一种共固定化亚硝化细菌-反硝化细菌的方法

摘要

一种共固定化亚硝化细菌-反硝化细菌的方法，属于共固定化细胞的方法。该方法包括步骤：（1）以海藻酸钠和氯化钙先对反硝化细菌进行包埋；（2）将步骤（1）中制得的固定化小球再与亚硝化细菌和海藻酸钠混合，滴入氯化钙中进行第二次包埋；（3）将步骤（2）中制得的共固定化亚硝化-反硝化细菌接种于含有氨氮的培养基中培养，可用于氨氮的降解。优点：1、首次实现了亚硝化细菌、反硝化细菌在同一载体中的共固定化培养；2、制备共固定化小球方法简便，操作程序易于控制，制成的共固定化小球易于保存和再利用；3、通过亚硝化细菌、反硝化细菌共固定化培养，具有比传统未固定化菌种或固定化单一菌种脱氮效率高、易与水体分离、可重复利用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种共固定化细胞的方法，具体涉及一种共固定化亚硝化细菌-反硝化细菌的方法。

背景技术

近年来，许多大型企业、工厂大量地排放没有经过处理的工业污水，比如焦化废水、煤加压气化废水、氮肥废水等，导致含氮化合物的急剧增加，从而造成了严重的氮污染现象，造成水体的富营养化以及水体生态系统紊乱等一系列环境问题，如影响水中的鱼类以及一些水生生物的氧传递，造成它们的血液结合氧能力降低，致使鱼类及一些水生生物死亡，严重时甚至会破坏生态平衡。因此，氮污染问题的解决刻不容缓。

目前共固定化细胞技术在亚硝化细菌和反硝化细菌中的应用尚有待于进一步研究。

发明内容

本发明的目的是要提供一种共固定化亚硝化细菌-反硝化细菌的方法，通过共固定化细胞脱氮，与传统脱氮技术相比，具有快速、高效、可重复利用的特点。

本发明的目的是这样实现的：以亚硝化细菌、反硝化细菌液体培养的菌种为共固定化对象，采用固定化细胞技术，以海藻酸钠和氯化钙先对反硝化细菌进行包埋，将包埋后的固定化小球再与亚硝化细菌和海藻酸钠混合，滴入氯化钙中进行第二次包埋，形成共固定化亚硝化-反硝化细菌，可用于氨氮的降解。

具体步骤如下：

（1）菌种活化、液体培养：选用的菌种为亚硝化细菌和反硝化细菌两大类的亚硝化单胞菌Nitrosomonas sp.和好氧假单胞菌Pseudomonassp.，经常规方法活化后，采用含有氨氮的液体培养基培养亚硝化细菌，采用含有硝态氮的液体培养基培养反硝化细菌；

（2）第一次包埋：选取在液体培养基中长势较好的反硝化细菌，沉淀，弃上清液，加入海藻酸钠混匀，终浓度在40-45g/L。用5号注射器吸取混合液滴入19-21g/L的CaCl₂溶液中，成小球，4℃冰箱固定6h，小球用去离子水冲洗2-3遍；

（3）第二次包埋：选取在液体培养基中长势较好的亚硝化细菌，沉淀，弃上清液，加入海藻酸钠混匀，终浓度在40-45g/L，加入步骤（2）中的固定化小球，混合后用直径0.5cm-0.7cm的玻璃吸管，吸取混有菌液的固定化小球，滴入19-21g/L的CaCl₂溶液中，成小球，4℃冰箱固定4-6h，小球用去离子水冲洗2-3遍；

（4）配制模拟污水液体培养基：模拟污水液体培养基中氨氮含量为200-250mg/L，加入碳酸钙作为碳源，250mL摇瓶中加入100mL-160mL模拟污水液体培养基：按照接种量为2个/mL液体培养基，加入共固定化小球，28℃-30℃，110-140r/min摇床培养48h-60h进行亚硝化反应阶段；

（5）补加有机碳源：加入4-6g/L柠檬酸钠作为有机碳源，26℃-28℃，130-160r/min摇床培养24h-48h进行反硝化反应阶段；

（6）按照国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》测定亚硝酸盐氮、氨氮、硝酸盐氮的含量。

有益效果，由于采用了上述方案：固定化细胞技术在废水处理领域中具有巨大的优越性和发展潜力。借助于两种或两种以上的微生物在同一环境中的相互作用来实现。这样混合菌中的一些菌种能提供重要的降解酶，而其它菌种能提供表面活性剂或生长因子，使它们的生理特性可以相互补充。将不同细胞同时固定于同一载体内形成共固定化系统，综合了混合发酵和固定化技术的优点。系统稳定，可将几种不同功能的细胞和细胞器在同一系统内进行协同作用。由于亚硝化细菌的产物可作为反硝化细菌的底物，亚硝化和反硝化两阶段可在同一反应器中完成，实现短程硝化-反硝化，提高生物脱氮的效率。具体以下优点：

（1）本发明首次实现了亚硝化细菌、反硝化细菌在同一载体中的共固定化培养；

（2）制备共固定化小球方法简便，操作程序易于控制，制成的共固定化小球易于保存和再利用；

（3）通过亚硝化细菌、反硝化细菌共固定化培养，具有比传统未固定化菌种或固定化单一菌种脱氮效率高、易与水体分离、可重复利用等优点。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明：

    1、菌种：菌种为亚硝化细菌和反硝化细菌。

亚硝化细菌（Nitrosomonas sp.）、反硝化细菌（Pseudomonassp.）为在中国科学院外购的菌种，经上海生工生物公司测序鉴定后，为亚硝化细菌大类的亚硝化单胞菌Nitrosomonas sp.和反硝化细菌大类的好氧假单胞菌Pseudomonassp.：现由徐州工程学院食品微生物学实验室保藏。

2、培养基

亚硝化细菌液体培养基：4g/L (NH₄)₂SO₄、1g/L K₂HPO₄、0.5g/L MgSO₄、2g/L NaCl、0.4g/L FeSO₄，5g/L CaCO₃ 混匀溶解，pH 8.0-8.2；

反硝化细菌液体培养：2g/LKNO₃，0.2g/LMgSO₄，1g/LK₂HPO₄，1g/LKH₂PO₄，5g/L柠檬酸钠，pH 7.2-7.6；

模拟污水液体培养基：0.65g/L NH₄Cl，5g/L柠檬酸钠（后加），0.2g/L K₂HPO₄，0.1g/L MgSO₄，0.08g/L FeSO₄，2g/L CaCO₃ 混匀溶解，pH 7.5，NH₃-N浓度为206 mg/L。

实施例1：以亚硝化细菌、反硝化细菌液体培养的菌种为共固定化对象，采用固定化细胞技术，以海藻酸钠和氯化钙先对反硝化细菌进行包埋，将包埋后的固定化小球再与亚硝化细菌和海藻酸钠混合，滴入氯化钙中进行第二次包埋，形成共固定化亚硝化-反硝化细菌，可用于氨氮的降解。

具体步骤如下：

（1）菌种活化、液体培养：选用的菌种为亚硝化细菌和反硝化细菌两大类的亚硝化单胞菌Nitrosomonas sp.和好氧假单胞菌Pseudomonassp.，经常规方法活化后，采用含有氨氮的液体培养基培养亚硝化细菌，采用含有硝态氮的液体培养基培养反硝化细菌；

（2）第一次包埋：选取在液体培养基中长势较好的反硝化细菌，沉淀，弃上清液，加入海藻酸钠混匀，终浓度在40-45g/L。用5号注射器吸取混合液滴入19-21g/L的CaCl₂溶液中，成小球，4℃冰箱固定6h，小球用去离子水冲洗2-3遍；

（3）第二次包埋：选取在液体培养基中长势较好的亚硝化细菌，沉淀，弃上清液，加入海藻酸钠混匀，终浓度在40-45g/L，加入步骤（2）中的固定化小球，混合后用直径0.5cm-0.7cm的玻璃吸管，吸取混有菌液的固定化小球，滴入19-21g/L的CaCl₂溶液中，成小球，4℃冰箱固定4-6h，小球用去离子水冲洗2-3遍；

（4）配制模拟污水液体培养基：模拟污水液体培养基中氨氮含量为200-250mg/L，加入碳酸钙作为碳源，250mL摇瓶中加入100mL-160mL模拟污水液体培养基：按照接种量为2个/mL液体培养基，加入共固定化小球，28℃-30℃，110-140r/min摇床培养48h-60h进行亚硝化反应阶段；

（5）补加有机碳源：加入4-6g/L柠檬酸钠作为有机碳源，26℃-28℃，130-160r/min摇床培养24h-48h进行反硝化反应阶段；

（6）按照国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》测定亚硝酸盐氮、氨氮、硝酸盐氮的含量。

实施例2：共固定化亚硝化-反硝化细菌

1、共固定化工艺

选取在液体培养基中长势较好的亚硝化细菌，沉淀，弃上清液，按照亚硝化细菌：海藻酸钠=1：1（w/v）的比例取一定量菌体，加入海藻酸钠混匀，海藻酸钠终浓度为40-45g/L，用5号注射器吸取混合液滴入到21g/L的CaCl₂溶液中，成小球，粒径约0.3cm，4℃冰箱固定4h。小球用去离子水冲洗2-3遍。选取在液体培养基中长势较好的反硝化细菌，沉淀，弃上清液，按照每克菌体接入20个已固定好的亚硝化细菌小球，混匀，按照反硝化细菌：海藻酸钠=1：1（w/v）的比例加入海藻酸钠混匀，海藻酸钠终浓度为40-45g/L，用直径约0.5cm的玻璃管吸取小球和混合液，滴入到21g/L的CaCl₂溶液中，成共固定化小球，4℃冰箱固定4h。

2、脱氮工艺

按照接种量为2-3个/mL共固定化小球，加入到盛有140mL模拟污水液体培养基的250mL摇瓶中，pH 8.0，30℃，110-140r/min摇床培养。每4-6h测定氨氮、亚硝态氮、硝态氮含量，当亚硝态氮含量较高时，加入5g/L柠檬酸钠，继续测定氨氮、亚硝态氮、硝态氮含量。结果如下。

亚硝化反54h时氨氮含量已降至7.85 mg/L，氨氮去除率为96.19%，48h时亚硝态氮含量达到180.55 mg/L；加入柠檬酸钠后78h时亚硝态氮已降至8.25 mg/L，去除率为95.43%。

    结果表明，共固定化小球脱氮性能良好，反应速度较快。

    3、重复使用工艺

当亚硝态氮含量由最大值降低到较低值时将旧的模拟污水液体培养基倒掉，重新加入新的模拟污水液体培养基，重新培养并且测定氨氮、亚硝酸盐氮、硝态氮含量。结果如下。

随着重复使用次数增加，共固定化小球的颜色开始变透明，小球直径逐渐增大并破裂，数量逐渐减少。第四次更换培养基培养后，共固定化小球数量减少了3/4，因此共固定化小球可重复使用3-4次。

4、低温保存工艺

制备好的共固定化小球放在4℃冰箱保存7d后，加入模拟污水液体培养基培养，结果表明，低温保存后共固定化小球脱氮和亚硝态氮去除性能未发生显著变化。

以上结果表明：共固定化亚硝化-反硝化细菌制备方法简单，脱氮效率高、可重复使用，易于保存。