耐高温醋酸菌及其发酵生产醋酸的应用

摘要

本发明公开了一株耐高温的巴氏醋杆菌及其发酵生产醋酸的应用，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.8189。本发明的醋杆菌能够在25-45℃下生长和产酸，利用该菌株以乙醇为主要原料进行液态深层发酵生产醋酸，发酵过程温度和通气量控制分为三个阶段，发酵结束所得醋酸浓度可达60-180g/L，乙醇转酸率达到85%-101%。本发明利用耐高温的醋酸菌进行醋酸发酵生产，采用较高的发酵温度，节省了冷却用电和冷却用水的消耗，同时具有较高的生产效率，降低了生产成本。该耐高温醋酸菌及其发酵工艺适用于粮食醋、果醋等多种食醋的发酵生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一株耐高温醋酸菌，还涉及利用该菌株以乙醇为底物发酵生产醋酸的应用，属于生物技术领域。 

背景技术

醋酸是一种重要的工业原料，在食品、医药、化工等领域具有广泛的应用。食用醋酸一般利用微生物发酵法进行生产。 

醋酸菌( Acetic acid bacteria) 是醋酸发酵的主要工业用菌，能够将乙醇氧化成醋酸。常见的有醋杆菌属（Acetobacter）葡萄糖杆菌属（Gluconobacter）以及葡萄糖酸杆菌属（Gluconacetobacter）等，其中醋杆菌属和葡萄糖杆菌属的醋酸菌由于具有较高的乙醇氧化能力，常用于醋酸的液态纯种发酵生产。 

醋酸发酵需要在适宜的条件下进行才能获得较高的生产效率。通常，醋酸发酵最适温度为30-32 ℃，发酵温度过高，醋酸菌易老化，甚至造成醋酸菌死亡，导致醋酸发酵速率降低。由于醋酸发酵伴随着菌体的生长代谢，发酵过程产生大量的热，发酵液温度会逐渐升高，需要利用冷却装置对发酵罐进行降温、控温，以保证醋酸发酵的正常进行。多数国家和地区夏季温度较高，众多食醋生产企业在高温季节都会产生更多的降温成本，如果发酵温度控制不当会影响发酵效率，甚至造成减产、停产等。据测算，如果发酵温度能够由30 ℃提高到37 ℃，发酵冷却成本可以降低约50%。醋酸发酵温度的控制一方面要适合菌体生长，另一方面要控制最佳的发酵温度以获得较高的醋酸生成速率，因此，选育耐高温醋酸菌，在较高的温度下进行醋酸发酵生产对食醋酿造工业具有重要的现实意义。 

从自然界中筛选和诱变选育是最常用的菌种选育方法。孙文瑛等筛选到一株具有耐高温（36 ℃）高乙醇（11%）的醋酸菌，经优化后其醋酸产量达到48.6 g/L，产酸量较低（孙文瑛， 陈雄， 王志，等．耐高温高醇醋酸菌的筛选及其发酵工艺的初步优化，中国酿造，2011，1，44-47）。邵建宁等通过紫外线、硫酸二乙酯逐级诱变选育得到了两株醋酸菌，在培养温度40 ℃，培养基乙醇浓度12％(v/v)条件下发酵，酒精转化率分别达到70％和75％，但产酸速率和原料利用率较低，不能满足工业生产要求（邵建宁， 王秉峰， 路等学，等．耐高温高酒度醋酸菌选育研究．甘肃科学学报，2005，17(4)：12-14）。本发明利用从山西老陈醋醋醅中筛选得到的具有耐高温特点的巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189，根据其生长和发酵特性，将醋酸发酵过程中温度和通气量控制分为前期、中期、后期三个阶段，前期控制发酵温度为菌体最适生长温度，能够在较短时间内获得较高的菌体浓度；中期控制发酵温度为菌体最适产酸温度，能够保证较高的醋酸生成速率；后期适当降低发酵温度保证残醇的消耗，防止醋酸过氧化。利用该耐高温醋酸菌及其发酵工艺发酵所得醋酸浓度可达60-180 g/L，酒精转化率达到85％以上，具有极高的工业应用价值。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一株耐高温的醋酸发酵菌株，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案： 

本发明一方面涉及醋酸菌，所述的醋酸菌为保藏编号为CGMCC No. 8189的巴氏醋杆菌或者其传代物。

在本发明的一个方面，所述的醋酸菌主要特征如下：在固体培养基上，该菌菌落较小，颜色呈乳白色，表面光滑、湿润，粘稠，边缘较整齐；在显微镜下观察，该菌株为革兰氏阴性菌，呈杆状，易串联生长；该菌株能够在25-45 ℃下生长和产酸，可以以乙醇为底物发酵生产醋酸。 

本发明另一方面还涉及上述醋酸菌在发酵制备醋酸中的应用。 

在本发明的一个优选实施方式中，所述的发酵底物为乙醇或者含有乙醇的酒。 

在本发明的一个优选实施方式中，所述的发酵过程分为三个阶段，第一阶段发酵温度为30-37 ℃，优选为32-35 ℃，每分钟通气量为1：0.05-0.1 v/v（液体与气体的体积比）；第二阶段发酵温度为30-45 ℃，优选为35 ℃或以上，进一步优选为35-38 ℃，每分钟通气量为1：0.08-0.2 v/v（液体与气体的体积比）；第三阶段发酵温度为25-35 ℃，优选为28-30 ℃，每分钟通气量为1：0.06-0.12 v/v（液体与气体的体积比）。 

在本发明的一个优选实施方式中，所述的发酵包括如下步骤： 

（1）一级种子培养：利用250-1000 mL的摇瓶，装有种子培养基30-100 mL，接入巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189进行摇瓶培养，摇床转速为100-300转/分钟，温度为33-42 ℃，培养时间为20-30小时。

一级种子培养基组成为：葡萄糖 20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇4-9％（v/v），醋酸5-10 g/L，MgSO₄ 0.2 g/L，CaCl₂ 0.3 g/L。 

（2）二级种子培养：利用50-1000 L发酵罐进行二级种子培养，接种量为5％-15％（体积比）。温度为33-40 ℃，培养时间为20-30小时。 

二级种子培养基组成为：葡萄糖 20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇5-9％（v/v），醋酸0-15 g/L，MgSO₄ 0.1 g/L，CaCl₂ 0.2 g/L。 

（3）醋酸发酵：在发酵罐中进行，发酵罐接种量为5％-30％（v/v），发酵过程分为三个阶段，第一阶段（前期）发酵温度为30-37 ℃，每分钟通气量为1：0.05-0.1 v/v（液体与气体的体积比）；第二阶段（中期）发酵温度为30-45 ℃，每分钟通气量为1：0.08-0.2 v/v（液体与气体的体积比）；第三阶段（后期）发酵温度为25-35 ℃，每分钟通气量为1：0.06-0.12 v/v（液体与气体的体积比）。发酵方式可以是分批发酵、补料分批发酵或分割发酵。 

发酵培养基组成为：葡萄糖 20-35 g/L，酵母膏15-25 g/L，乙醇7-14％（v/v），醋酸0-10 g/L，MgSO₄ 0.1 g/L，CaCl₂ 0.2 g/L。还可以直接利用以水果为主要原料经酒精发酵获得的果酒进行果醋发酵。 

分批发酵时间48-120小时，发酵结束醋酸浓度可达到60-150 g/L，乙醇转酸率达到85%以上。 

补料分批发酵过程中连续补加乙醇，控制发酵液中乙醇浓度为10-40 g/L，发酵结束醋酸浓度可达到60- 180 g/L，发酵时间50- 150小时，乙醇转酸率达到85%以上。 

分割发酵每次取出发酵液20％-50％（体积比），补充同体积的新鲜发酵培养基，发酵结束醋酸浓度可达到60-150 g/L，发酵时间24-100小时，乙醇转酸率达到85%以上。 

本发明的特点与优点在于： 

（1）利用该菌株在较高温度下进行醋酸发酵生产，与30℃条件下发酵相比，可降低发酵冷却费用，促进企业节能减排，在降低生产成本上的具有较大优势。

（2）较高的发酵温度能提高醋酸的生成速率。利用该菌株进行醋酸发酵具有发酵速率快、乙醇转化率高等优点，可以显著提高生产效率和原料利用率，提高企业效益。  

附图说明：

图1为45 ℃条件下耐高温醋酸菌在固体培养基上产生的透明圈。

图2为巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189和醋酸菌AS1.41在37 ℃条件下进行醋酸发酵的比较。 

图3为巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189以酒精为原料分批发酵生产醋酸的过程曲线。 

图4为巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189以苹果酒为原料分批发酵生产苹果醋的过程曲线。 

图5为巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189以苹果酒为原料分割发酵生产苹果醋的过程曲线。 

微生物信息

巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurium）CP-A13，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 8189，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期2013年09月16日。

具体实施方式

实施例1  耐高温醋酸发酵菌株的获得 

（1）微生物富集培养

取山西老陈醋醋酸发酵进行到第3-6天的醋醅样品1-3 g，取样位置距醋醅表层15 cm 处，加入到装有100 mL富集培养基的摇瓶中，在摇床转数180转/分钟，42 ℃条件下富集培养36小时。

富集培养基组成:葡萄糖 20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇4%（v/v），醋酸5 g/L。 

（2）连续高温高浓度乙醇驯化培养 

将上述步骤（1）获得的发酵液转按10%（v/v）的接种量转接入装有100 mL驯化培养基的摇瓶中，在摇床转数180 转/分钟，42 ℃条件下驯化培养，36小时后转接入新鲜的驯化培养基中。

驯化培养基组成为：葡萄糖 20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇7％-12％（v/v），醋酸15-30 g/L，MgSO₄ 0.2 g/L，CaCl₂ 0.3 g/L。 

（3）重复步骤（2）5-10次。 

（4）取100 μL（3）所得发酵液，均匀涂布于选择性固体培养基表面，在45 ℃条件下培养，获得能够耐受高温的醋酸发酵菌株。 

选择性固体培养基组成为：葡萄糖 30 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨 10 g/L，乙醇 12％（v/v），CaCO₃ 5 g/L，琼脂 25 g/L。 

图1为45 ℃条件下耐高温醋酸菌在固体培养基上产生的透明圈。 

实施例2  巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189和醋酸菌AS1.41醋酸发酵性能的比较 

（1）制备种子液

分别从斜面取巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189和醋酸菌AS1.41接种于种子培养基中，在37 ℃，160转/分钟条件下摇床培养24 小时，按10%（v/v）的接种量转接入新鲜的种子培养基中进行放大培养。

种子培养基组成：葡萄糖 20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇3.5％（v/v）。 

（2）醋酸发酵 

按10％（v/v）的接种量，将（1）中获得巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189和醋酸菌AS1.41种子液分别接种至发酵罐中进行醋酸发酵。发酵过程中控制发酵温度为37 ℃，通风量为1∶0.1（v/v）/min。

发酵培养基组成为：葡萄糖 30 g/L，酵母膏20 g/L，乙醇7％（v/v），醋酸10 g/L，MgSO₄ 0.1 g/L，CaCl₂ 0.2 g/L。 

利用巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189发酵62 h，醋酸终浓度为72 g/L，初始醋酸浓度10 g/L，则乙醇转酸率为88.6 %，平均产酸速率约为1 g/ (L·h)。 

利用醋酸菌AS1.41发酵100 h，醋酸终浓度为52 g/L，初始醋酸浓度10 g/L，则乙醇转酸率为60 %，平均产酸速率约为0.42 g/ (L·h)。 

图2为巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189和醋酸菌AS1.41在37 ℃条件下进行醋酸发酵的比较。 

实施例3  利用巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189分批发酵生产醋酸 

（1）制备种子液

从斜面取巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189接种于种子培养基中，在37 ℃，160转/分钟条件下摇床培养25 小时。按10%（v/v）的接种量转接入新鲜的种子培养基中进行放大培养。

种子培养基组成：葡萄糖 20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇3.5％（v/v）。 

（2）醋酸发酵 

按12％（v/v）的接种量，将（1）中获得种子液接种至发酵罐中进行醋酸发酵。

发酵培养基组成为：葡萄糖 30 g/L，酵母膏20 g/L，乙醇8％（v/v），醋酸3 g/L，MgSO₄ 0.1 g/L，CaCl₂ 0.2 g/L。 

发酵过程中控制发酵温度为：前期（持续20小时）33 ℃，中期（持续38小时）37 ℃，后期30 ℃（持续4小时）；通风量：前期1∶0.07（v/v）/min，中期1∶0.11（v/v）/min，后期1∶0.08（v/v）/min。 

发酵62 h结束，醋酸终浓度在74 g/L，初始醋酸浓度3 g/L，则乙醇转酸率为88.8 %，平均产酸速率约为1.15 g/ (L·h)。 

图3为巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189以酒精为原料分批发酵生产醋酸的过程曲线。 

实施例4  利用巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189分批发酵生产苹果醋 

（1）制备种子液

从斜面取巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189接种于种子培养基中，在35 ℃，180转/分钟条件下摇床培养24小时。按10%（v/v）的接种量转接入新鲜的种子培养基中进行放大培养。

种子培养基组成：葡萄糖 20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇3.5％（v/v）。 

（2）苹果醋发酵 

按10％（v/v）的接种量，将（1）中获得种子液接种至发酵罐中，以苹果酒为原料发酵生产苹果醋。

苹果酒中乙醇含量为8％（v/v）。 

发酵过程中控制发酵温度为：前期（持续24小时）32 ℃，中期（持续36小时）35 ℃，后期28 ℃（持续4小时）；通风量：前期1∶0.08（v/v）/min，中期1∶0.12（v/v）/min，后期1∶0.1（v/v）/min。 

发酵64 h结束，醋酸终浓度为75 g/L，平均产酸速率1.17 g/ (L·h)，乙醇转酸率约为93 %。 

图4为巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189以苹果酒为原料分批发酵生产苹果醋的过程曲线。 

实施例5  利用巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189分割发酵生产苹果醋 

（1）制备种子液

从斜面取巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189接种于种子培养基中，在35 ℃，160转/分钟条件下摇床培养28小时。按10%（v/v）的接种量转接入新鲜的种子培养基中进行放大培养。

种子培养基组成:葡萄糖 20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇3.5％（v/v）。 

（2）起始苹果醋发酵 

按15％（v/v）的接种量，将（1）中获得种子液接种至发酵罐中，在35 ℃条件下以苹果酒为原料进行发酵。苹果酒乙醇含量为8％（v/v）。发酵过程中控制发酵温度为35 ℃。

（3）苹果醋分割发酵 

步骤（2）发酵60 h后取出30％（体积比）的发酵液，补充同体积的新鲜苹果酒，进行分割发酵，发酵过程控制发酵温度为：前期（持续6小时）35 ℃；中期（持续12小时）37 ℃，后期35 ℃（持续4小时）；通风量：前期1∶0.1（v/v）/min，中期1∶0.13（v/v）/min，后期1∶0.1（v/v）/min。

发酵24小时后重复步骤（3）进行下一次分割发酵，每次获得苹果醋中醋酸浓度可达到75 g/L，乙醇转酸率达到93%以上。 

图5为巴氏醋杆菌CGMCC No. 8189以苹果酒为原料分割发酵生产苹果醋的过程曲线。 

 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。