Survivin-MUC1融合蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种生物素（Survivin）和粘蛋白（MUC1）的融合蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。本发明还同时提供了编码所述融合蛋白的核酸分子，以及含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒；所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中序列2所示。实验证明，将本发明所提供的Survivin-MUC1融合蛋白以及经所述Survivin-MUC1融合蛋白致敏的DC免疫小鼠后，能够显著的提高小鼠血清中Survivin和/或MUC1蛋白特异性IgG抗体的水平。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物素（Survivin）和粘蛋白（MUC1）的融合蛋白及其编码基因 与应用。

背景技术

生存素（Survivin）是目前已知作用最强的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis  protein），为肿瘤生长所必需。Survivin有其进化上高度保守的凋亡抑制功能，能以特 征性的结构直接或间接抑制caspase依赖或caspase不依赖的凋亡途径，有效地对抗细 胞的凋亡过程。高表达的Survivin通过启动抗凋亡机制引起细胞增殖，肿瘤形成。 Survivin经CMyc最终阻止细胞分裂造成的端粒缩短，从而延长细胞的寿命，导致细 胞增生，永生化和癌变。

Survivin特异地表达于G2/M期，在绝大多数肿瘤组织中呈高表达，确定的有脑肿 瘤、膀胱癌、肝癌、卵巢癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、食管癌、急性白血病、乳 腺癌、淋巴瘤、胰腺癌等。而在分化成熟的正常组织中，则未见Survivin表达。这一 特性，使得靶向Survivin的免疫治疗和基因治疗能够促进肿瘤细胞的凋亡，抑制其增 殖，正常组织却能不受损伤和影响。Mesri等人把含有磷酸化缺失的Survivin突变体 （Thr34Ala）的腺病毒PADT34A于体外分别转染前列腺癌、肺癌、宫颈癌和结肠癌 细胞后都发生了自发性的凋亡，线粒体释放细胞色素C及caspase3的活性增加。相反， 用PADT34A感染正常的人类细胞，如纤维细胞、内皮细胞，其增生能力不受影响。

可见，作为一种广泛的肿瘤抗原，Survivin可以作为抗肿瘤免疫治疗的一个广泛 适用的靶基因。

MUC1是一类广泛存在于多种上皮细胞表面的糖蛋白，在介导内皮细胞与外环境 的相互作用中起着十分重要的作用。据研究发现MUC1的作用有促进肿瘤生长和生存、 参与致癌和肿瘤迁移过程、参与应激诱导凋亡及化疗因素等。MUC1正常情况下主要 表达于多种组织、器官上皮细胞近管或腺腔面，呈顶端表达，极性分布，是糖基化的 内在膜蛋白。在许多肿瘤中MUC1异常表达，主要见于唾液腺、消化道、呼吸道及生 殖道的上皮细胞来源的恶性肿瘤。在恶性肿瘤中，MUC1过度表达，失去极性分布， 表现为NH2端功能区低糖基化或糖基化紊乱，碳链缩短，暴露蛋白核心位点。这种异 常糖链表位具有肿瘤抗原相对特异性，使其成为一种潜在的肿瘤生物学标志物，目前 已用于肿瘤的诊断和生物学治疗。

MUC1在癌变时可发生质和量的改变，出现新的抗原表位。同时，MUC1也是最 先与机体免疫系统接触的细胞表面分子之一。肿瘤MUC1可以非MHC限制性和MHC 限制性方式活化CTLs，这些活化的CTLs可杀伤表达MUC1的肿瘤细胞。因此， MUC1是肿瘤主动特异性免疫治疗理想的靶分子。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物素（Survivin）和粘蛋白（MUC1）的融合蛋白及其 编码基因与应用。

本发明所提供的Survivin-MUC1融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

为了便于Survivin-MUC1融合蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基 序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL

编码所述Survivin-MUC1融合蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子 也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述Survivin-MUC1融合蛋 白的基因（命名为Survivin-MUC1）；所述基因是如下1）或2）所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列2的第3-575位DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子。

其中，序列1由191个氨基酸组成；第1-131位氨基酸为生物素（Survivin），第 132-191位氨基酸为粘蛋白（MUC1）。序列2由575个核苷酸组成，第3-575位为编 码序列，编码序列表中序列1所示的蛋白质。

下述a）-f）中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围：

a）含有所述核酸分子的重组载体；

b）含有所述核酸分子的表达盒；

c）含有所述核酸分子的重组细胞；

d）含有所述核酸分子的重组微生物；

e）含有所述核酸分子的重组病毒；

f）经所述Survivin-MUC1融合蛋白致敏的树突状细胞。

上述生物材料中，a）所述的重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。 在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述Survivin-MUC1基因转录的 启动子具体为T7启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在pET28a载体的多克隆 位点处插入所述Survivin-MUC1基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为BamH I 和Xho I。b）所述的表达盒由能够启动所述Survivin-MUC1基因表达的启动子，所述 Survivin-MUC1基因，以及转录终止序列组成。c）所述重组细胞不包括动植物繁殖材 料。d）所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。在本发明中，所述重组微生 物具体为表达所述Survivin-MUC1融合蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)。e）所述重组病毒 可为携带有所述Survivin-MUC1基因的重组腺病毒、重组腺相关病毒等。f）所述树突 状细胞可为小鼠来源（如小鼠骨髓来源）的树突状细胞或人来源（如人外周血来源） 的树突状细胞。在本发明中，所述树突状细胞为由小鼠骨髓来源的细胞经终浓度为 20ng/ml的GM-CSF，以及终浓度为20ng/ml的IL-4诱导所得。

上述Survivin-MUC1融合蛋白，或核酸分子，或上述生物材料中的至少一种在制 备下述产品中的应用也属于本发明的保护范围：提高血清中Survivin和/或MUC1蛋白 特异性IgG抗体水平的产品。

活性成分为上述Survivin-MUC1融合蛋白，或核酸分子，或上述生物材料中的至 少一种的如下产品也属于本发明的保护范围：提高血清中Survivin和/或MUC1蛋白特 异性IgG抗体水平的产品。

所述Survivin-MUC1融合蛋白的制备方法也属于本发明的保护范围。

该方法可包括如下步骤：将所述Survivin-MUC1融合蛋白的编码基因在生物细胞 中进行表达得到所述Survivin-MUC1融合蛋白；所述生物细胞可为微生物细胞、非人 动物细胞或植物细胞。在本发明的一个实施例中，所述生物细胞具体为大肠杆菌（具 体如BL21DE3）。

在上述方法中，所述Survivin-MUC1融合蛋白为序列表中序列1所示的蛋白；具 体的，所述Survivin-MUC1融合蛋白的编码基因（Survivin-MUC1基因）是如下1）或 2）所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列2的第3-575位DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子。

在本发明的一个实施例中，所述Survivin-MUC1基因具体通过重组表达载体的形 式导入所述目的大肠杆菌中；所述重组表达载体具体为在pET28a载体的多克隆位点 处插入所述Survivin-MUC1基因得到的重组质粒。

在本发明中，以上所有的所述Survivin-MUC1融合蛋白均是按照如下方法制备得 到的：将序列表中序列2所示的DNA片段替换pET28a载体的酶切位点BamH I和Xho I之间的小片段后，经原核表达得到所述Survivin-MUC1融合蛋白。

实验证明，将本发明所提供的Survivin-MUC1融合蛋白以及经所述Survivin-MUC1 融合蛋白致敏的DC免疫小鼠后，能够显著的提高小鼠血清中Survivin和/或MUC1蛋 白特异性IgG抗体的水平。

附图说明

图1为重组表达载体pET-SM的PCR鉴定电泳结果。其中，泳道M为DNA maker 2000，泳道1-7为不同克隆的PCR鉴定结果，目的条带大小约为600bp。

图2为重组表达载体pET-SM的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定电泳结果。其中， 泳道M为DNA maker2000plus，泳道1为pET-SM经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后的电 泳结果（目的条带大小约为600bp）。

图3为纯化后的Survivin-MUC1融合蛋白的Western blot检测结果。其中，泳道 M为蛋白分子量标准；泳道1为纯化后的Survivin-MUC1融合蛋白。

图4为体外诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞的鉴定结果。其中，对照组为未经诱 导的骨髓细胞；结果显示有94.7%成熟的mDC细胞表达CD11c分子，有93.8%成熟 的mDC细胞表达CD86分子，两分子的表达量均较对照组相比显著提高。

图5为ELISA检测血清中Survivin和/或MUC1特异性抗体的结果。其中，A为 第一次免疫后7天的检测结果；B为第二次免疫后7天的检测结果。A和B中，1均 为PBS DC组；2均为Survivin-MUC1融合蛋白（50μg/ml）负载DC组；3均为 Survivin-MUC1融合蛋白（100μg/ml）负载DC组；4均为Survivin-MUC1融合蛋白免 疫组（100μg/只）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

8周龄的雄性Balb/C小鼠：军事医学科学院动物中心，Cat10062。

人淋巴细胞cDNA：北京傲锐东源生物科技有限公司，Cat：10006

pET-28a质粒：Merck公司，产品目录号TB273。

抗MUC1单克隆抗体：鼠源，中杉生物科技有限公司，货号：D10001。

HRP标记的羊抗鼠IgG：中杉生物科技有限公司，货号：B20056。

GM-CSF（鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子）：北京鸿跃创新生物科技有限公司，产品 目录号：315-03。

IL-4（小鼠白细胞介素-4）：北京鸿跃创新生物科技有限公司，产品目录号：214-14。

LPS（鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子）：北京鸿跃创新生物科技有限公司，产品目录 号：315-03。

FITC标记的CD86、CD11c、CD80、CD83、HLA-DR、CD40、CD1a抗体均购 自BD公司。

NaHCO₃包被液（pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液）：1.59克Na₂CO₃（北京鸿跃创 新生物科技有限公司，产品目录号：118-02）、2.93克NaHCO3（北京鸿跃创新生物科 技有限公司，产品目录号：118-04），加蒸馏水至1000ml。

PBST：将吐温20溶于PBS磷酸盐缓冲液，使吐温20的终浓度为0.05%的体积 含量。

PBS磷酸盐缓冲液：北京鸿跃创新生物科技有限公司，产品目录号：308-04。

实施例1、Survivin-MUC1融合蛋白的制备

一、重组表达载体pET-SM的构建

以人淋巴细胞的cDNA为模板，以S-up和S-down为上下游引物进行PCR扩增， 获得Survivin基因片段；以M-up和M-down为上下游引物进行PCR扩增，获得MUC1 基因片段。

S-up：5’-acat gaaggaccac cgcatctcta-3’（序列2的第1-24位）

S-down：5’-a agcttatcca tggcagccag-3’（序列2的第375-395位的反向互补序列）

M-up：5’-ggtgtcacc tcggccccgg-3’（序列2的第396-414位）

M-down：5’-ttag tgggctgggg gggcggtgga-3’（该序列的第4-24位为序列2的第 555-575位的反向互补序列）

以回收所得的Survivin基因片段和MUC1基因片段为模板，设计如下四条引物， 通过融合PCR将扩增的Survivin-MUC1基因融合，在其引物中分别引入酶切位点 BamH I(TaKaRa：D101A)和Xho I（TaKaRa：D1094A）。

Survivin上游：5’-aggatccacat gaaggaccac-3’（下划线部分为BamH I的识别位点， 其后的序列为序列2的第1-14位）

Survivin下游：5’-ggggccga ggtgacacca agcttatcca-3’（序列2的第385-412位的反 向互补序列）

MUC1上游：5’-tggataagct tggtgtcacc tcggcccc-3’（序列2的第385-412位）

MUC1下游：5’-aa ctcgag g tgggctgggg-3’（下划线部分为Xho I的识别位点，其后 的序列为序列2的第565-575位的反向互补序列）

原核表达载体pET-28a（XhoⅠ识别位点的下游有由6个His组成的标签）用BamH I和Xho I双酶切将其线性化后,与经过同样双酶切的Survivin-MUC1融合片段于 14℃连接过夜。连接产物转入大肠杆菌DH5α中，接种LB卡那霉素抗性固体培养基 37℃培养过夜，挑取单克隆至1.5ml含有卡那霉素的LB培养基中，37℃220rpm 培养过夜，16小时后提取质粒用于PCR（所用引物为“Survivin上游”和“MUC1下 游”）、酶切和测序鉴定。

将经PCR和酶切鉴定正确的质粒（图1和图2）送样测序。将经测序表明在pET-28a 的多克隆位点BamHⅠ和XhoⅠ之间插入序列表中序列2的重组质粒命名为pET-SM。

二、Survivin-MUC1融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

1、Survivin-MUC1融合蛋白的原核表达、纯化

将步骤一中构建的重组表达载体pET-SM转化到大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)中， 用终浓度为1.0mmol/L的IPTG，在37℃诱导3h，收集菌悬液，5000g离心收集菌 体，将细菌重悬于Buffer A（终浓度为0.5mo l/L的NaCl，终浓度为20mmo l/L的 Tris-HCl，pH8.0）中，4℃条件下超声10分钟，破碎细菌，离心洗涤沉淀（包涵体）， 8mol/L尿素变性增溶，获得待纯化的粗制蛋白。

由于目的蛋白Survivin-MUC1的C端带有6个His，故而将待纯化粗制蛋白经 Ni-NTA agarose亲和柱（Merck：HB223）分离纯化，根据产品操作说明书进行。

纯化后的蛋白使用透析方法复性，尿素浓度梯度依次为6mol/L、4mo l/L、2mol/ L、1mo l/L、0.25mol/L、0.1mo l/L、0mol/L，每个浓度透析时间为12h。

2、Survivin-MUC1融合蛋白的SDS-PAGE检测及Western blot检测

PBS缓冲液（pH7.4）配方：磷酸二氢钾（KH₂PO₄）：0.27g，磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）： 1.42g，氯化钠（NaCl）：8g，氯化钾（KCl）0.2g，加去离子水约800mL,充分搅拌溶 解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。高温高压灭菌后室温保存。

样品稀释液：5g脱脂奶粉溶于100ml PBS缓冲液。

TBST（pH7.4）缓冲液：Tris（三羟甲基胺基甲烷）：12.1g，NaCl：17.5g，加蒸 馏水1500ml，加入20ml Triton X-100磁性搅拌下滴加浓HCl至pH为7.4，再加蒸馏 水至2000ml，即可。

将步骤1获得的纯化后的Survivin-MUC1融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳后 转移硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉（5g脱脂奶粉溶于100ml PBS缓冲液）封闭；加 抗MUC1单克隆抗体（用样品稀释液按照1：2000的体积比稀释），室温轻摇作用2h； TBST缓冲液洗涤3次，每次5min；加入HRP标记的羊抗鼠IgG（用样品稀释液按 照1：2000的体积比稀释），室温反应2h，同上洗涤；ECL显色。

SDS-PAGE检测结果显示，纯化后得到了单一的大小约为32KD的目的条带，与 Survivin+MUC1融合蛋白分子量相符，且无其他杂带。可见，步骤1获得的纯化后的 Survivin-MUC1融合蛋白具有较高的纯度。Western blot检测结果如图3所示，可见， 纯化后的Survivin-MUC1融合蛋白具有保持了较好的抗原性。以上结果说明步骤1获 得的纯化后的Survivin-MUC1融合蛋白满足实验需求，可用于以下实施例的动物实验。

实施例2、Survivin-MUC1融合蛋白致敏的树突状细胞的制备

一、体外诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞

取健康雄性10周龄Balb/c小鼠6只，颈椎脱位法将小鼠处死，75%乙醇浸泡10min， 无菌状态下取出股骨及胫骨，浸泡在生理盐水中，分别用5ml、2ml、1ml注射器吸取 5ml的生理盐水将股骨及胫骨中的骨髓冲出，将细胞悬液过200目筛网，去除多余的 脂肪及组织后1500rpm×10min，弃上清，加入2ml红细胞裂解液，将细胞混匀，于4 ℃反应15min。加入40ml生理盐水混匀，1500rpm×10min，弃上清，重复2次，弃上 清，加入5ml RPMI-1640培养基（北京茂健联星生物科技有限公司）将细胞混匀，取 出部分细胞计数，调整细胞浓度为1.0×10⁶个/ml，将细胞铺入6孔板中，每孔2ml培 养基。于CO₂培养箱中培养2h，2h后，弃培养上清，用生理盐水洗一次，每孔加入 含有细胞因子的RPMI-1640培养基，细胞因子的终浓度分别为：GM-CSF（20ng/ml）、 IL-4（20ng/ml），37℃、CO₂培养箱培养，此时计为d0天，d2、d5天分别半量换液， 并在d5天对诱导后的细胞进行鉴定和计数。方法如下：采用1000r/min离心10min， 分别收集上述培养的细胞，再用含0.1%（0.1g/100ml）BSA的PBS冲洗封闭细胞一 次，离心去上清后将细胞浓度调整为1.0×10₆个/ml，重悬于1.5mL的EP管中，分别 加入2μL荧光标记的抗体（FITC标记的CD80、CD86、CD83、HLA-DR、CD11c、 CD40、CD1a抗体），常温下染色20min，离心并取300μL的PBS把染色后的细胞转 移于流式管，用于流式细胞仪检测，软件WinMDI2.9分析数据。实验同时设置未经 诱导的骨髓细胞作为对照组。

对细胞的鉴定结果显示所示，经成熟诱导后的细胞，高表达HLA-DR、CD40、 CD80、CD86、CD83、CD11c、CD1a，其中CD86和CD11c的表达量较诱导前（即对 照组）有显著提高（图4）。可见经上述条件诱导已获得成熟的小鼠骨髓来源的树突 状细胞。

二、Survivin-MUC1融合蛋白致敏的树突状细胞的制备

将步骤一获得的小鼠骨髓来源的树突状细胞按照1×10₆个细胞/孔的用量进行6孔 板铺板。分为3组，向其中一组中加入终浓度为50μg/ml的Survivin-MUC1融合蛋白， 向其中的另一组加入终浓度为100μg/ml的Survivin-MUC1融合蛋白，其余的一组不加 Survivin-MUC1融合蛋白，作为对照组。待Survivin-MUC1融合蛋白与细胞孵育12-16 小时后，加入终浓度为100ng/ml的LPS（没加蛋白的对照组也同时加入），孵育16-24 小时后，收集各组DC细胞，并计数，准备用于免疫小鼠。

实施例3、用Survivin-MUC1融合蛋白致敏的树突状细胞以及Survivin-MUC1 融合蛋白免疫小鼠

用实施例1制备得到的Survivin-MUC1融合蛋白和实施例2制备得到的 Survivin-MUC1融合蛋白致敏的树突状细胞免疫小鼠，通过ELISA的方法分析小鼠血 清中Survivin和/或MUC1特异性IgG抗体的产生情况。

一、小鼠免疫

实验分组及各组的免疫情况见表1。融合蛋白或树突状细胞溶于PBS中，分别于 第0天和第8天各注射1针，每只小鼠每次皮下注射100微升。

表1小鼠免疫实验的分组及各组的免疫情况

二、ELISA检测血清中抗体水平

在步骤一第一次免疫后7天和第二次免疫后7天分别取小鼠尾血，采用ELISA的 方法分析小鼠血清中Survivin和/或MUC1特异性IgG抗体的产生情况。具体操作如下：

以MUC1合成肽（序列3）、Survivin+MUC1蛋白（包被用量均为200ng/孔，用 pH9.6的NaHCO₃包被液稀释）分别4℃包被过夜，封闭液（PBS+3g/100ml的BSA） 封闭2小时后，PBST洗涤4次；将小鼠血清按体积比1：25进行稀释，37℃孵育1h； PBST洗涤4次，每次5分钟；加羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记IgG抗体（Sigma，按 1:4000稀释），37℃孵育1h。每孔加入底物TMB，37℃避光显色5-15min，每孔加入 50μl终止液（2mol/L H2SO4）终止显色，置于450nm测定每孔光密度值。各组中每只 小鼠每个稀释度的血清设置3个复孔，同时以未经注射的健康小鼠的血清作为阴性对 照。

一次免疫后7天的ELISA检测结果如图5中A所示，Survivin+MUC1融合蛋白 免疫小鼠产生较强的特异性免疫抗体，而融合蛋白致敏的DC细胞免疫的小鼠与对照 相比没明显差异。第二次免疫后7天的ELISA检测结果如图5中B所示，第二次免疫 后，与融合蛋白免疫的小鼠相似，融合蛋白致敏的DC细胞免疫小鼠也产生了特异抗 体。以上结果表明，通过两次免疫，融合蛋白致敏的DC在小鼠机体产生了与融合蛋 白相似的体液免疫反应。由于致敏的DC还可诱发机体产生针对融合蛋白的T细胞免 疫反应；所以在实际应用中，可以通过外周血分离肿瘤病人DC，用肿瘤特异蛋白 Survivin-MUC1在体外致敏DC，回输病人，从而诱导机体产生针对肿瘤细胞的特异性 体液反应和细胞免疫反应，杀死肿瘤细胞。