窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的定量分析方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的定量分析方法。本发明要解决的技术问题是为分析窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌提供一种新选择。本发明的技术方案是窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的定量分析方法，包括如下步骤：a、标准曲线的制备；b、提取基因组DNA；c、扩增；d、定量分析。本发明方法可用于分析窖泥中的梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的变化趋势。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的 定量分析方法。

背景技术

窖池是白酒生产过程中，集糖化、酒化、酯化等多种反应于一体的酿酒容器。俗话说“老 窖出好酒”，在白酒生产实践中，往往发现靠近窖底、窖壁的糟醅，其酒浓郁芳香，其根本 原因在于窖泥中与生香有关的功能菌群的代谢作用。窖池本身就是多种微生物的载体，随 着发酵长期连续的进行，窖泥中的功能微生物不断地得到驯化和富集，最终形成其特有的 微生物群落。因此，窖泥中微生物群落的种类和数量对白酒风味物质的形成有着重要的影 响。研究者采用传统培养以及现代分子生物学技术等方法，对窖泥中微生物群落结构进行 分析和研究，发现梭菌（Clostridium）、乳酸菌（Lactobacillus）、芽孢杆菌（Bacillus）、 甲烷菌（Methanobacterium）等是窖泥中的主要功能微生物菌群，但窖泥中功能微生物多数 为厌氧微生物，且不易纯培养，不能准确对窖泥中的功能微生物进行的检测。因此，阐明 窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌等功能微生物的生物量的变化情况，对人工窖泥 的开发、窖泥的质量控制以及白酒风味物质的形成都具有重要的意义。

目前对窖泥中微生物定量检测仍然采用选择培养基的筛选和纯培养分离计数的方法， 易受到外界环境因素，菌种特性等影响，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时费力。荧 光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术不仅实现了DNA模板的定 量，而且具有特异性强、灵敏度高、高通量、反应全封闭、定量准确、速度快及自动化程 度高等优点，已成为分子生物学及微生物领域中重要的定量方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为分析窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌提供一种 新选择。

本发明的技术方案是窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的定量分析方法，包括 如下步骤：

a、标准曲线的制备：设计针对梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的标准细菌的特异性 引物，然后进行荧光定量PCR，根据拷贝数与CT值构建的标准曲线；

b、提取基因组DNA：利用洗脱、酶消化结合的方法提取窖泥微生物群落的宏基因组；

c、扩增：采用梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的特异性引物，对窖泥微生物宏基因 组中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的特异性片段进行扩增；

d、定量分析：通过标准曲线和待测样品的CT值对窖泥微生物群落中梭菌、乳酸菌、 芽孢杆菌和甲烷菌进行定量分析。

具体的，步骤a和c中扩增梭菌的特异性引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

具体的，步骤a和c中扩增乳酸菌的特异性引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

具体的，步骤a和c中扩增芽孢杆菌的特异性引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

具体的，步骤a和c中扩增甲烷菌的特异性引物如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。

梭菌特异性引物序列（5′→3′）：

Clost-F：AAAGGRAGATTAATACCGCATAA（SEQ ID No.1）；

Clost-R：TTCTTCCTAATCTCTACGCA（SEQ ID No.2）。

乳酸菌特异性引物序列（5′→3′）：

Lacto-F：AGAACACCAGTGGCGAAGG（SEQ ID No.3）；

Lacto-R：CAGGCGGAGTGCTTAATGC（SEQ ID No.4）。

芽孢杆菌特异性引物序列（5′→3′）：

Bacil-F：ATGGCTGTCGTCAGCT（SEQ ID No.5）；

Bacil-R：ACGGGCGGTGTGTAC（SEQ ID No.6）。

甲烷菌特异性引物序列（5′→3′）：

Metha-F：GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC（SEQ ID No.7）；

Metha-R：TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT（SEQ ID No.8）。

上述引物中的R为A或G；W为A或T；M为A或C；Y为T或C。

具体的，步骤a的操作如下：从窖泥微生物群落中提取分离纯化得到的1株梭菌 （Clostridium butyricum）、1株乳酸菌（Lactobacillus crustorum）、1株芽孢杆菌（Bacillus  amyloliquefaciens）、1株甲烷菌（Methanobacterium bryantii）的基因组，然后分别利用特异 性引物进行PCR得到特异性目的片段，再将目的片段与TA克隆载体连接，获得重组质粒， 再将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆转化子，提取得到高浓度质粒，然 将此高浓度质粒做10倍比稀释，作为荧光定量PCR的标准样品，从而进行荧光定量PCR 获得标准曲线。

具体的，步骤a和c中扩增梭菌特异性目的片段的PCR反应程序为：95℃预变性4min 后，进入30个循环，95℃1min；57℃1min；72℃1min，最后72℃延伸10min；扩增乳 酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌特异性目的片段的PCR反应程序为：95℃预变性4min后，进入 30个循环，95℃1min；55℃1min；72℃1min，最后72℃延伸10min。

具体的，步骤b中所述的洗脱、酶消化结合的方法的具体操作如下：称取1g窖泥样品 于50mL离心管，向离心管加入5mL PBS缓冲液pH7.64和8～9颗灭菌玻璃珠，漩涡震荡 5min，200×g离心5min，在冰上吸取上清液；在沉淀中加入5mL PBS缓冲液重复洗涤两次， 合并三次上清液，12000rpm离心5min，取沉淀；加入1mL CTAB抽提液（2%CTAB、5mol/L NaCl、1mol/L pH8.0的Tris-HCl、0.5mol/L EDTA）和20μL巯基乙醇至离心管中，65℃恒 温混匀仪振荡30min，加入5μL20mg/mL蛋白酶k，37℃220r/min30min，室温6000×g离 心10min，收集1mL上清；加入等体积Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇，抽提一次，12000rpm离 心10min，取上清加入等体积氯仿-异戊醇12000rpm离心10min，取上清，重复两次；上清 液加入0.6倍体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀1h，12000rpm离心10min，倒掉液体；沉淀用 70%乙醇洗涤，12000r/min离心10min；洗涤后的DNA吹干后TE溶解，-20℃冰箱保存备 用；其中所述的CTAB抽提液配方为2%CTAB、5mol/L NaCl、1mol/L pH8.0的Tris-HCl、 0.5mol/L EDTA；Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇的体积比25︰24︰1；氯仿-异戊醇的体积比24︰ 1。

本发明操作简单，可对窖泥中的微生物进行定量分析，灵敏度和重复性好。采用梭菌、 乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌特异性引物和荧光定量PCR技术，建立渐变、快速、准确的窖 泥中主要功能微生物的定量检测方法，可以简化窖泥中功能微生物的检测程序、提高检测 效率，加强对窖泥中主要微生物的监控，为白酒发酵过程中风味物质的形成机理提供了技 术支持。本发明成功运用了荧光定量PCR技术对窖泥中的主要微生物—梭菌、乳酸菌、芽 孢杆菌、甲烷菌进行定量分析，并得到4类微生物的生物量在不同窖龄窖泥中的变化。

附图说明

图1不同窖龄窖泥中梭菌拷贝数的变化曲线

图2不同窖龄窖泥中乳酸菌拷贝数的变化曲线

图3不同窖龄窖泥中芽孢杆菌拷贝数的变化曲线

图4不同窖龄窖泥中甲烷菌拷贝数的变化情况

图1～4中横轴表示窖泥窖龄

具体实施方式

在本发明中，荧光定量PCR采用Bio-Rad专用定量PCR试剂SsoFast EvaGreen预混 液，该预混液使用专利的Sso7d融合蛋白技术，在广泛的定量PCR应用中有卓越的表现。 通过新型的热启动工程融合聚合酶结合优化的缓冲液和ROX惰性参照染料，在短时间内可 以获得重复性更好，灵敏度更高的定量PCR结果。饱和的荧光染料EvaGreen能有效增强 其与双链DNA结合的强度和反应灵敏度，确保了最好的扩增效率，灵敏性和重复性，同时 荧光强度相较于SYBR Green更高。

实施例1标准曲线的制备

1、合成针对梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的特异引物，并对筛选的梭菌、乳酸菌、 芽孢杆菌和甲烷菌进行特异性扩增

梭菌特异性引物序列（5′→3′）：

Clost-F：AAAGGRAGATTAATACCGCATAA；

Clost-R：TTCTTCCTAATCTCTACGCA。

乳酸菌特异性引物序列（5′→3′）：

Lacto-F：AGAACACCAGTGGCGAAGG；

Lacto-R：CAGGCGGAGTGCTTAATGC。

芽孢杆菌特异性引物序列（5′→3′）：

Bacil-F：ATGGCTGTCGTCAGCT；

Bacil-R：ACGGGCGGTGTGTAC。

甲烷菌特异性引物序列（5′→3′）：

Metha-F：GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC；

Metha-R：TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT。

上述引物中的R为A或G；W为A或T；M为A或C；Y为T或C。

2、窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的筛选及标准菌株的确定

a、梭菌的筛选：

梭菌筛选培养基：硫酸铵0.05%w/w，乙酸钠0.5%w/w，磷酸氢二钾0.04%w/w，硫酸 镁0.02%w/w，酵母膏0.1%w/w，琼脂1.5%w/w，121℃，30min灭菌，乙醇2%（v/v）， 灭菌CaCO₃溶液2%v/v，乙醇，碳酸钙均在灭菌后，冷却至70℃左右加入。

取1g窖泥样品制成菌悬液，80℃水浴10min，梯度稀释至10^-3，稀释涂布，37℃厌氧 培养72h，挑选产生溶钙圈的菌落，多次分离纯化，镜检得到纯种，16S rDNA鉴定，-20℃ 甘油管保存。

b、乳酸菌的筛选：

乳酸菌的筛选培养基：葡萄糖2%w/w，蛋白胨1%w/w，牛肉膏1%w/w，酵母提取物 0.5%w/w，K₂HPO₄0.2%w/w，柠檬酸三铵0.2%w/w，乙酸钠0.5%w/w，吐温800.1%v/v， MgSO₄·7H₂O0.05%w/w，MnSO₄·4H₂O0.025%w/w，pH6.2～6.4，琼脂1.5%w/w，121℃， 20min灭菌后冷却至70℃左右加入灭菌的CaCO₃溶液2%v/v。

取1g窖泥样品梯度稀释至10^-6，稀释涂布，37℃培养48h，挑选产生溶钙圈的菌落， 多次分离纯化，镜检得到纯种，16S rDNA鉴定，-20℃甘油管保存。

c、芽孢杆菌的筛选：

芽孢杆菌筛选培养基：胰蛋白胨1%w/w，酵母提取物0.5%w/w，氯化钠1%w/w，琼脂 1.5%w/w，pH7.2～7.4，121℃，20min灭菌。

取1g窖泥样品制成菌悬液，80℃水浴10min，梯度稀释至10^-5，稀释涂布，37℃培养 48h，挑选生长菌落，多次分离纯化，镜检得到纯种，16S rDNA鉴定，-20℃甘油管保存。

d、甲烷菌的筛选：

甲烷菌筛选培养基：配置浓度如下的母液：1.11%w/w的醋酸钠、0.02%w/w的氯化镁、 0.05%w/w的磷酸二氢钾、0.075%w/w的氯化铵、1%w/w的硫化钠、5%w/w的碳酸铵，后 按照母液浓度3%稀释使用，pH7.0，琼脂1.5%w/w，21℃，20min灭菌，乙醇2%（v/v）， 在灭菌后，冷却至70℃左右加入。

取1g窖泥样品制成菌悬液，梯度稀释至10^-3，稀释涂布，37℃厌氧培养5d，挑选生长 菌落，多次分离纯化，镜检得到纯种，16S rDNA鉴定，-20℃甘油管保存。

选取筛选的1株梭菌（Clostridium butyricum）、1株乳酸菌（Lactobacillus crustorum）、 1株芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、1株甲烷菌（Methanobacterium bryantii）作为标 准菌株。

3、得到特异性扩增目的片段

分别以4株纯菌的DNA为模板，以Clost-F/Clost-R、Lacto-F/Lacto-R、Bacil-F/Bacil-R 和Metha-F/Metha-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系：总体积25μL，体系包括2.5μL 10×Buffer（含有Mg²⁺），2μL25mmol/L dNTP混合物，0.2μL1U Taq DNA聚合酶，1μL 10μmol/L引物（正向、反向），DNA模板用量为1μL，用ddH₂O补足至25μL。

PCR反应程序为（梭菌）：95℃预变性4min后，进入30个循环，95℃1min；57℃1min； 72℃1min，最后72℃延伸10min。

PCR反应程序为（乳酸菌，芽孢杆菌和甲烷菌）：95℃预变性4min后，进入30个循 环，95℃1min；55℃1min；72℃1min，最后72℃延伸10min。

扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，梭菌的目的片段大约为540bp，乳酸菌目的片 段大小为170bp、芽孢杆菌的目的片段大约为300bp，甲烷菌的目的片段大约为460bp并将 PCR产物割胶回收。

4、大肠杆菌JM109感受态细胞的制备

挑取JM109平板上单菌落至5mL LB培养基中，37℃、220rpm培养过夜；将过夜培 养的种子液以2%的接种量转接入15mL LB培养基中，37℃、220rpm培养1.5h左右至 OD600为0.3～0.5之间；分装1mL菌液至1.5mL离心管中，冰浴20min后迅速离心，4℃、 5000rpm离心10min；彻底弃去上清，加入400μL0.1mol/L预冷的CaCl₂溶液重悬菌体， 再冰浴30min；4℃、5000rpm离心10min，弃去上清液，倒置1min；用80μL0.1mol/L 预冷的CaCl₂溶液重悬菌体，冰上放置30min。

5、重组质粒的构建

将pMD19-T Vector和目的片段以1︰3比例连接，16℃连接过夜，然后将连接产物转 化JM109感受态大肠杆菌细胞，然后将已转化的感受态大肠杆菌细胞涂布于含有氨卞青霉 素（100μg/mL）的LB平板上，37℃培养12～16h，挑取阳性菌落，于含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的液体LB培养基中震荡培养，37℃，8～10h。用培养的菌液提取质粒，在此利用 设计的引物进行质粒扩增验证，如果琼脂糖凝胶在540bp、170bp、300bp、460bp左右有 可见的目的条带，可以确定目的片段已成功插入pMD19-T Vector，将其提取的质粒做10倍 比稀释，测定OD值，取平均值计算拷贝数，具体计算公式如下：

其中：C标–DNA模板浓度(copies/μL)；

A–0.05，换算系数，即1OD_260nm=0.05μg/(μL双链DNA)；

N–稀释倍数；

6.02×10²³–阿佛加德罗常数。

6、荧光定量PCR

荧光定量PCR的反应体系：SsoFast EvaGreen预混液10μL，正向引物1μL、反向引 物1μL、模板DNA10ng、添加ddH₂O至20μL。

梭菌荧光定量PCR的反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s；57℃退火15s；57℃ 读取荧光信号数据，共循环扩增40次。

乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌荧光定量PCR的反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s； 55℃退火15s；55℃读取荧光信号数据，共循环扩增40次。

熔解曲线绘制，从65℃升温至95℃，每隔0.5℃读一次板，维持0.05s。

根据标准样品的拷贝数与CT值构建荧光定量PCR的标准曲线。

梭菌Real-time PCR熔解曲线，在87.5℃左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非特 异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好， 以此为基础进行定量是可靠的。对于梭菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在3.01×10⁴～ 3.01×10¹¹copies/μL范围时，梭菌Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线，该组扩 增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区基本能够汇于一起，线性范围也很宽。 质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是y=-0.3303x+13.137, 线性相关系数为0.9978，具有较好的线性关系，根据公式E=10-k-1(k-标准曲线的斜率)，算 得Real-time PCR的扩增效率为1.14，在0.8～1.2之间，扩增效率理想。

乳酸菌Real-time PCR熔解曲线，在84℃左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非特 异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好， 以此为基础进行定量是可靠的。对于乳酸菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在2.44×10⁴～ 2.44×10¹¹copies/μL范围时，乳酸菌Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线，扩 增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区能够汇于一起，线性范围比较宽。质粒 标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是y=-0.3411x+14.07,线性 相关系数为0.9978，具有较好的线性关系，根据公式E=10^-k-1(k-标准曲线的斜率)，算得 Real-time PCR的扩增效率为1.19，在0.8～1.2之间，扩增效率理想。

芽孢杆菌Real-time PCR熔解曲线，在88℃左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非 特异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好， 以此为基础进行定量是可靠的。对于芽孢杆菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在 2.18×10⁴～2.18×10¹¹copies/μL范围时，芽孢杆菌Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒 S曲线，该组扩增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区基本能够汇于一起，线性 范围也很宽。质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是 y=-0.3387x+13.152,线性相关系数为0.9974，具有较好的线性关系，根据公式E=10^-k-1(k-标 准曲线的斜率)，算得Real-time PCR的扩增效率为1.18，在0.8～1.2之间，扩增效率理想。

甲烷菌Real-time PCR熔解曲线，在82.5℃左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非 特异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好， 以此为基础进行定量是可靠的。对于甲烷菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在6.73×10³～ 6.73×10¹⁰copies/μL范围时，甲烷菌Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线，该组 扩增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区基本能够汇于一起，线性范围也很宽。 质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是y=-0.3202x+13.616, 线性相关系数为0.9974，具有较好的线性关系，根据公式E=10-k-1(k-标准曲线的斜率)，算 得Real-time PCR的扩增效率为1.09，在0.8～.2之间，扩增效率理想。

实施例2标准样品的制备

1、窖泥样品的采集

采集窖泥样品（分别采集了确定年代的100年窖龄、200年窖龄、300年窖龄的窖泥）， 样品采集后如不能及时提取DNA应立即放入-80℃冰箱保存。

2、窖泥中微生物总DNA提取方法

称取1g窖泥样品于50mL离心管，向离心管加入5mL PBS缓冲液pH7.64和8～9颗灭 菌玻璃珠,漩涡震荡5min，200×g离心5min，吸取上清液。在沉淀中加入5mL PBS缓冲液 重复洗涤两次，合并三次上清液（在冰上操作），12000rpm离心5min，取沉淀。加入1mL CTAB 抽提液（2%CTAB、5mol/L NaCl、1mol/LTris-HCl(pH8.0)、0.5mol/L EDTA）和20μL巯基 乙醇至离心管中，65℃恒温混匀仪振荡30min，加入5μL蛋白酶k（20mg/mL），37℃220r/min 30min，室温6000×g离心10min，收集上清（1mL）。

加入等体积Tris-饱和酚（500μL）与氯仿-异戊醇（体积比24︰1）（500μL），抽提一次， 12000rpm离心10min，取上清加入等体积氯仿-异戊醇（24︰1）12000rpm离心10min，取 上清，重复两次。上清液加入0.6体积预冷的异丙醇-20℃沉淀1h，12000rpm离心10min， 小心倒掉液体。沉淀用70%乙醇洗涤数次，12000r/min10min。洗涤后的DNA用吹风吹干 后TE溶解，用1.5%琼脂糖凝胶电泳验证DNA提取的效果，如果在10kb左右出现条带， 则DNA提取成功，将成功提取的DNA溶液置于-20℃冰箱保存备用。

实施例3窖泥微生物群落中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的定量分析

窖泥样品中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的定量：使用实施例2中获得的窖泥总 DNA，使用实施例1中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的特异性引物。按照实施例1中 的荧光定量PCR反应体系和PCR程序进行大曲荧光定量PCR分析。

窖泥样品中梭菌的定量：根据由梭菌标准样品荧光定量PCR得到的线性方程 y=-0.3303x+13.137(R²=0.9978)计算不同年代窖泥样品中梭菌的拷贝数，从而能够得到不同 窖龄中梭菌生物量的变化趋势（如图1所示）。

窖泥样品中乳酸菌的定量：根据由乳酸菌标准样品荧光定量PCR得到的线性方程y= -0.3411x+14.07(R²=0.9978)计算不同年代窖泥样品中乳酸菌的拷贝数，从而能够得到不同 窖龄中乳酸菌生物量的变化趋势(如图2所示)。

窖泥样品中芽孢杆菌的定量：根据由芽孢杆菌标准样品荧光定量PCR得到的线性方程 y=-0.3387x+13.152(R²=0.9974)计算不同年代窖泥样品中总芽孢杆菌的拷贝数，从而能够得 到不同窖龄中芽孢杆菌生物量的变化趋势(如图3所示)。

窖泥样品中甲烷菌的定量：根据由甲烷菌标准样品荧光定量PCR得到的线性方程y =-0.3202x+13.616(R²=0.9974)计算不同年代窖泥样品中甲烷菌的拷贝数，从而能够得到不同 窖龄中甲烷菌生物量的变化趋势(如图4所示)。