利用基因枪获得转基因小麦的方法及其专用培养基

摘要

本发明公开了一种利用基因枪获得转基因小麦的方法及其专用培养基。本发明以小麦幼胚为外植体，不经过预培养直接使用本发明所提供的高渗培养基进行高渗处理后进行基因枪轰击，轰击后再用本发明提供的专用培养基进行高渗处理、愈伤组织诱导、分化和生根培养，且在分化和生根阶段使用筛选剂，在愈伤组织诱导阶段不使用筛选剂，可明显提高小麦的基因转化效率，最高可达36%；且本发明还具有转化周期短（从取幼胚至获得具有根茎叶的再生植株仅需8—10周）、转化稳定性和重复性高的优点。本发明为小麦遗传改良产业化提供了一个有效途径，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用基因枪获得转基因小麦的方法及其专用培养基。

背景技术

小麦是一种在世界各地广泛种植的重要粮食作物，它关系到国家的经济危机和粮 食安全。中国是世界最大的小麦生产国。2010年继玉米和水稻之后，小麦在中国的产 量达到了224万吨。目前，通过常规育种手段提高小麦产量和品质的努力已是举步维 艰，尤其在挖掘亩产潜力、保证年产稳定性等方面。自1992年Vasil等将gus/bar 基因导入小麦获得首例转基因小麦以来，遗传改良育种在小麦上的研究有了长足的发 展。2008年国家将小麦的遗传改良加入重大转基因专项，正在积极稳妥地推动实施转 基因小麦新品种的培育工作。小麦遗传转化常用的方法有基因枪法和农杆菌介导法。 由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，所以基因枪法一直是小麦转化的主要方法。

尽管到目前为止一些国外公司和实验室能够利用基因枪法获得稳定遗传的转基 因小麦，但普遍具有转化效率低、转化周期长、体细胞变异多、逃逸现象严重、仅适 用于“Bobwhite”“Fielder”等国外品种的技术缺陷和不足。1995年Zhou等用预培 养5天的“Bobwhite”未成熟胚基因枪法导入gus/cp4基因。整个转化周期长达4-5 个月，草铵膦阳性植株占轰击外植体的比例平均为0.15%，其中1/3的植株能够表达 gus基因。1996年Ortiz等用包裹含有gus/hpt基因的质粒轰击预培养7-9天的“Buck Ombú”未成熟胚，仅愈伤筛选阶段长达4-6周并且8个转化植株中就有4个逃逸。2000 年Jordan实验室利用GFP辅助筛选大大提高了小麦基因枪转化频率，最高可达5%。 2002年Hubert等借助bar基因，GFP辅助筛选手段，使商品小麦品种“Combi”的转 化频率达到了4.93%，比常规愈伤转化高出38倍。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种获得转基因小麦的成套培养基，包含如下分别独立 包装的四种培养基中的四种、任意三种、任意两种或任意一种：培养基A、培养基B、 培养基C和培养基D；

所述培养基A(即高渗培养基)是由MS基本培养基、甘露醇、2,4-D、蔗糖和凝固 剂制成的固体培养基；所述甘露醇在所述培养基A中的浓度可为80-100g/L（如90 g/L）；所述2,4-D在所述培养基A中的浓度可为4.5—5.5mg/L（如5.0mg/L）；

所述培养基B（即诱导培养基）是由MS基本培养基、2,4-D、硫酸铜、水解酪蛋 白、蔗糖和凝固剂制成的固体培养基；所述2,4-D在所述培养基B中的浓度可为2.0 -3.0mg/L(如2.0mg/L),所述硫酸铜在所述培养基B中的浓度可为0.5-0.7mg/L(如 0.6mg/L),所述水解酪蛋白在所述培养基B中的浓度可为0.4—0.6g/L(如0.5g/L)；

所述培养基C（即分化培养基）是由MS基本培养基、激动素、蔗糖和凝固剂制成 的固体培养基，或由MS基本培养基、激动素、蔗糖、凝固剂和筛选剂制成的固体培养 基；所述激动素在所述培养基C中的浓度可为0.2—0.3mg/L（如0.2mg/L）；

所述培养基D（即生根培养基）是由1/2的MS基本培养基、乙磺酸、α-萘乙酸、 蔗糖和凝固剂制成的固体培养基，或由1/2的MS基本培养基、乙磺酸、α-萘乙酸、 蔗糖、凝固剂和筛选剂制成的固体培养基；所述乙磺酸在所述培养基D中的浓度可为 0.4—0.6g/L（如0.5g/L），所述α-萘乙酸在所述培养基D中的浓度可为0.4—0.6mg/L （0.5mg/L）；

所述MS基本培养基为表1所示的培养基。

在上述成套培养基中，所述蔗糖在所述培养基A、B、C和D中的浓度可为20—40g/L （如30g/L）；

和/或，所述凝固剂为植物凝胶，所述植物凝胶在所述培养基A、B、C和D中的 浓度可为3g/L；

和/或，所述培养基A、B、C和D的pH值可为5.6—5.8（如5.8）。

本发明的另一个目的是提供一种利用基因枪获得转基因小麦的方法，包括如下步 骤：

1）取小麦幼胚用所述培养基A进行培养；

2）使用基因枪对经步骤1）所述培养的小麦幼胚进行轰击，将目的DNA导入所述 小麦幼胚细胞中；

3）将经步骤2）所述轰击的小麦幼胚用所述培养基A进行培养；

4）将经步骤3）所述培养的小麦幼胚用所述培养基B进行培养获得愈伤组织；

5）将步骤4）获得的愈伤组织用所述培养基C进行分化培养，获得含目的DNA的 转基因小麦植株。

步骤4）中所述培养的时间具体可为14天；

步骤5）中所述分化培养的时间具体可为28天，每14天继代一次。

在上述方法中，步骤1）中所述培养的时间为3—5小时（如4小时）；和/或，步 骤3）中所述培养的时间为14—18小时（如16小时）。

在上述方法中，步骤2）中所述轰击的次数为一次；每次所述轰击的轰击距离为 6cm，轰击压力为1100psi，轰击直径为2cm。

在上述方法中，所述轰击使用金粉对待转化DNA进行分散；每次所述轰击中所述 金粉的使用量为200μg，所述待转化DNA为1μg；所述金粉的粒径为0.6μm。

在上述方法中，所述分化培养后还包括生根培养的步骤，所述生根培养使用的培 养基为所述培养基D；所述生根培养的时间具体可为14—28天，每14天继代一次。

在上述方法中，在所述分化培养时使用含筛选剂的所述培养基C；和/或，在所述 生根培养时使用含筛选剂的所述培养基D。

在上述方法中，所述筛选剂可为草铵膦，所述草铵膦在所述分化培养和生根培养 中的浓度为5—10mg/L，具体可为5mg/L。

和/或，步骤2）中所述轰击时所述目的DNA连接于环形质粒上。

在上述方法中，所述培养的温度为22—26℃,如22℃或24℃；

和/或，所述分化培养的光周期为每天24小时中16小时光照、8小时黑暗，光照 强度为150μmol/m²/s；

和/或，所述生根培养的光周期为每天24小时中16小时光照、8小时黑暗，光照 强度为150μmol/m²/s。

和/或，步骤1）中所述小麦幼胚为开花10—14天的小麦幼胚。

实验证明，以小麦幼胚为外植体，不经过预培养直接使用本发明所提供的高渗培 养基进行高渗处理后进行基因枪轰击，轰击后再用本发明提供的专用培养基进行高渗 处理、愈伤组织诱导、分化和生根培养，且在分化和生根阶段使用筛选剂，在愈伤组 织诱导阶段不使用筛选剂，可明显提高小麦的基因转化效率，最高可达36%；且本发 明还具有转化周期短（从取幼胚至获得具有根茎叶的再生植株仅需8—10周）、转化稳 定性和重复性高的优点。本发明为小麦遗传改良产业化提供了一个有效途径，具有广 阔的应用前景。

附图说明

图1为质粒pAHC20的物理图谱。

图2为本发明转化小麦幼胚过程中的材料生长情况。其中，图A为摆放在高渗培 养基上的小麦幼胚待后续轰击；图B为经愈伤组织诱导培养2周后的愈伤生长状况； 图C为愈伤组织经分化培养两周后的生长状况；图D为经生根培养2周后的抗性植株； 图E为将生根培养4周后的抗性植株；图F为温室生长2个月后的转基因植株，均能 正常结实。

图3为小麦转基因植株的Southern杂交检测结果。其中，泳道1—10为不同的 T₀代小麦转基因单株，N为未进行基因转化的小麦植株阴性对照，P为质粒pAHC20阳 性对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的小麦品种和质粒的信息如下：

小麦品种石4185：文献：付大平,蔡欣.冬小麦新品种冀审石4185.作物杂志,1998 年05期.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

小麦品种众麦1号：文献：赵跃荣.小麦新品种众麦1号栽培技术.河南农业，2010 年13期.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

小麦品种晋麦45号：文献：郭世臣.晋麦45号.农业科技信息,1993年02期.公 众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

小麦品种洛旱7号：文献：高海涛.抗旱节水小麦新品种——洛旱7号.农家科技， 2008年10期.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

小麦品种扬麦19：文献：祝尊友.扬麦19高产高效栽培技术.农技服务,2009年 第08期.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

小麦品种科农199：文献：赵慧,张玮,王静,纪军,王志国,李俊明.冬小麦新品种 “科农199”高产稳产特征分析.中国生态农业学报.2011年,第05期.公众可从中国 科学院遗传与发育生物学研究所获得。

质粒pAHC20：文献：吴爱忠,唐克轩.转基因培育抗除草剂水稻.遗传学报.2000 年,第11期,992-998页.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

下述实施例中所用的MS基本培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如表1所示。

表1.MS基本培养基

大量元素 培养基中浓度（g·L^-1） NH₄NO₃1.65 KNO₃1.9 KH₂PO₄0.17 MgSO₄·7H₂O 0.37 CaCl₂·2H₂O 0.44 微量元素 培养基中浓度（mg·L^-1） FeSO₄·7H₂O 27.8 Na₂EDTA 37.3 MnSO₄·4H₂O 22.3 ZnSO₄·4H₂O 8.6 H₃BO₃6.2 KI 0.83 Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 CuSO₄·5H₂O 0.025

CoCl₂·6H₂O 0.025 有机成分 培养基中浓度（mg·L^-1） 甘氨酸 2.0 盐酸硫胺素 0.1 盐酸吡哆素 0.5 烟酸VB5 0.5 肌醇 100

实施例1、利用基因枪获得转基因小麦

分别以小麦品种石4185、众麦1号、晋麦45号、洛旱7号、冀师02-1、扬麦19、 科农199的幼胚为外植体，利用基因枪将含有bar基因的质粒pAHC20转入小麦细胞， 转化方法及结果具体如下：

一、培养基的制备

1、高渗培养基：在MS基本培养基（表1）中添加终浓度为90g/L的甘露醇，5.0mg/L 的2,4-D，30g/L的蔗糖,调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭 菌20min，制成固体培养基。

2、愈伤诱导培养基：在MS基本培养基（表1）中添加终浓度为2.0mg/L的2,4-D， 0.5mg/L的硫酸铜，0.5g/L的水解酪蛋白，30g/L的蔗糖,调pH至5.8，添加终浓度为 3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，制成固体培养基。

3、分化培养基：在MS基本培养基（表1）中添加终浓度为0.2mg/L的激动素， 30g/L的蔗糖,调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min， 待培养基温度降至60℃左右时添加终浓度为5mg/L草铵膦，制成固体培养基。

4、生根培养基：在1/2的MS基本培养基（表1）中添加终浓度为0.5g/L的乙磺 酸，0.5mg/L的α-萘乙酸，30g/L的蔗糖,调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝 胶，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至60℃左右时添加终浓度为5mg/L草铵膦， 制成固体培养基。

二、利用基因枪获得转基因小麦

1、外植体的获取

剪取大田或生长室中生长健壮、病虫害少的开花10—14天的小麦幼穗，剥取幼穗 种子，用体积百分含量为75%的乙醇溶液消毒1min；无菌水冲洗1次，滴入一滴Tween20 液体；再用有效氯质量百分含量为2%的次氯酸钠溶液灭菌20min；无菌水冲洗6次。 在超净工作台中用解剖刀切除胚芽后剥取大小为1.2-1.8mm半透明的未成熟胚（即小 麦幼胚）。

2、轰击前的高渗处理

取步骤1剥取的未成熟胚，盾片朝上接种于步骤一制备的高渗培养基上，依次排 列放置在60×15mm的培养皿中央直径为2.0—3.0cm的圆形区域内（图2中的A）， Parafilm封口，22℃黑暗条件下高渗培养4小时。

3、基因枪轰击

1）金粉准备

取40-60mg粒径0.6μm的金粉，加入1ml75%的乙醇，涡旋15min后3000g离心 5min，吸除上清液，重复清洗3次。加入无菌水，终浓度为40mg/ml的金粉溶液，-20℃ 保存。

2）质粒与金粉的包裹

在1.5ml灭菌离心管中依次加入：步骤1）的金粉溶液（40mg/ml）50μl、质粒pAHC20 （1μg/μl）10μl、CaCl2（2.5M）50μl、亚精胺（0.1M）20μl；轻柔地涡旋3min，混匀 后于冰上静置15min-1h，3000g离心10s吸除上清液，加入灭菌无水乙醇清洗2次， 3000g离心1min吸除上清液后加入200μl无水乙醇，轻柔涡旋2min，混匀后均匀涂布 于10个载体膜中央2cm的区域内（即每个载体膜涂布200μg金粉和1μg待转化DNA）。

3）基因枪轰击

使用Bio-Red公司生产的PDS1000/He基因枪，轰击压力1100psi，轰击距离6cm， 真空度26-28inHg，每皿材料轰击一次。

4、轰击后高渗处理

将经步骤3基因枪轰击后的小麦幼胚移至24℃黑暗条件下继续高渗培养16小时。

5、愈伤组织的诱导

将经步骤4高渗培养的小麦幼胚转至步骤一制备的愈伤诱导培养基上，盾片朝上， 90×15mm每皿25粒，于24℃黑暗培养2周（图2中的B）。培养过程中及时拔除长出 的胚芽和须根。

6、分化培养（筛选）

将步骤5诱导出的愈伤组织转至步骤一制备的分化培养基上，于24℃、光周期为 每天24小时中16小时光照、8小时黑暗，光照强度为150μmol/m²/s条件下培养2— 4周，每两周继代一次（图2中的C）。

7、生根培养（筛选）

将经步骤6培养的长出绿头或绿苗移至步骤一制备的生根培养基上，于24℃、光 周期为每天24小时中16小时光照、8小时黑暗，光照强度为150μmol/m²/s条件下培 养2-4周，每两周继代一次（图2中的D和E），获得T₀代具有根茎叶的小麦转化植 株，此时，取叶片进行步骤三的PCR检测并进行步骤8的壮苗及扩繁生长。

8、壮苗及扩繁生长

将经步骤7培养获得的地上部分高10cm左右且诱导出2条以上强壮根系的植株， 移栽至12×12cm的花盆中，于光周期为每天24小时中16小时光照、8小时黑暗，光 照强度500μmol/m²/s、苗期光照时温度为20℃、黑暗时温度为15℃、孕穗及灌浆期光 照时温度为30℃、黑暗时温度为20℃的生长室中壮苗扩繁。

三、转基因小麦的PCR检测

使用TIANGEN快速型植物基因组DNA提取系统试剂盒（天根生化科技(北京)有限 公司，产品目录编号为L0814）提取步骤二获得的T₀代小麦转化植株的基因组DNA， 以该基因组DNA为模板，Bar基因为靶基因，用特异引物5′ -GGATCTACCATGAGCCCAGA-3′（序列表序列1）和5′-TGCCTCCAGGGACTTCAG-3′（序列 表序列2）进行PCR扩增，bar基因扩增片段大小为356bp；以未转基因的小麦植株的 基因组DNA为阴性对照，以质粒pAHC20为阳性对照，记录PCR检测呈阳性的植株。结 果待测的T₀代小麦转化植株中PCR阳性率在90%以上。

四、转化频率和转化效率统计

统计各小麦品种的转化效率（平均值±标准差），结果如表2所示。其中：转化效 率=获得T₀代转化植株的小麦幼胚数/轰击的小麦幼胚数×100%。

表2、利用本发明方法及培养基的转化效率统计结果

五、Southern杂交检测

从步骤三中检测为阳性的T₀代小麦转化植株中随机取单株10个，CTAB法（Stacey  J,Isaac P.1994.Isolation of DNA from plants.In:Isaac PG ed.Methods in  molecular biology——protocols for nucleic acid analysis by non-radioactive  probes.Totowa,NJ:Humana Press Inc.28:9-15）提取叶片的基因组DNA，以步骤 三中PCR扩增的Bar基因（356bp）为探针，进行Southern杂交检测，结果全部呈阳 性，杂交结果如图3所示。

六、Bar基因筛选实验

配制0.5%（v/v）Basta（200mg/ml草铵膦）溶液，对经步骤三检测为阳性的27 个独立转基因植株（即来源于不同的小麦幼胚）的T₁代植株幼苗进行喷施，一周后统 计枯黄坏死植株（阴性）和正常存活植株（阳性）的数量，统计分离比，结果如表3 所示。

表3T₁代植株中bar基因的分离情况

注：表中的^**表示P﹥0.5，^*表示0.1﹤P﹤0.5。