗性农田采集播娘蒿植株， 进行适当保湿处理后，邮寄至实验室。取播娘蒿新鲜叶片200mg，采 用液氮研磨，常规CTAB法提取各播娘蒿叶片DNA。

2、用于检测播娘蒿B-ALS-1和B-ALS-2突变位点的特异性引物， 引物序列见实施例1。

3、用于检测播娘蒿ALS突变位点的PCR反应体系

同实施例2。

4、用于检测播娘蒿ALS突变位点的PCR扩增程序

同实施例2。

5、PCR产物的鉴定

同实施例2。

6、PCR产物测序

同实施例2。

实验结果：

样品采自河北、陕西、安徽省的不同农田，共采集24个，按照本 发明的检测方法对其进行检测。检测结果显示（表1），有11个种群的 B-ALS-1在197位发生突变，有3个种群的B-ALS-2在197位发生突变， 有4个种群的B-ALS-2在574位发生突变。

由此可见，该方法能够快速、准确地检测采自田间的疑似抗药性 播娘蒿的抗药性突变的发生位点及取代的氨基酸种类，能够快速准确 地给出能否继续使用ALS抑制剂来防除播娘蒿，是一种检测播娘蒿抗 药性种群的简单、快速的方法。

表1PCR法检测田间播娘蒿抗药性突变位点结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。