检测抗甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白的天然双特异性抗体的试剂盒

摘要

本发明涉及一种检测抗甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白的天然双特异性抗体的试剂盒，属于临床检验学领域。本发明通过对患者血清，疾病对照血清和健康对照血清进行检测发现，抗TPO和Tg的双特异性抗体在患者中的检出率明显高于对照组，并具有统计学意义。本发明的优点是：本发明所描述的试剂盒的检测方法提供了一种简单易行的双特异性抗体检测模式，可以推广应用于各种双特性抗体的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测抗甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白的天然双特异性抗体的试剂盒，属于临床检验学领域。 

背景技术

人们所熟知的抗体（Antibody,Ab），是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构，X射线晶体衍射呈“Y”型构造。每个抗体分子具有两个完全相同的由轻链可变区和重链可变区构成的抗原结合单位（Antigen binding fragment,Fab）。双特异性抗体（Bispecific antibody,BsAb）则是一个崭新的抗体概念，是指含有两个不同抗原结合位点的免疫球蛋白分子，最先的提出是指人工合成的抗肿瘤药物，而非天然存在。1999年，荷兰学者Schuurman等采用放免方法，在同时接受屋尘螨（House dust mite）和花粉（Grass pollen）脱敏注射治疗的过敏性疾病患者的血清中，发现了一种可同时结合上述两种变应原的BsAb，提示双特性抗体可在人体中自发产生，随后的研究进一步提示天然的双特异性抗体可能普遍存在于长期受免疫原刺激的多种疾病中。然而，究竟人类有哪些疾病可以产生此类抗体，这种人体内产生的天然BsAb与人类疾病或某些病理生理过程具有怎样的联系，目前国内外尚无相关报道，因此其相关检测尚未纳入临床常规检测，相关的检测试剂盒也未上市。 

桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)是一种常见自身免疫性疾病，多见于30～50岁女性，起病隐匿，发展缓慢病程较长，大部分病人在开始无症状，最早症状为乏力，随着病情的发展，可出现甲状腺功能减退及粘液水肿表现。该病的一个典型诊断要点为患者体内长时间存在高滴度的抗甲状腺过氧化物酶抗体（anti-thyroid peroxidase antibodies,anti-TPO）和抗甲状腺球蛋白抗体（anti-thyroglobulin antibodies,anti-Tg），说明该疾病患者在长病程内受到多种抗原（TPO和Tg）的同时刺激。但关于桥本甲状腺炎患者体内是否含有天然双特异性抗体，并没有过研究和报道。 

目前，对于天然双特异性抗体的研究仍不太多，检测方法基本沿用Schuurman等建立的放射免疫测定法。这种检测方法敏感性和特异性均较高，但是存在明显的不足，其检测过程使用了放射性元素，具有一定的生物危害性，且检测需要特殊的仪器设备和专业的操作人员，不利于推广。目前放射免疫测定方法在临床上已较为少用，而被更为简单易行、无污染、易推广的酶联免疫测定法（ELISA）和其他检测方法所取代。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测抗甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白的天然双特异性抗体的试剂盒。 

本发明要解决的另一个技术问题是提供上述试剂盒的应用。 

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 

一种检测抗甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白的天然双特异性抗体的试剂盒，由以下试剂组成： 

（1）人甲状腺球蛋白包被微孔板； 

（2）免疫标记的人甲状腺过氧化物酶； 

（3）洗涤液：含0.05%吐温-20的PBS溶液； 

（4）稀释液：含体积百分比为20%的小牛血清的PBS； 

（5）底物液：3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺； 

（6）阳性对照液：含抗甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白双特异性抗体的血清； 

（7）阴性对照液：健康人血清； 

（8）终止液：0.5M硫酸。 

所述（1）人甲状腺球蛋白包被微孔板的包被条件是：每个微孔加入100μL浓度为1-10μg/ml的人甲状腺球蛋白溶液，4℃包被过夜。 

所述（2）免疫标记为酶标记、荧光素标记或生物素标记。 

所述酶标记为辣根过氧化物酶标记或碱性磷酸酶标记。 

所述（2）免疫标记的人甲状腺过氧化物酶的使用浓度为100μL/孔。 

所述（6）阳性对照液为含抗甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白的天然双特异性 抗体的桥本甲状腺炎患者血清。 

所述的试剂盒在检测抗甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白的双特异性抗体中的应用。例如用于检测人工合成的抗甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白的双特异性抗体的含量，这类人工合成的双特异性抗体可能作为诊断试剂或治疗药物用于未来的医学研究和/或药物开发。 

所述的试剂盒在检测抗甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白的天然双特异性抗体中的应用。本试剂盒可以检测那些在患者血清中含有此类天然双特异性抗体的疾病，尤其是当该双特异性抗体被证明为某疾病的检测指标物质时，可极大提高检测效率。 

所述的试剂盒在检测桥本甲状腺炎中的应用。本发明意想不到地发现，在桥本甲状腺炎患者的血清中特异性地存在天然抗甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白的天然双特异性抗体。通过对桥本甲状腺炎患者血清，疾病对照血清和健康对照血清进行检测发现，抗TPO和Tg的双特异性抗体在桥本甲状腺炎患者中的检出率明显高于对照组（疾病对照和健康对照），并具有统计学意义，且不同甲状腺功能状态的患者天然双特异性抗体的水平也有统计学意义。因此，本发明人所发现的双特异性抗体可以看作是存在于桥本甲状腺炎患者血清中的一种新型指标，且这类新型指标与患者甲状腺功能状态有关。 

本发明试剂盒的简要检测程序为： 

（1）采用人甲状腺球蛋白（人Tg蛋白）包被微孔板作为固相抗原； 

（2）加入血清样本进行温育； 

（3）加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的人甲状腺过氧化物酶（TPO）； 

（4）加显色底物； 

（5）终止读数。 

本发明的优点：本发明提供了一种双抗原夹心法的酶联免疫检测试剂盒，使用方便，操作简单，特异性强，安全，可用于检测抗TPO和Tg的双特异性抗体的及桥本甲状腺炎。 

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行说明，以使公众更好地理解本发明内容及应用，并不以任何方式造成对本发明的限定。凡依照本发明公开内容所做的任何等同替换，均属于本发明保护范围。 

附图说明

图1为双特异性抗体在桥本甲状腺炎患者、疾病对照患者和正常然血清中的分布图，图中HT表示丙型肝炎患者血清，DC表示疾病对照患者血清，HC表示健康人血清。 

图2为不同甲状腺功能状态的桥本甲状腺炎患者中，双特异性抗体的分布图，图中E表示官能正常组，sH表示亚临床甲减组，H表示临床甲减组。 

具体实施方式

以下为实施例中涉及的主要材料和试剂： 

人甲状腺球蛋白（人Tg蛋白），Prospec，英国 

辣根过氧化物酶（HRP）标记的人甲状腺过氧化物酶（人TPO蛋白），北京义翘神州生物技术有限公司，中国 

十二水磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O），北京化学试剂公司，中国 

二水磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O），北京化学试剂公司，中国 

磷酸二氢钾（KH₂PO₄），北京化学试剂公司，中国 

氯化钠（NaCl），北京化学试剂公司，中国 

氯化钾（KCl），北京化学试剂公司，中国 

碳酸氢钠（NaHCO₃），北京化学试剂公司，中国 

碳酸钠（Na₂CO₃），北京化学试剂公司，中国 

小牛血清，GIBCO，新西兰 

96孔酶标板，Nunc,丹麦 

吐温-20（Tween-20），SIGMA，美国 

3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺（TMB），SIGMA，美国 

抗体测定溶液配制 

（1）磷酸盐缓冲（PBS）溶液：NaCl8g，Na₂HPO₄.12H₂O3.63g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g，去离子水800mL，充分溶解后用1M HCl调节溶液的pH值至7.4，加去离子水定容至1L，高压灭菌后保存。 

（2）洗涤缓冲液PBST（洗板用）：PBS1L，Tween-20500μL，搅拌混匀，每次使用前新鲜配制。 

（3）稀释液：PBS80mL，小牛血清20mL，充分混匀，每次使用前新鲜配制。 

实施例1：检测抗TPO和Tg双特异性抗体的试剂盒 

一.试剂盒组成 

1.人甲状腺球蛋白（人Tg蛋白）包被微孔板； 

2.辣根过氧化物酶标记的人甲状腺过氧化物酶（HRP标记的人TPO蛋白）：北京义翘神州生物技术有限公司，中国； 

3.洗涤液（PBST）：含0.05%吐温-20的PBS溶液；（1L PBS中加入500μL Tween-20，充分混匀） 

4.稀释液：含20%（v/v）小牛血清的PBS； 

5.底物液：3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺（TMB）； 

6.阳性对照液：含抗甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白的天然双特异性抗体的桥本甲状腺炎患者血清； 

7.阴性对照液：健康人血清； 

8.终止液：0.5M硫酸。 

二.人甲状腺球蛋白包被微孔板制备的条件及方法： 

A：微孔板：Nunc，96孔板，丹麦； 

B：包被缓冲液：磷酸盐包被缓冲液（pH7.4），NaCl8g，Na₂HPO₄.12H₂O3.63g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g，去离子水800mL，充分溶解后用1M HCl调节溶液的pH值至7.4，加去离子水定容至1L，高压灭菌后保存； 

C：人Tg蛋白包被浓度：5μg/ml（大于1μg/ml均可进行包被，一般选择1-10μg/ml，可根据实际情况进行调整）； 

D：包被条件：4℃过夜； 

包被条件：每个微孔加入100μL浓度为5μg/ml的人Tg蛋白溶液，4℃包被过夜； 

E：封闭：含20%（v/v）小牛血清的PBST，每孔200μL，37℃温育2小时。 

实施例2：抗TPO和Tg双特异性抗体的检测 

一.材料 

1.实施例1所述的试剂盒 

2.血清：136份桥本甲状腺患者血清，92疾病对照血清（包括甲亢23例、甲减20例、甲状腺结节22例、甲状腺肿20例、甲状腺癌7例），99例健康人血清。分析前均储存于-80℃。 

二.方法 

1.双抗原夹心法检测抗TPO和Tg的双特异性抗体 

（1）测定前，所有材料和试剂均平衡至室温。 

（2）用加样枪吸取100μL血清加入到试剂盒提供的人Tg蛋白包被微孔板中，每个样本均做复孔，37℃温育1小时； 

（3）洗涤液（PBST）洗涤3次，拍干。 

（4）HRP标记的人TPO蛋白用稀释液进行1:500稀释，充分混匀后加入各微孔（100μL/孔），37℃温育1小时； 

（5）每孔加入100μL底物液，37°显色30分钟。 

（6）每孔加入50μL终止液终止反应。 

（7）读数：用双波长450nm/630nm测定各孔OD值。 

2.临界值（cut-off值）的确定 

采用阴性人群测定的方法确定cut-off值，为提高检测特异度，以正常人血清OD均值+10SD作为阳性判定值。 

三.结果 

1.双特异性抗体测定 

该测定中，以包被于微孔板上的人Tg蛋白为固相抗原，HRP标记的人TPO蛋白为检测抗原，检测桥本甲状腺炎患者血清中抗TPO和Tg的天然双特异性抗体。疾病对照患者血清（DC）和正常人血清（HC）作为对照。检测结果见图1和图2。 

图1为双特异性抗体在桥本甲状腺炎患者血清（136例），疾病对照患者血清（92例）和正常人血清（99例）中的分布图。图1结果显示，桥本甲状腺炎患者血清（HT组）中特异性地存在抗甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白的天然双特异性 抗体，该双特异性抗体可以作为桥本甲状腺炎的特异性检测指标。 

图2为不同甲状腺功能状态的桥本甲状腺炎患者中，双特异性抗体的分布图。图2结果显示，不同甲状腺功能状态的患者天然双特异性抗体的水平具有统计学意义，甲状腺功能异常患者天然双特异性抗体检出率较官能正常组高，双特异性抗体的水平与桥本甲状腺炎患者甲状腺功能状态相关。 

2.临界值的确定 

样本OD≥0.116判定为阳性，否则为阴性(注：该临界值基于本研究中99份正常人标本数据，推广应用时可根据具体人群进行调整)。