一种青梅感冒片的制备方法及其在抑制睾丸间质细胞瘤细胞MLTC-1细胞增殖药物中的应用

摘要

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种青梅感冒片的制备方法及应用。本发明的青梅感冒片的制备方法，由青蒿200g、五指柑267g、香薷134g、狗肝菜200g、甘草134g、积雪草134g、岗梅267g作为原料药制成，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，使得甘草酸含量有很大提高。本发明还提供了青梅感冒片在制备抑制小鼠睾丸间质细胞瘤细胞MLTC-1细胞增殖药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种青梅感冒片的制备方法及其在抑制小鼠睾丸间质细胞瘤细胞MLTC-1细胞增殖药物中的应用。 

背景技术

青梅感冒颗粒标准号WS-11318(ZD-1318)-2002，记载于国家中成药标准汇编内科脾胃分册。由青蒿200g、五指柑267g、香薷134g、狗肝菜200g、甘草134g、积雪草134g、岗梅267g作为原料药制成，具有清凉解热的功效。用于风热感冒，头痛，咳嗽，鼻塞。 

现有技术中，尚未有青梅感冒颗粒在提取制备方面采用超临界和微波技术的报道，而挥发油提取，水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。 

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种青梅感冒片的制备方法。 

本发明的另一个目的在于提供一种青梅感冒片在制备抑制小鼠睾丸间质细胞瘤细胞MLTC-1细胞增殖药物中的应用。 

本发明的目的是通过如下的方案实现的： 

一种青梅感冒片的制备方法，由青蒿200g、五指柑267g、香薷134g、狗肝菜200g、甘草134g、积雪草134g、岗梅267g作为原料药制成，所述的制备方法由下列步骤组成：取青蒿、香薷，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO₂流量l-3ml/g生药·min，萃取时间180-220min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Dl01大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成150片，每片重0.3g。 

上述的青梅感冒片的制备方法中，所述CO₂超临界萃取中夹带剂占总萃取溶剂的体积百 分比为5%。 

上述的青梅感冒片的制备方法中，所述CO₂超临界萃取中萃取压力为25MPa。 

上述的青梅感冒片的制备方法中，所述CO₂超临界萃取中萃取温度为60℃。 

上述的青梅感冒片的制备方法中，所述CO₂超临界萃取中CO₂流量2ml/g生药·min。 

上述的青梅感冒片的制备方法中，所述CO₂超临界萃取中萃取时间为200min。 

上述的青梅感冒片的制备方法中，所述微波萃取功率为700W。 

上述的青梅感冒片的制备方法中，所述微波萃取每次萃取时间为8分钟。 

上述的青梅感冒片在制备抑制小鼠睾丸间质细胞瘤细胞MLTC-1细胞增殖药物中的应用。 

现有技术中，青梅感冒颗粒每次1袋，每袋15g，一日2-3次。青梅感冒颗粒服药量大，且颗粒剂制备需要加大量的糖，糖尿病患者不适宜，不加糖的话味道不佳，患者不容易服下，依从性差。采用本发明方法制备成的青梅感冒片每片重0.3g，每次仅需2片，一日服用2-3次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。且制备成片剂，患者随水吞下即可，服药量小且无苦味，患者易于接受。 

试验一、不同方法制备的青梅感冒片中甘草酸含量的比较 

l、仪器及试药本发明青梅感冒片：按实施例1方法制备，使用1510g原料药，经提取制成150片，每片重0.3g。原青梅感冒颗粒，按照WS-11318(ZD-1318)-2002标准方法制备。Agilent1200高效液相色谱仪；METTLER AE240电子分析天平；甘草酸对照品（中国药品生物制品检定所）。 

2、方法 

照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定。 

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇－0.2mol/L醋酸铵溶液－冰醋酸（67∶33∶1）为流动相；检测波长为250nm。理论板数按甘草酸峰计算应不低于3000。 

对照品溶液的制备精密称取甘草酸单铵盐对照品适量，加90％甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，即得。 

供试品溶液的制备取本发明的青梅感冒片，研细，取0.08g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入90％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量， 用90％甲醇补足减失的重量，离心，上清液用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。 

对照产品供试品溶液的制备取本对照的青梅感冒颗粒，研细，混匀，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入90％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用90％甲醇补足减失的重量，离心，上清液用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。 

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。3、结果 

结果表明，本发明青梅感冒片中甘草酸的含量为35-70mg/片；而原青梅感冒颗粒中甘草酸的含量为14.5mg/袋，每次服用量2片的甘草酸含量为原颗粒剂含量的5-10倍，在服用量减少的情况下，甘草酸含量有很大提高。 

上述研究表明，采用本发明制备方法制备的青梅感冒片，有效成分含量远远高于WS-11318(ZD-1318)-2002标准记载的方法制备的青梅感冒颗粒。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 

实施例1 

取青蒿200g、五指柑267g、香薷134g、狗肝菜200g、甘草134g、积雪草134g、岗梅267g，将青蒿、香薷加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40℃，CO₂流量2ml/g生药·min，萃取时间200min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到Dl01大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成150片，每片重0.3g。 

经检测，成品中甘草酸的含量为69.8mg/片。 

实施例2 

取青蒿200g、五指柑267g、香薷134g、狗肝菜200g、甘草134g、积雪草134g、岗 梅267g，将青蒿、香薷加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力30MPa，温度50℃，CO₂流量3ml/g生药·min，萃取时间180min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分钟，合并萃取液，浓缩，加到Dl01大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成150片，每片重0.3g。 

经检测，成品中甘草酸的含量为56.2mg/片。 

实施例3 

取青蒿200g、五指柑267g、香薷134g、狗肝菜200g、甘草134g、积雪草134g、岗梅267g，将青蒿、香薷加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力15MPa，温度30℃，CO₂流量1ml/g生药·min，萃取时间220min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Dl01大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成150片，每片重0.3g。 

经检测，成品中甘草酸的含量为36.9mg/片。 

实施例4：青梅感冒片抑制小鼠睾丸间质细胞瘤细胞MLTC-1细胞增殖的实验研究资料 

1.实验材料 

1.1实验用细胞株 

小鼠睾丸间质细胞瘤细胞MLTC-1细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。 

1.2实验药物 

研究药物：本发明青梅感冒片：按实施例1方法制备。 

药液储液：称取100mg青梅感冒片，溶于5ml无水乙醇中，0.2μm滤器过滤，500μldoff管分装，-20℃存储，同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。 

1.3实验试剂 

DMEM(GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137)；胎牛血清（浙江天杭生物科技 有限公司Lot.No.100419）；NaHC0₃(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387)；Trypsin（AMRESCO公司）；EDTA（AMRESCO公司）；Penicillin G Sodium Salt（AMRESCO公司1）；Streptomycin Sulfate(AMRESCO)；无水乙醇（淄博亚杜兰经贸有限公司）；MTT(Biosharp批号：0793)：PBS（实验室自配）； 

1.4实验器材 

莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DMIL）；可见-紫外光微孔板检测仪（美国MD公司型号：SPECTRAMAX190）；C0₂培养箱（FORMA型号：3111）；超净台（苏净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD）；纯水仪（美国Sprlng公司型号：S/N020579）；精密移液器（法国吉尔森公司型号：P2）；电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S）；全自动高压灭菌锅（日本SANYO公司型号：MLS-3020）；台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号：DHG9123A)；冰箱(西门子公司型号：KG18V21TI)；液氮罐（CBS型号：2001）；低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000）；0.2μm滤器（MILLIPORE型号：SLGP033RB）；1cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。 

2.实验方法 

1)MLTC-1细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%C0₂进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3×10⁴个/ml。 

2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μl，培养板放入细胞培养箱中(37℃，5%C0₂)常规培养。 

3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入青梅感冒片溶液，继续培养24h。 

4)24h后加入20μl MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。 

5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔如入200μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。 

6)同时设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。 

7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率(%)=（对照孔OD值-给药孔OD值）、对照孔OD值×100%。实验重复3次。 

3.统计处理 

采用Microsoft Excel2007软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean±S.D.表示。 

4.实验结果 

MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对MLTC-1细胞增殖抑制有差异(P<0.05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P<0.01)，当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P<0.001)。 

表1青梅感冒片对MLTC-1细胞增殖抑制影响研究(X±SD) 

组别 药物浓度（mg/ml） 抑制率（%） 对照组 0 0 1 5 10.01±6.26 2 10 19.68±13.12* 3 15 35.19±17.64** 4 20 48.61±15.22**

注：与对照组比较，*P<O.01；**P<0.001。 

5.实验结论 

本发明的青梅感冒片可以抑制MLTC-1细胞增殖，减少MLTC-1细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。