大丽轮枝菌培养基及其制备方法和培养大丽轮枝菌的方法

摘要

本发明公开了一种大丽轮枝菌培养基，该大丽轮枝菌培养基含有1-3g/L的NaNO

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种大丽轮枝菌培养基， 一种大丽轮枝菌培养基的制备方法和一种培养大丽轮枝菌的方法。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)，属于半知菌亚门轮枝菌属真菌。大丽轮 枝菌的寄主范围极广，可为害38科660种植物，其中农作物184种，杂草 153种。在中国，大丽轮枝菌的寄主植物至少涉及20科80种，例如向日葵、 茄子、辣子、番茄、烟草、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、 大豆、棉花、芝麻、甜菜等大田作物。其中，大丽轮枝菌能够引发棉花的黄 萎病，因此研究大丽轮枝菌的生物学特征具有重大意义。

在大丽轮枝菌的研究过程中，经常需要大量使用大丽轮枝菌的孢子，但 是，目前用于培养大丽轮枝菌的培养基（例如查比克培养基）在培养大丽轮 枝菌时，产孢子量仍然较低。

发明内容

针对上述存在的问题和解决方法的不足，本发明将研发一种新的大丽轮 枝菌培养基，并将其用于培养大丽轮枝菌，以实现提高大丽轮枝菌产孢子量 的目的。

为了实现上述目的，本发明提供了一种大丽轮枝菌培养基，该大丽轮枝 菌培养基含有1-3g/L的NaNO₃、0.3-0.7g/L的KCl、0.5-2g/L的K₂HPO₄、 0.005-0.015g/L的FeSO₄、0.3-0.7g/L的MgSO₄和5-15g/L的棉花组织粉末。

另一方面，本发明还提供了一种大丽轮枝菌培养基的制备方法，该方法 包括：（1）将棉花组织用液氮速冻并经过破碎和干燥，得到棉花组织粉末； （2）将所述棉花组织粉末与NaNO₃、KCl、K₂HPO₄、FeSO₄和MgSO₄混合 并配制为含有1-3g/L的NaNO₃、0.3-0.7g/L的KCl、0.5-2g/L的K₂HPO₄、 0.005-0.015g/L的FeSO₄、0.3-0.7g/L的MgSO₄和5-15g/L的棉花组织粉末的 大丽轮枝菌培养基。

再一方面，本发明还提供了一种培养大丽轮枝菌的方法，该方法包括： 将大丽轮枝菌菌种接种到如上所述的大丽轮枝菌培养基中，并且进行孵育。

通过上述技术方案，本发明能够将大丽轮枝菌的产孢子量提高5倍以上。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种大丽轮枝菌培养基，其中，该大丽轮枝菌培养基含有 1-3g/L的NaNO₃、0.3-0.7g/L的KCl、0.5-2g/L的K₂HPO₄、0.005-0.015g/L 的FeSO₄、0.3-0.7g/L的MgSO₄和5-15g/L的棉花组织粉末。

其中，为了进一步提高大丽轮枝菌的产孢子量，优选情况下，该大丽轮 枝菌培养基含有1.5-2.5g/L的NaNO₃、0.4-0.6g/L的KCl、0.8-1.2g/L的 K₂HPO₄、0.008-0.012g/L的FeSO₄、0.4-0.6g/L的MgSO₄和8-12g/L的棉花组 织粉末。

其中，所述棉花组织粉末可以来源于棉花植株的各个组成部分，包括但 不限于根、茎、叶、花、果；为了进一步提高大丽轮枝菌的产孢子量，优选 情况下，所述棉花组织粉末是由棉花植株的根和/或茎形成的粉末。

其中，所述棉花植株可以为任意周龄的棉苗，优选是4-6周龄的棉苗。

本发明还提供了一种大丽轮枝菌培养基的制备方法，其中，该方法包括： （1）将棉花组织用液氮速冻并经过破碎和干燥，得到棉花组织粉末；（2） 将所述棉花组织粉末与NaNO₃、KCl、K₂HPO₄、FeSO₄和MgSO₄混合并配 制为含有1-3g/L的NaNO₃、0.3-0.7g/L的KCl、0.5-2g/L的K₂HPO₄、 0.005-0.015g/L的FeSO₄、0.3-0.7g/L的MgSO₄和5-15g/L的棉花组织粉末的 大丽轮枝菌培养基。

其中，为了进一步提高大丽轮枝菌的产孢子量，优选情况下，将所述棉 花组织粉末与NaNO₃、KCl、K₂HPO₄、FeSO₄和MgSO₄混合并配置为含有 1.5-2.5g/L的NaNO₃、0.4-0.6g/L的KCl、0.8-1.2g/L的K₂HPO₄、0.008-0.012g/L 的FeSO₄、0.4-0.6g/L的MgSO₄和8-12g/L的棉花组织粉末。

其中，所述棉花组织粉末可以来源于棉花植株的各个组成部分，包括但 不限于根、茎、叶、花、果；为了进一步提高大丽轮枝菌的产孢子量，优选 情况下，棉花组织粉末是由棉花植株的根和/或茎形成的粉末。

其中，所述棉花植株可以为任意周龄的棉苗，优选是4-6周龄的棉苗。

本发明还提供了一种培养大丽轮枝菌的方法，其中，该方法包括：将大 丽轮枝菌菌种接种到如上所述的大丽轮枝菌培养基中，并且进行孵育。

其中，接种的条件可以包括：相对于每升的大丽轮枝菌培养基，大丽轮 枝菌菌种的接种量为1-5×10⁶cfu；所述孵育的温度为25-28℃。

本文中液体的体积为20℃下的体积。

以下通过实施例进一步详细说明本发明：

制备实施例1

将棉籽（合丰202，购自石家庄市万丰种业有限公司）种于商品蛭石和 营养土（购自北京繁星花卉有限公司），温室培养（光周期14h，温度25℃， 相对湿度85%）4-6周，得到4-6周龄的棉苗。

将上述得到的4-6周龄的棉苗清洗干净，取棉花植株的根和茎，剪碎， 放入液氮中速冻并破碎为粉末，然后干燥，得到棉花组织粉末，备用。

实施例1

将2g的NaNO₃、0.5g的KCl、1g的K₂HPO₄、0.01g的FeSO₄、0.5g的 MgSO₄和10g的制备实施例1的棉花组织粉末混合，并加水至1L，灭菌后 得到本实施例的大丽轮枝菌培养基。

实施例2

将1.5g的NaNO₃、0.6g的KCl、0.8g的K₂HPO₄、0.012g的FeSO₄、0.4g 的MgSO₄和12g的制备实施例1的棉花组织粉末混合，并加水至1L，灭菌 后得到本实施例的大丽轮枝菌培养基。

实施例3

将2.5g的NaNO₃、0.4g的KCl、1.2g的K₂HPO₄、0.008g的FeSO₄、0.6g 的MgSO₄和8g的制备实施例1的棉花组织粉末混合，并加水至1L，灭菌后 得到本实施例的大丽轮枝菌培养基。

实施例4

将1g的NaNO₃、0.7g的KCl、0.5g的K₂HPO₄、0.015g的FeSO₄、0.3g 的MgSO₄和5g的制备实施例1的棉花组织粉末混合，并加水至1L，灭菌后 得到本实施例的大丽轮枝菌培养基。

实施例5

将3g的NaNO₃、0.3g的KCl、2g的K₂HPO₄、0.005g的FeSO₄、0.7g 的MgSO₄和15g的制备实施例1的棉花组织粉末混合，并加水至1L，灭菌 后得到本实施例的大丽轮枝菌培养基。

制备实施例2

将棉籽（合丰202，购自石家庄市万丰种业有限公司）种于商品蛭石和 营养土（购自北京繁星花卉有限公司），温室培养（光周期14h，温度25℃， 相对湿度85%）4-6周，得到4-6周龄的棉苗。

将上述得到的4-6周龄的棉苗清洗干净，取棉花植株的叶，剪碎，放入 液氮中速冻并破碎为粉末，然后干燥备用。

实施例6

将2g的NaNO₃、0.5g的KCl、1g的K₂HPO₄、0.01g的FeSO₄、0.5g的 MgSO₄和10g的制备实施例2的棉花组织粉末混合，并加水至1L，灭菌后 得到本实施例的大丽轮枝菌培养基。

对比例1

制备查比克培养基，即2g NaNO₃，0.5g的KCl、1g的K₂HPO₄、0.018g 的FeSO₄、0.5g的MgSO₄和30g的蔗糖混合并加水至1L，灭菌后得到本实 施例的大丽轮枝菌培养基。

测试实施例1

将大丽轮枝菌菌种（Verticillium dahliae，中国农业科学院植物保护研究 所简桂良研究员惠赠）分别接种在实施例1-6和对比例1的大丽轮枝菌培养 基中，相对于每升的大丽轮枝菌培养基，大丽轮枝菌菌种的接种量为1× 10⁶cfu，在28℃下孵育5天，血球计数板法统计孢子数量，结果显示不同处 理之间孢子形态完全一致，但孢子数量具有明显差异，具体如表1所示。

表1

大丽轮枝菌培养基 产孢子量 实施例1 9.6×10⁷实施例2 9.7×10⁷实施例3 8.5×10⁷实施例4 7.2×10⁷实施例5 7.5×10⁷实施例6 6.2×10⁷对比例1 1.4×10⁷

根据表1的数据可见，本发明能够显著地增加大丽轮枝菌的产孢子量； 并且，在优选大丽轮枝菌培养基含有1.5-2.5g/L的NaNO₃、0.4-0.6g/L的KCl、 0.8-1.2g/L的K₂HPO₄、0.008-0.012g/L的FeSO₄、0.4-0.6g/L的MgSO₄和8-12g/L 的棉花组织粉末的情况下，能够进一步提高大丽轮枝菌的产孢子量；并且， 在优选棉花组织粉末是由棉花植株的根和/或茎形成的粉末的情况下，能够进 一步提高大丽轮枝菌的产孢子量。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。