一种基于炎症反应的抗动脉粥样硬化药效评价方法

摘要

一种基于炎症反应的抗动脉粥样硬化药效评价方法，其特征在于，经过以下步骤：步骤1，将平滑肌细胞以种植于Millicellinsert的PE膜外侧，8h待细胞贴壁后翻转；步骤2，在膜的内侧面种植内皮细胞，共培养6天；步骤3，接种单核细胞THP-1，加入oxLDL，IL-1及受试药物，培养24小时。步骤4，检测以下项目中的任何一项：检测内皮细胞中的MCP-1，TNFα的含量；单核细胞表面CD36的含量；平滑肌细胞中的MDA，MMP2的含量，观察平滑肌细胞骨架的变化；观察内皮细胞ICAM-1的表达。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种药物的药效评价方法，特别涉及一种基于炎症反 应的抗动脉粥样硬化药效评价方法。

背景技术：

关于动脉粥样硬化(AS)的发病机制曾有以下几种学说：脂质浸润 学说、血小板聚集和血栓形成学说、单克隆平滑肌细胞增生学说及免 疫学说和损伤反应学说，其中损伤反应学说和由此发展而来的炎症理 论，较为全面地解释了AS的形成发展过程。目前认为，AS从发生 发展到转归的全过程就是一个慢性的炎症过程，众多炎症细胞和炎症 介质参与其中，但炎症参与AS过程的作用机制至今尚未完全阐明， 目前研究主要集中于各种炎症细胞、炎症介质的作用及相互关系方 面。

AS病灶内存在内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、平滑肌细胞和肥大 细胞等主要细胞，目前研究较多且与AS发生和发展关系较为密切的 炎症细胞是单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞。

在AS发病过程中，补体系统的参与也促进了炎症反应。现已在AS 病灶中发现了C1～9等补体固有成分以及多种补体活化片段，尤其 是补体活化终末攻膜复合物C5b9(MAC)存在于所有增厚的动脉内膜 及纤维斑块中。CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着于细胞膜表 面的补体调节蛋白，其在调节MAC装组中发挥着关键作用。最近研 究表明，较对照组相比CD59与ApoE基因共敲除小鼠发生AS的进 程加速，而此效应在内皮细胞过度表达CD59时被削弱，研究者证实 MAC有促AS作用，而CD59则抑制AS，提示抑制MAC形成可能 是一种抗AS疗法。

随着研究的深入，已发现越来越多的炎症介质参与了AS的发生与 发展。各种炎症细胞通过相关的细胞因子、黏附分子等炎症介质相互 关联、相互作用，从而构成了复杂的网络，它们级联放大了炎症反应， 共同促进了AS的进展。如：C反应蛋白(CRP)，黏附分子，MCP-1， IL-6，TNF-α，salusins，除上述炎症介质以外，目前已经发现与AS 关系较密切炎症介质还有IL-2、IL-4、IL-10、IL-18、IFN-γ、TGF-β 等等。

AS从起始发病到出现临床心血管事件的整个过程中，炎症反应 都发挥着重要的作用，然而目前人们对于这个复杂网络的众多环节所 起的具体作用及其机制还知之甚少。此外，虽然在一些AS动物模型 中，针对炎症多个环节的抗炎治疗都取得一定的疗效，但临床上尚缺 乏系统的大规模的实验研究。

炎症反应在动脉粥样硬化（AS）形成、发展的各个阶段普遍存 在。单核细胞（MC）、内皮细胞（EC）、平滑肌细胞(SMC)之间的相 互作用及触发的后继效应是AS炎症反应的核心环节。

本发明根据上述细胞之间的相互作用关系，开发了一种药物筛选 模型，以期通过一种简单实用的方法对抗动脉粥样硬化的药物进行药 效筛选，该方法用体外培养细胞的方法，可以大规模的进行药物初筛， 给新药研发提供一种新的有效的筛选方法。

本发明针对AS形成及炎症反应过程中复杂的细胞间相互关系， 以Millicell@insert为载体，采用EC-SMC-MC共培养的方法，观察 在AS危险因子oxLDL和IL-1β刺激下三种细胞的相互作用及其功能 的特征性改变，以此构建AS治疗药物药效研究的新的方法和评价体 系，为从炎症角度干预AS的药物研究提供有效工具。

发明内容：

本发明是一种基于炎症反应的抗动脉粥样硬化药效评价方法，所 述方法采用oxLDL和IL-1作为刺激因子，作用于内皮细胞-平滑肌细 胞-单核细胞（EC-SMC-MC）共培养体系中，具有明显动脉粥样硬化 炎性反应特征。

本发明所述的方法，实际操作需要经过以下步骤：

步骤1，将平滑肌细胞以种植于Millicell@insert的PE膜外侧，8h 待细胞贴壁后翻转；

步骤2，在膜的内侧面种植内皮细胞，共培养6天；

步骤3，接种单核细胞THP-1，加入oxLDL，IL-1及受试药物，培 养24小时。

步骤4，检测以下项目中的任何一项：检测内皮细胞中的MCP-1，TNFα 的含量；单核细胞表面CD36的含量；平滑肌细胞中的MDA，MMP2 的含量，观察平滑肌细胞骨架的变化；观察内皮细胞ICAM-1的表达。 所述步骤1，方法如下：

将平滑肌细胞种植于Millicell@insert的PE膜外侧，8h后翻转。

所述步骤2，方法如下：

翻转后在Millicell@insert的PE膜的内侧种植内皮细胞，共培养6 天。

所述步骤3，方法如下：

以1×10⁵/cm²接种单核细胞THP-1，加入oxLDL，IL-1β及受试药物， 培养24h。

所述步骤4，其中，

检测内皮细胞中的MCP-1，TNFα的含量方法如下：

吸取Millicell@insert内培养基，反复3次，然后吸尽上清，离心， 取上清，检测EC层MCP-1，TNFα；

检测单核细胞表面CD36的含量方法如下：

离心后得到的沉淀为单核THP-1细胞沉淀,重悬于1ml PBS,流式细 胞仪检测单核细胞表面CD36；

检测平滑肌细胞中的MDA，MMP2的含量方法如下：

吸取下层培养板内培养基，离心，取上清，检测MDA，MMP2含量； Millicell@insert膜免疫荧光染色取材方法如下：

取出Millicell@insert，PBS清洗insert内侧膜、外侧膜各3次，用手 术刀片将膜沿insert边缘轻轻切下，每组2个insert内侧膜朝上，2 个insert外侧膜朝上，粘片剂将膜固定在载玻片上。

观察内皮细胞ICAM-1的表达方法如下：

Insert内侧膜即EC层细胞滴加PBS50μl洗1次，吸尽PBS后，滴加 PE-ICAM-1抗体10μl，培养箱中闭光孵育30min后，PBS清洗2遍， 激光共聚焦显微镜575nm检测ICAM-1表达。

观察平滑肌细胞骨架的变化方法如下：

Insert外侧膜即平滑肌细胞层用3.7%多聚甲醛固定10min，丙酮 脱水1min，0.2%TritonX100室温下渗透10min，再用PBS轻洗两遍， 滴加10μg/ml FITC-鬼笔环肽20μl，培养箱中闭光孵育30min，PBS 清洗2遍，激光共聚焦显微镜488nm观察细胞骨架的变化；

本发明中，模型建立方法属创新方法，各个指标的检测方法均属 于现有技术范畴，可以采用文献报道的方法进行检测，在该创新模型 中各指标的检测结果可以判断药物的有效性。

本发明所述方法，其中有关名称术语的解释如下：

血管平滑肌细胞：血管平滑肌（vascular smooth muscle）是指存在于 血管壁且组成其主要部分的特定类型平滑肌。构成平滑肌的细胞称为 血管平滑肌细胞。

HASMC：人类脐动脉平滑肌细胞（Human Aortic Smooth Muscle  Cells）。

种植：将细胞悬液接种在培养介质表面的过程。

Millicell@insert的PE膜外侧：Millicell@insert是一个共培养小室 的品牌，PE膜是共培养小室底层接种细胞的膜的材料名称。共培养 小室是一个悬空站立在培养板中的小培养室，培养室底层的膜内、外 侧都可以接种细胞，朝下的一侧，称为外侧。

Millicell@insert的PE膜内侧：共培养小室朝上的一侧，称为内侧。 细胞贴壁：细胞从悬浮状态到全部伸展、附着在培养介质上的过程。 内皮细胞：内皮细胞是一薄层的专门上皮细胞，由一层扁平细胞所组 成。它形成血管的内壁，是血管管腔内血液及其他血管壁的接口。

HUAEC：人类脐动脉内皮细胞（Human Umbilical Artery Endothelial  Cells）。

细胞培养：细胞培养（Cell culture）是一种技术，是将真核生物或原 核生物细胞培养在受控制的状态下，使其生长。这项技术的发展与方 法，与组织培养或器官培养关系密切。培养液采用DMEM、 RPMI-1640(Gibicol)培养基，加入培养基的量为Millicell@insert上 层0.4ml/孔,下层培养板0.6ml/孔。

单核细胞：单核细胞（Monocyte）是人体免疫系统中的一种白细胞。 其在人体免疫系统内有两种作用:1.补充正常状态下的巨噬细胞和 树状细胞；2.在有炎症信号下，单核细胞会在8到12小时快速聚集 到感染组织，并分化出巨噬细胞和树状细胞产生免疫反应。

单核细胞THP-1：人急性单核细胞白血病细胞株的名称，为悬浮生 长细胞。

oxLDL：氧化型低密度脂蛋白（Oxidized low-density lipoprotein）。

IL-1：白细胞介素-1（Interleukin-1)。

受试药物：在实验中被观察的对象。

检测内皮细胞中的MCP-1,TNFα的含量：MCP-1(monocyte  chemoattractant protein-1)，单核细胞趋化蛋白,可趋化血液中单核细 胞向炎症部位的募集。TNFα，肿瘤坏死因子，是一种既能直接杀死 肿瘤细胞，又能通过激活免疫系统发挥抗肿瘤作用的细胞因子。用试 剂盒检测细胞中MCP-1和TNFα，可评价药物对细胞炎症反应的作 用。

检测单核细胞表面CD36的含量：CD36，B类清道夫受体，主要表 达在单核细胞表面。检测单核细胞表面CD36的表达水平可评价单核 细胞摄取脂质的能力。

检测平滑肌细胞中的MMP2，MDA的含量：基质金属蛋白酶（matrix  metalloproteinase，MMP）是一种Zn^2＋依赖性的中性蛋白酶家族。其 主要功能是降解和再塑造细胞外基质，维持细胞外基质的动态平衡， 参与人体许多病理和生理过程。MDA(alondialdehyde),丙二醛，脂质 氧化终产物，与脂蛋白交联有毒性作用，在体外影响线粒体呼吸链复 合物及线粒体内关键酶活性。检测MMP2，MDA的变化可评价平 滑肌细胞对斑块稳定的影响。

观察平滑肌细胞骨架的变化：细胞骨架概念是在细胞核中存在的核骨 架-核纤层体系。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯 穿于细胞核和细胞质的网架体系。观察平滑肌细胞骨架的变化可评价 细胞在病理状态下细胞收缩的程度。

观察内皮细胞ICAM-1的表达：ICAM-1（细胞间黏附分子-1），又叫 做CD54，属于黏附分子中免疫球蛋白超家族（IGSF）中的成员，是 介导黏附反应重要的一个黏附分子。ICAM-1在静息的血管内皮细胞 （VEC）上呈低水平表达，通过与血管内皮细胞表面上的特异性受体 结合而发挥其生物学活性。

参莲提取物：是一个中药复方提取物，其配方如下：丹参：穿心莲=15:9 （W/W），其制备方法如下：采用乙醇提取、提取物用大孔吸附树 脂富集纯化的方法制备，提取物中含丹参酮IIA3%、丹酚酸B38%、 穿心莲内酯20%。

用本发明的方法对参莲提取物进行了测试，其结果如下：

用已经体内实验验证对AS形成及其炎症反应有肯定疗效的参莲 提取物为例，以Millicell@insert EC-SMC-MC共培养体系为工具， 从细胞、分子水平深入探讨参莲提取物对AS炎症反应的作用与机制。 证实参莲提取物可通过影响THP-1膜分子CD36表达、黏附功能；影 响HUVEC膜分子ICAM-1表达、TNFα，MCP-1分泌，HUSMC细 胞骨架表达；影响HUSMC的MMP2、MMP9分泌等多个环节干预 AS进程及炎症反应,与前期体内实验结果相应。

参莲提取物药效验证

1、参莲提取物对共培养体系中THP-1膜分子CD36表达的影响

采用流式细胞术检测。细胞加入不同浓度的药物37℃预处置并 施以IL-1β(终浓度10ng/ml)或ox-LDL（终浓度100μg/ml)刺激细胞， 后分别加入已优化效价的PE-CD3610μl，室温避光孵育30min，PBS 洗3次，重悬细胞，流式细胞术检测参莲提取物对膜CD36表达的影 响。

结果表明，与对照组比较，模型组THP-1表面CD36表达阳性率 明显增高，SL组明显抑制CD36表达(P<0.01)。

表1参莲提取物对共培养体系中THP-1膜分子CD36表达的影响

2、参莲提取物对共培养体系中THP-1黏附的影响

采用calcein-AM荧光标记法。在每4ml2.0×10⁶THP-1细胞悬 液中加入40μl calcein-AM37℃孵育1小时备用。加入荧光标记 THP-1前先用不同浓度的药物37℃预处置EC-SMC1h，加入THP-1 和IL-1β(终浓度10ng/ml)或ox-LDL（终浓度100μg/ml)孵育，去上 清液，PBS洗孔3次，洗去未粘附THP-1。荧光显微镜拍片、分析。

结果显示模型组粘附细胞数明显升高，与空白对照组比较，有显 著性差异(P<0.01)。参莲提取物组粘附细胞数明显下降，与模型组比 较有显著性差异(P<0.01或P<0.05)。

图1参莲提取物对EC-SMC-MC共培养中THP-1粘附的影响 THP-1黏附细胞数，calcein-AM荧光标记,激光共聚焦显微镜检测。 a为EC-SMC-MC共培养体系中正常对照组；b模型组；c为 Atorvastatin10ng/ml组；d为参莲提取物100μg/ml组。

3、参莲提取物对共培养体系中HUVEC膜分子表达及EC分泌 炎症因子的影响

采用激光共聚焦和ELISA法检测。EC层吸尽上清（约400μl） 至1ml EP管中4℃2500rpm离心10min，取上清，检测EC层NO， TNFα。EC层细胞（面积约0.15cm²）滴加PBS50μl洗1次，吸尽PBS 后，滴加PE-ICAM-1抗体10μl，培养箱中闭光孵育30min后，PBS 清洗2遍，激光共聚焦显微镜575nm检测ICAM-1表达。

结果表明，EC-SMC-MC共培养模型组,EC表面ICAM-1,及共培 养上清中TNFα，MCP-1，的含量明显增高。参莲提取物组可降低EC 表面ICAM-1表达，及共培养上清中TNFα，MCP-1含量,与模型组 比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。

A共聚焦检测结果，放大倍数×100。a，b，c，d为共培养24h后PE 标记EC表面ICAM-1表达（a为对照组，b为模型组，c为Atorvastatin 10ng/ml组，d为参莲提取物100μg/ml组）。

表2参莲提取物对HUAEC中TNFα，MCP-1表达的影响

4、参莲提取物对共培养体系中HUSMC膜分子表达及SMC分泌炎 症因子的影响

采用激光共聚焦和ELISA法检测。吸取SMC层培养板内培养基 （约600μl），于1ml EP管中4℃2500rpm离心取上清，用于检测SMC 层MMP2，MMP9。

SMC层细胞（面积约0.15cm2）滴加PBS50μl洗1次，吸尽PBS 后，滴加FITC-F-actin抗体10μl，培养箱中闭光孵育30min后，PBS 清洗2遍，激光共聚焦显微镜488nm检测F-actin表达。

结果表明，EC-SMC-MC共培养模型组SMC F-actin表达明显增 强,共培养上清中MMP2，MMP9的含量明显增高。参莲提取物组可 降低SMC表面F-actin表达，及共培养上清中MMP2，MMP9含量,与 模型组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。

图3EC-SMC及EC-SMC-MC共培养及不同刺激因子作用比较 A共聚焦检测结果，放大倍数×100。e，f，g，h为共培养24h后FITC 标记SMC细胞F-actin表达（a为对照组，b为模型组，c为Atorvastatin 10ng/ml组，d为参莲提取物100μg/ml组）

表3参莲提取物对HUSMC中MMP-9表达的影响

用本发明的方法对待检测的未知效果的药物进行检测，根据测定 结果，可以判断未知效果药物是否具有抗动脉粥样硬化作用。检测过 程中使用空白对照和阳性药物对照，即可方便的得出待测药物的药效 结果。

本模型的最大特点是可以在一个实验体系中完成抗动脉粥样硬 化及其炎症反应的药效评价。

本发明还包括：

本发明的方法在动脉粥样硬化药效评价中的应用

本发明的方法在动脉粥样硬化炎症反应药效评价中的应用

各个指标的检测方法放在一个体系中,从炎症角度建立一个抗 动脉粥样硬化药效评价的体系是这个专利的核心。

附图说明：

图1参莲提取物对EC-SMC-MC共培养中PE标记EC表面 ICAM-1表达

图2参莲提取物对EC-SMC-MC共培养中SMC细胞F-actin表 达的影响

图3EC-SMC及EC-SMC-MC共培养及刺激因子oxLDL+IL-1的 作用比较

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1

1.EC-MC-SMC共培养体系建立的方法：

1.1先将SMC（HASMC）以1×105/cm2（体积50μl）种植于 Millicell@insert的PE膜外侧，8h待细胞贴壁后翻转，在膜的内侧 面以1×105/cm2种植EC（HUAEC），共培养6d，以1×105/cm2接种 单核细胞THP-1，同时加入oxLDL100μg/ml，IL-1β10ng/ml及受试药 培养24h。在此体系中进行药效学实验。

1.224h后用枪头轻柔地吸取Millicell@insert内培养基，反复3 次，然后吸尽上清（约400μl）至1ml EP管中4℃2500rpm离心10min。 取上清，冻存。用于检测EC层MCP-1，TNFα。

1.3沉淀为单核THP-1细胞沉淀,重悬于1ml PBS,流式细胞仪检 测单核细胞表面CD36。

1.4吸取下层培养板内培养基（约600μl），于1ml EP管中4℃ 2500rpm离心10min。取上清，冻存。用于检测SMC层MMP2，MDA。

1.5取出Millicell@insert，PBS清洗insert内侧膜、外侧膜各3 次，用手术刀片将膜沿insert边缘轻轻切下，每组2个insert内侧膜 朝上，2个insert外侧膜朝上，粘片剂将膜固定在载玻片上。

1.6EC层细胞（面积约0.15cm2）滴加PBS50μl洗1次，吸尽 PBS后，滴加PE-ICAM-1抗体10μl，培养箱中闭光孵育30min后， PBS清洗2遍，激光共聚焦显微镜575nm检测ICAM-1表达。

1.7SMC层细胞（面积约0.15cm2）3.7%多聚甲醛固定10min， 丙酮脱水1min，0.2%TritonX100室温下渗透10min，再用PBS轻洗 两遍。10μg/ml FITC-鬼笔环肽20μl，培养箱中闭光孵育30min，PBS 清洗2遍，激光共聚焦显微镜488nm观察细胞骨架的变化。

2建立模型与现有模型比较实验

培养24h后吸尽上清（约400μl）至1ml EP管中4℃2500rpm离 心10min。取上清，检测EC层MCP-1，TNFα，结果见表4。吸取下 层培养板内培养基（约600μl），于1ml EP管中4℃2500rpm离心 10min。取上清，检测SMC层MMP2，MDA，结果见表5。取膜， SMC层细胞10μg/ml FITC-鬼笔环肽染色，观察细胞骨架，结果见图 3。

表4不同共培养条件对EC细胞分泌MCP-1，TNFα的影响

表5不同共培养条件对SMC细胞分泌MMP2，MDA的影响

实施例2

1未知药物实验

丹参酮IIA（Tan IIA）

以EC-SMC-MC共培养组作为对照，以阿托伐他汀为阳性对照 按照实施例1方法进行检测，检测结果如下：

1.1丹参酮IIA对EC细胞分泌MCP-1，TNFα的影响结果表明， EC-SMC-MC共培养并施以oxLDL和IL-1刺激，EC表面ICAM-1, 及共培养上清中TNFα，MCP-1的含量明显增高。丹参酮IIA可降低 EC表面ICAM-1表达，及共培养上清中TNFα，MCP-1含量,，模型 组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。

表5丹参酮IIA对EC细胞分泌MCP-1，TNFα的影响

1.2丹参酮IIA对单核细胞表面CD36表达的影响结果表明， EC-SMC-MC共培养并施以oxLDL和IL-1刺激，MC表面CD36表 达明显增高。丹参酮IIA可降低MC表面CD36表达，模型组比较有 显著性差异(P<0.05或P<0.01)。

表6丹参酮IIA对共培养体系中THP-1膜分子CD36表达的影响

1.3丹参酮IIA对SMC细胞分泌MMP2，MDA的影响结果表明， EC-SMC-MC共培养并施以oxLDL和IL-1刺激，SMC F-actin表达 明显增强,共培养上清中MDA，MMP2的含量明显增高。丹参酮IIA 可降低SMC细胞F-actin表达，及共培养上清中TNFα，MCP-1含量, 模型组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。

表7丹参酮IIA对SMC细胞分泌MMP2，MDA的影响