吉尔吉斯白桦的BkERF1基因及编码蛋白

摘要

吉尔吉斯白桦的BkERF1基因及编码蛋白，它涉及桦的BkERF1基因及编码蛋白。吉尔吉斯白桦的BkERF1基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明吉尔吉斯白桦BkERF1基因cDNA序列全长为1390bp，编码328个氨基酸，本发明的BkERF1基因转入拟南芥中，结果表明转基因株系生长好于野生型(WT)株系，表现出过表达BkERF1基因的株系比野生型(WT)株系抗性生长的差别，说明白桦BkERF1基因能够提高植物对碱性盐(NaHCO3)胁迫的抗性，为抗碱性盐植物分子育种准备了基因条件。

说明书

技术领域

本发明涉及白桦的BkERF1基因及编码蛋白。

背景技术

乙烯应答因子ERF是植物转录因子(AP2／EREBP)家族中的一员，其ERF蛋白含有 高度保守的AP2结构域，ERF转录因子与细胞发育、激素、抗病、低温、干旱、高盐等 信号传递有关，在调控植物生长发育和逆境胁迫中表现出一定的应答响应。是植物生长 发育和胁迫应答反应的重要调控因子。

发明内容

本发明的目的是提供吉尔吉斯白桦的BkERF1基因及编码蛋白。

本发明中吉尔吉斯白桦的BkERF1基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明中吉尔吉斯白桦的BkERF1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所 示。

本发明吉尔吉斯白桦BkERF1基因cDNA序列全长为1390bp，编码328个氨基酸， 本发明的BkERF1基因转入拟南芥中，过表达该基因的株系和野生型(WT)萌发后在碱性 盐(NaHCO₃)下胁迫生长试验，结果表明转基因株系生长好于野生型(WT)株系，表现出过 表达BkERF1基因的株系比野生型(WT)株系抗性生长的差别，说明白桦BkERF1基因能够 提高植物对碱性盐(NaHCO₃)胁迫的抗性，为抗碱性盐植物分子育种准备了基因条件。

附图说明

图1为本发明中吉尔吉斯白桦叶片总RNA的电泳图；

图2为本发明中PCR扩增得到全长cDNA电泳图，M为λDNA/HindIII酶切Marker， 1为PCR产物电泳；

图3为本发明中吉尔吉斯白桦的全长核苷酸序列ORF分析结果图；

图4为本发明中吉尔吉斯白桦的BkERF1基因编码氨基酸的同源性比对结果图；

图5为本发明中表达载体pBI121-BkERF1酶切鉴定电泳图，M为DL2000Marker，1， 2和3泳道为质粒DNA；

图6为本发明中无胁迫转基因植株的图；

图7为本发明中1.5mM NaHCO₃胁迫转基因植株的图；

图8为本发明中3mM NaHCO₃胁迫转基因植株的图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任 意组合。

具体实施方式一：本实施方式吉尔吉斯白桦的BkERF1基因的核苷酸序列如SEQ ID  No：1所示。

具体实施方式二：本实施方式吉尔吉斯白桦的BkERF1基因编码蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID NO：2所示。

吉尔吉斯白桦的BkERF1基因的编码区在117bp-1103bp。

吉尔吉斯白桦的BkERF1基因的核苷酸序列的获得：

1、向2.0mL的离心管中加入900μL无水乙醇、100μLβ-巯基乙醇混匀放在冰上预冷， 取吉尔吉斯白桦的叶片0.5g，迅速加液氮冷冻研磨成细粉状，分装加入离心管中，震荡 2min，4℃，13000r/min离心5min，吸出上清；向离心管中加入CTAB提取缓冲液600μL， 100μLβ-巯基乙醇，65℃水浴中预热5min；加入350μL苯酚，350μL氯仿，震荡5min， 4℃，13000r/min，离心10min，取上清，向其中加入700μL的氯仿，震荡5min，4℃， 13000r/min，离心5min；取上清，加入等体积的5mol/L LiCL，1/2体积的无水乙醇，混 匀，冰上沉淀10min，4℃，13000r/min，离心10min；去上清；用冰浴的体积分数为75% 的乙醇400μL洗涤沉淀；离心5min，去上清，空气中干燥沉淀；加50μL的DEPC水溶 解RNA；1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，见图1，紫外分光光度法进行纯度 检测，A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.8-2.0之间，检测质量合格，送交华大基因进行转录组测序。测 序分析获得白桦ERF序列信息。经过比对拼接，即得到完整的吉尔吉斯白桦BkERF1基 因序列。

2、用上述CTAB法提取白桦叶片RNA，取1μg总RNA进行反转录，按照东洋纺生 化部反转录试剂盒反转录成总cDNA，作为模板，根据完整的吉尔吉斯白桦BkERF1基因 序列设计全长PCR扩增引物，F1：5'-GCAGTCTGTCAACGTTCACACCAAAG-3'，R1： 5'-CCGCCATCGCCTCAACAAACTATAT-3'，进行PCR扩增，反应体系50μL，成分如下：

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35 个循环，最后72℃延伸10min。

采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并回收目的基因片段，获得吉尔吉斯白 桦BkERF1基因cDNA产物，特异产物大小1390bp与预期片段长度相符，见图2。取PCR 产物2μL，1μL pMD18-T，5μL Slusion I连接酶，加无菌水2μL至反应体积10μL，16℃ 连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素平板上进行蓝白斑筛选阳性菌落。 单克隆摇菌，菌液送交华大基因公司测序鉴定。对全长核苷酸序列ORF分析结果如图3； 使用NCBI上的Blast程序进行氨基酸同源性比对，结果与葡萄（Vitis vinifera）同源性达 60%（见图4）。

3、植物表达载体的构建及转化植株鉴定，在cDNA的ORF的5'和3'端引入BmaHI 和SacI酶切位点，设计增设酶切位点的引物：

F2：5'-GGATCCATGATTTGGCCAAACAAAT-3'，

R2：5'-GAGCTCTTATCTTGAGTCTCTCCTG-3'，扩增目的基因片段。

反应体系

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸90s，共35 个循环，最后72℃延伸10min。

然后分别对PCR产物与pBI121质粒进行BmaHI和SacI酶切，回收DNA片段与载 体，用T4-DNA连接酶连接构建植物表达载体pBI121-BkERF1，酶切鉴定(见图5）。酶切 体系补齐。酶切体系：

将植物表达载体pBI121-BkERF1电转化至农杆菌EHA105菌株中，利用真空渗入法 转入拟南芥，在含有卡那霉素的1/2MS培养基上筛选转基因拟南芥，将T0代种子播种在 卡那霉素筛选平板上，收获T1代种子，然后T1种子卡那霉素筛选抗性播种收获T2代种 子，转基因T2代种子和WT在1/2MS平板上萌发，培养7天后移栽在1/2MS+碱性盐 (NaHCO₃)培养基上对NaHCO₃进行抗性的试验分析，结果表明转基因株系生长好于野生 型(WT)株系，说明在NaHCO₃胁迫下生长的转基因株系比野生型表现出一定的抗性（图6、 图7、图8），过表达BkERF1基因能够提高植物对碱性盐(NaHCO₃)的抗性，BkERF1基因 的克隆为抗性分子植物育奠定了基础。