一种中药组合物在制备治疗急、慢性肝损伤药物中的应用

摘要

本发明涉及一种中药组合物的用途，具体涉及一种中药组合物在制备治疗急、慢性肝损伤药物中的应用。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种中药组合物的用途，具体涉及该中药组合物在制备治疗急、慢性肝 损伤药物中的应用。

技术背景：

肝损伤是临床常见的危害人类健康的疾病。肝损伤就是肝脏受到外界因素的入侵， 从而引起的肝脏受损。肝损伤分为急性肝损伤和慢性肝损伤。饮酒过多、熬夜过劳、环 境污染、酒精肝、脂肪肝等多种因素均有可能引起肝损伤。

其次肝脏是药物浓集、转化、代谢的主要器官，尤其是口服药物由胃肠吸收后即进 入肝脏，在肝内的浓度较血液及其他器官中高。当药物的用量过大或用药时间过长，就 会对肝脏造成伤害。特别是不恰当地合用两种或两种以上药物时，损害更甚，会造成部 分肝细胞坏死，出现黄疸、血清谷丙转氨酶升高等肝功能异常情况。由于药物及代谢产 物的毒性作用或机体对药物产生过敏反应，对肝脏造成损害，引起肝组织发炎，即为药 物性肝损伤。引起药物性肝炎的药物主要有解热镇痛抗炎药、镇静催眠药、抗结核药、 抗寄生虫药以及某些抗菌药和激素类药物等，药物性肝损伤近年发病人群也越来越多。

中医药经过几千年的发展研究，发现许多中药对肝损伤有一定的促再生和修复作用， 因此运用中药进行综合治疗，来减轻或控制肝损伤的发生，应当是一种既有效而又切实 可行的治疗思路。

本发明涉及的中药组合物含青蒿、金银花和栀子3味中药。该中药组合物具有清热、 疏风、解毒的功效。用于外感风热所致感冒、咳嗽，症见高热、微恶风寒、头痛身痛、 咳嗽、痰黄；用于上呼吸道感染、急性支气管炎见上述证候者。涉及中药组合物的组成、 制备方法与剂型以及质量控制方法等内容在中国发明专利02114995.X、200410000134.X、 200510134299.0中有较为详细的描述。

近年来本中药组合物临床应用发现其有治疗肝肿瘤性癌性发热等作用(南新记.中医 临床研究.2012)。此类发热属于中医“内伤发热”、“肝癌”、“肝积”范畴，笔者采用本 组合物联合新黄片保留灌肠是基于肝脏肿瘤发热的病因病机：痰瘀互结，热毒内蕴，治 疗给予祛痰散结、活血化瘀、清热泻火，抗癌解毒为法。病证兼治，热退汗出而不伤津 液，热毒外泻则肝疏调达，瘀毒内消则热自退。发明人在此基础上对本组合物进行进一 步的研究，意外发现本组合物具有明显的抗急慢性肝损伤的作用，且无毒副作用，有望 填补治疗肝损伤药物的缺陷。

发明内容

本发明提供了一种中药组合物在制备治疗急、慢性肝损伤药物中的应用，实验研究 表明本组合物可改善急性肝损伤血液生化指标，减轻肝细胞变性和坏死；能降低慢性肝 损伤的血清门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)值，抑制过氧化脂质及 羟基脯氨酸的含量，明显改善肝脏病理组织学变化。

实施方式

为了更好地理解本发明，发明人提供以下研究资料，说明本发明的技术效果，以下 实施例用于进一步说明，但不限于本发明。

实施例1：本发明中药组合物注射液对D-氨基半乳糖所致大鼠急性肝损伤的保护作用

1.药物、材料与方法

1.1药物：

本发明中药组合物注射液(以下简称“组合物”)，江苏康缘药业股份有限公司。

1.2材料：

甲醛，南京化学试剂一厂；

ALT测试药盒、AST测试药盒、ALP测试药盒、T-BIlI测试药盒，上海科华一东菱 诊断用品有限公司；

盐酸D-氨基半乳糖，武汉顶辉化工有限公司。

1.3方法：

(1)造模方法及分组

取Wistar大鼠60只，体重100～150g，雌雄各半，随机分为6组，每组10只。五 组为(1)空白对照组：10ml/kg生理盐水；(2)模型组：10ml/kg生理盐水；(3)舒肝宁注射液 组：2ml/kg；(4)组合物小剂量组：1ml/kg；(5)组合物中剂量组：2ml/kg；(6)组合物大剂 量组：4ml/kg。各组均按10ml/kg每天静脉注射给药一次，连续3天。在给药的第2天， 除空白对照组外，其余各组每只大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖1100mml/kg，观察大鼠死亡 情况，死亡大鼠取出肝脏留待组织学检查。各组存活大鼠在48小时后称重，然后进行标 本采集。

(2)标本的采集

①大鼠眼眶取血，于恒温箱中放置30min后，3000rpm离心10min后，吸取上层血 清。

②取血后，大鼠颈椎脱臼处死，立即取出肝脏，用10％甲醛溶液固定，石蜡包埋切 片。

(3)指标测定

①血清生化指标测定：采用ALT、AST、ALP、T-BIlI试剂盒，日立7020型全自动 生化分析仪测定。

②死亡观察及组织学检查测定：对造模过程中死亡的动物及给药结束后动物肝脏用 HE染色，光学显微镜下观察。

2.结果

2.1大鼠体重及死亡数：

表1本发明中药组合物对D-氨基半乳糖所致急性肝损伤大鼠体重的影响

注：^△△p＜0.01与空白对照组比较，*p＜0.05与模型组比较

结果显示，造模后模型组和组合物小剂量组大鼠在48小时内各有2只死亡，组合物 中、大剂量组及舒肝宁注射液组大鼠未见死亡。造模后大鼠体重明显减轻，与空白对照 组比较有显著性差异(p＜0.01)，各给药组大鼠体重均比模型组增加，其中组合物中、大剂 量组与模型组比较有显著性差异(p＜0.05)。

2.2血清测定：

表2本发明中药组合物对D-氨基半乳糖所致急性肝损伤大鼠血生化指标的影响

注：^△△p＜0.01与空白对照组比较，*p＜0.05 **p＜0.01与模型组比较

结果显示，造模后动物ALT、AST、ALP、T-BIlI明显升高，与空白对照组比较有显 著性差异(p＜0.01)；舒肝宁注射液组及组合物小、中剂量组ALT、AST，组合物大剂量组 ALT、AST、ALP、T-BIlI有明显的下降，与模型组比较有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01)。 提示本发明组合物对模型大鼠ALT、AST、ALP、T-BIlI水平升高有一定拮抗作用。

2.3组织学检查测定：

组织学检查：用HE染色，光学显微镜下观察。结果见表3。

表3本发明中药组合物对D-氨基半乳糖所致急性肝损伤大鼠肝组织的影响

注：“-”无；“+”轻度；“++”中度；“+++”重度。

空白对照组：除少数大鼠肝脏有炎细胞浸润外，其余组织学结构空白对照；

模型组：被检大鼠显示肝细胞中到重度损伤，有凝固性坏死及点状坏死，肝板排列 紊乱，间质小胆管明显增生，炎细胞浸润明显，少数动物肝脏出现轻度肝细胞再生和 Kupffer，s细胞增生；

舒肝宁注射液组：肝凝固性坏死比模型组轻，其余损伤改变与模型组相似，胆 Kupffer，s细胞轻度增生、肝细胞再生较明显；

组合物小剂量组：4只死亡大鼠肝组织出现重度凝固性坏死，肝板排列紊乱、炎细胞 浸润明显，其余肝组织病变程度比模型组轻，肝组织出现轻到中度凝固性坏死和点状坏 死，Kupffer，s细胞轻度增生，肝细胞再生较明显；

组合物中剂量组：1只死亡大鼠肝组织出现重度凝固性坏死，肝板排列紊乱、炎细胞 浸润明显，其余肝组织病变程度比模型组轻，肝组织出现轻到中度凝固性坏死和点状坏 死，Kupffer，s细胞轻度增生，肝细胞再生较明显；

组合物大剂量组：肝组织出现轻到中度凝固性坏死和点状坏死，肝板较齐，Kupffer，s 细胞轻度增生，肝细胞再生明显。

2.4小结：

实验结果表明，本发明组合物三个剂量组均能增加D-氨基半乳糖所致急性肝细胞损 伤大鼠的体重；能拮抗模型大鼠的ALT、AST、ALP、T-BIII水平升高；能明显减轻肝细 胞的变性和坏死，促进Kupffer，s细胞增生，肝细胞再生。

实施例2：本发明中药组合物对CCl₄所致小鼠慢性肝损伤的治疗作用

1.药物、材料与方法

1.1药物：

本发明中药组合物注射液(以下简称“组合物”)，江苏康缘药业股份有限公司。

1.2材料：

四氯化碳，上海长江化工厂；

甲醛，南京化学试剂一厂；

ALT测试药盒、AST测试药盒，上海科华-东菱诊断用品有限公司。

1.3方法：

(1)造模方法及分组

取健康KM小鼠96只，体重22～25g，雌雄各半，随机均分6组：(1)空白对照组： 生理盐水20ml/kg；(2)模型组：生理盐水20ml/kg；(3)舒肝宁注射液组：4ml/kg；(4)组合 物小剂量组：2ml/kg；(5)组合物中剂量组：4ml/kg；(6)组合物大剂量组：8ml/kg。各组均 按20ml/kg腹腔注射给药，连续给药30天。给药同时，除空白对照组外，其余五组小鼠 用10％CCl₄橄榄油10ml/kg灌胃，隔日一次，共15次。末次灌胃给予CCl₄并禁食16小 时后，各组小鼠称重，眼眶取血测定ALT、AST。

(2)标本的采集

①小鼠眼眶取血，于恒温箱中放置30min后，3000rpm离心10min后，吸取上层血 清。

②取血后，小鼠颈椎脱臼处死，立即取出肝脏，用10％甲醛溶液固定，石蜡包埋切 片。

(3)指标测定

①动物一般情况及死亡数统计：观察动物精神状态、毛色、活动能力、死亡数、体 重。

②血清生化指标测定：采用ALT、AST试剂盒，日立7020型全自动生化分析仪测定。

③组织学检查测定：用HE染色，光学显微镜下观察。

2.结果

2.1小鼠体重及死亡数：

表4本发明中药组合物对CCl₄所致慢性肝损伤小鼠体重的影响

注：^△△p＜0.01与空白对照组比较，**p＜0.01与模型组比较

结果显示，造模后小鼠体重明显减轻，与空白对照组比较有显著性差异(p＜0.01)，舒 肝宁注射液组与本发明组合物三个剂量组都能增加模型小鼠的体重，与模型组比较有显 著性差异(p＜0.01)。

2.2血清测定：

表5本发明中药组合物对CCl₄所致慢性肝损伤小鼠ALP、AST的影响

注：^△△p＜0.01与空白对照组比较，*p＜0.05 **p＜0.01与模型组比较

结果显示，造模后动物ALT、AST明显升高，与空白对照组比较有显著性差异 (p＜0.01)；舒肝宁注射液组、本发明组合物小、中、大剂量组ALT、AST有明显的下降， 与模型组比较有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01)。提示本发明组合物对模型小鼠ALT、AST 有一定的降低作用。

2.3组织学检查测定：

(1)肉眼观察

模型组小鼠肝脏苍白，呈土黄色；本发明组合物小剂量、大剂量组及舒肝宁注射液 组小鼠肝脏多数呈淡褐色。

(2)组织学检查：见表6。

表6本发明中药组合物对CCl₄慢性中毒小鼠肝组织学的影响

注：“-”无；“+”轻度；“++”中度；“+++”重度。

空白对照组：本组小鼠肝脏组织学结构空白对照，未见出血、坏死、炎细胞浸润及 肝细胞损伤的表现。

模型组：本组小鼠肝小叶结构遭到破坏，肝组织出现中到重度肝细胞脂肪变性，有 片状凝固性坏死灶，坏死灶相互融合，并有多量中性白细胞浸润；汇管区有中到重度结 缔组织增生，增生的结缔组织向小叶内侵入，分割肝小叶；有少数小鼠出现肝细胞再生。

舒肝宁注射液组：本组小鼠肝小叶结构破坏程度比模型组轻，肝组织出现轻到中度 肝细胞脂肪变性；有9例出现片状凝固性坏死灶，其余为点状坏死，汇管区有轻度结缔 组织增生和少量白细胞浸润；肝细胞再生较明显。

组合物小剂量组：本组小鼠肝小叶结构破坏程度比模型组轻，肝组织出现轻到中度 肝细胞脂肪变性；有11例出现片状凝固性坏死灶，其余为点状坏死，汇管区有轻度到中 度结缔组织增生和少量白细胞浸润；肝细胞再生较明显。

组合物中剂量组：本组小鼠肝小叶结构破坏程度比模型组轻，肝组织出现轻到中度 肝细胞脂肪变性；有10例出现片状凝固性坏死灶，其余为点状坏死，汇管区有轻度到中 度结缔组织增生和少量白细胞浸润；肝细胞再生较明显。

组合物大剂量组：本组小鼠肝小叶结构破坏程度较轻，肝组织出现轻度肝细胞脂肪 变性；有6例出现片状凝固性坏死灶，其余为点状坏死，汇管区有轻度结缔组织增生和 少量白细胞浸润；肝细胞再生较明显。

2.4小结：

实验结果表明，本发明组合物三个剂量组能增加CCl₄所致慢性肝损伤小鼠的体重； 能拮抗造模引起的ALT、AST水平升高；能减轻肝细胞的损害，并随剂量增加，效果明 显；且能促进肝细胞再生。

实施例3：本发明中药组合物对乙醇与CCl₄诱发大鼠肝硬化的护肝作用

1.药物、材料与方法

1.1药物

本发明中药组合物注射液(以下简称“组合物”)，江苏康缘药业股份有限公司。

1.2材料：

四氯化碳，上海长江化工厂；

甲醛，南京化学试剂一厂；

ALT测试药盒、AST测试药盒，上海科华-东菱诊断用品有限公司；

KCL，上海陆都化学试剂厂；

H₃PO₄，南京玖泰化学试剂厂；

正丁醇，上海陆都化学试剂厂；

甲醇，南京化学试剂厂；

PHA，Sigma公司。

1.3方法：

(1)造模方法及分组

SD大鼠60只，全雄，150～200g，随机分为6组，每组10只。即：(1)空白对照组： 给予生理盐水10ml/kg；(2)模型组：给予10％CCl₄10ml/kg；(3)舒肝宁注射液组：2ml/kg； (4)组合物小剂量组：1ml/kg；(5)组合物中剂量组：2ml/kg；(6)组合物大剂量组： 4ml/kg。除空白对照组外各组均灌胃给予10％乙醇，连续12周，在试验开始2周后单次 给予50％CCl₄，在其后给予乙醇时每2次给予1ml25％CCl₄。各组的药物于造模后8周 开始给予，连续给药4周，均按10ml/kg静脉注射给药。

(2)观测指标及方法

1)动物一般情况及死亡数统计：观察动物精神状态、毛色、活动能力、死亡数；每周 记录大鼠体重。

2)测定ALT、AST：各组大鼠于实验开始前、实验结束时眼眶取血，放置30min凝 固之后以3000rpm离心10min，分离血清，测定ALT和AST。

(3)过氧化脂质的测定：取各组动物的肝组织部分左叶经冷冻后加10倍量 1.15％KCL，再把1％H₃PO₄0.08ml和0.67％TBA0.26ml放入试管中混合，加热至100℃， 发酵45min后迅速冷却，加入1.03ml n-butanol正丁醇绞碎后提取，之后在3000rpm中 分流15min取上清液，在535nm和520nm中用分光光度计测量吸光度得知其差异，0.13ml 标准液与0.13ml生理盐水也利用这种方法测定。

(4)羟基脯氨酸量的测定：取各组动物的肝组织部分左叶经冷冻后加10％6N KCL， 加热至110℃，加水分解16h，在氧化成chloramine氯胺用T Ehrlichsreagent T埃利希试 剂加热至50℃发酵90min，最后在558nm中检测吸光度。

(5)观察大鼠器官切片：各组的试验动物在最后一次采血后，处死，剖检，取肝脏， 用10％甲醛溶液固定，切片，观察。

2.结果

2.1大鼠体重及死亡数：

表7本发明中药组合物对CCl₄诱发肝硬化大鼠体重的影响

注：^△△p＜0.01与空白对照组比较，*p＜0.05 **p＜0.01与模型组比较

结果显示，造模后大鼠体重明显减轻，与空白对照组比较有显著性差异(p＜0.01)，舒 肝宁注射液组与本发明组合物三个剂量组都能增加模型大鼠的体重，与模型组比较有显 著性差异(p＜0.05，p＜0.01)。

2.2血清测定：

表8本发明中药组合物对CCl₄诱发肝硬化大鼠ALT和AST的影响

注：^△△p＜0.01与空白对照组比较，*p＜0.05 **p＜0.01与模型组比较

结果显示，造模后模型大鼠ALT、AST明显升高，与空白对照组比较有显著性差异 (p＜0.01)，说明CCl₄已经诱发了脂肪肝及慢性肝炎；造模大鼠中本发明组合物各剂量组 和舒肝宁注射液组的肝毒性指标ALT、AST与模型组比较出现有意义改变(p＜0.01， p＜0.05)，而且从指标的差异可看到本发明组合物作用更明显，并呈量效关系。这说明与 模型组或舒肝宁注射液组相比，本发明组合物在由CCl₄引起的肝毒性疾患中起的保护作 用比较明显。

2.3MDA、Hyd的测定：

表9本发明中药组合物对CCl₄诱发肝硬化大鼠MDA和Hyd的OD值影响

注：^△△p＜0.01与空白对照组比较，*p＜0.05 **p＜0.01与模型组比较

结果显示，造模后模型大鼠过氧化脂质和羟基脯氨酸指标OD值明显升高，与空白 对照组比较有显著性差异(p＜0.01)。给药后本发明组合物各剂量组与模型组相比有显著性 差异(p＜0.05，p＜0.01)，并且效果也强于舒肝宁注射液组。

2.4组织学检查测定：

死亡观察：

造模后模型组、舒肝宁注射液组各有2只大鼠死亡，本发明组合物小剂量组有1只 大鼠死亡，中、大剂量组未见死亡。

组织学检查：

模型组的肝组织中可观察到乙醇和四氯化碳并用诱发的典型脂肪肝及慢性肝炎症状 引起的脂肪浸润和balooned化的肝细胞，出现了大小不同的肝小叶、纤维化的胃小叶、 胃胆管的增殖，即肝硬化现象，相反，在本发明组合物各剂量组的组织切片中只观察到 很少的脂肪肝症状，结合组织的增殖、胃小叶及胃胆管的增殖也非常微弱。与之不同， 舒肝宁注射液组与模型组比较出现改变，但没有本发明组合物组的作用明显。

2.5小结：

实验结果表明，本发明组合物能增加CCl₄所诱发肝硬化大鼠的体重；能降低四氯化 碳诱发的大鼠脂肪肝及慢性肝炎的血清AST、ALT值，抑制过氧化脂质及羟基脯氨酸的 量；病理组织学方面对肝脏损伤亦有明显的改善。