蛋白CD38在制备类风湿性关节炎诊断标记物中的应用

摘要

本发明公开了一种新的类风湿性关节炎诊断标记物——蛋白CD38。本发明的申请人通过流式细胞实验证明，与正常人相比，RA患者外周血淋巴细胞中CD38+细胞高表达，且其表达水平与RF水平显著相关。此外，流式检测结果显示，CD38+CD56+细胞亚群的比例也明显升高，而CD56是自然杀伤细胞（NK细胞）的细胞表面标志物，这提示CD38在RA自身免疫紊乱中起到重要作用，可以作为类风湿性关节炎诊断标记物。一种用于检测类风湿性关节炎的试剂盒，由FITC标记的CD3、CD4单克隆抗体，PE标记的CD56单克隆抗体及Percp-Cy5.5标记的CD38单克隆抗体组成。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白CD38在作为/制备类风湿性关节炎诊断标记物中的应用。

背景技术

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种自身免疫疾病，发病率为千分之三点 五。目前，临床都是通过检测患者外周血中的类风湿因子（rheumatic factor，RF）和抗瓜氨 酸化自我免疫抗（anti-CCP）为RA提供临床诊断依据。由于检测RF和anti-CCP的手段均基 于抗原抗体特异性结合的ELISA技术，因此，实验步骤多、耗时长、假阳性率高。另外，由 于我国无上述两检测标志物的知识产权，该试剂盒市场价格4000余元，医院每人份的检测 费用200～260余元。

RA主要病变部位为关节滑膜。本发明的申请人用蛋白质组学方法对RA滑膜蛋白质谱进 行了检测。通过与骨关节炎（OA）和强直性脊柱炎（AS）滑膜相比较，发现蛋白CD38在RA 滑膜中特异性高表达。CD(Cluster of Differentiation)中文为白细胞分化抗原，可作为各 类白细胞的细胞表面标记物。CD38分子分布于不成熟的造血细胞和活化的T、B淋巴细胞、 NK细胞的细胞表面，在细胞活化、黏附活性、信号转导、细胞因子产生等过程中起着重要的 作用。近来研究发现，CD38功能丧失与免疫应答损伤、代谢紊乱密切相关，可能参与自身免 疫性疾病的发病过程。RA滑膜中含有大量T细胞和B细胞及其它淋巴细胞，因此申请人检测 出特异表达的CD与RA组织病理学相一致的。

根据以上发现，本发明的申请人采用流式细胞术继续对RA患者外周血的CD38淋巴细胞 亚群进行检测分析，希望能够深入了解CD38在RA患者外周血及滑膜中的表达情况，进一步 了解RA发病的免疫机理和潜在的临床用途。流式细胞仪（英文名称：flow cytometer;FCM） 技术是将流体喷射技术、激光技术、能谱术技术、电子计算机等技术与显微荧光光度计密切 结合的一种先进的检测技术。流式细胞仪通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光 强度，可以高速分析成千上万个细胞，并能同时对一个细胞中多个细胞特征参数进行定性或 定量分析。由于流式细胞仪具有速度快、精度高、准确性好、操作简便等特点，目前县区级 及以上医院大都配备该设备用于对患者外周血进行检测。通过对各类细胞表面标记物尤其是 各类CD的分析，流式细胞仪可以检测肿瘤细胞、白血病淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干 细胞的细胞数量、比例，还可以对这些细胞进行免疫分型。流式细胞仪是常见的、低成本和 快速的检测方法。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种新的类风湿性关节炎诊断标记物——蛋白CD38， 本发明还提供了以蛋白CD38为细胞标记物制备的试剂盒及其在临床检测中的应用。

本发明的申请人通过流式细胞实验证明，与正常人相比，RA患者外周血淋巴细胞中 CD38+细胞高表达，且其表达水平与RF水平显著相关。此外，流式检测结果显示， CD38+CD56+细胞亚群的比例也明显升高，而CD56是自然杀伤细胞（NK细胞）的细胞表 面标志物，这提示CD38在RA自身免疫紊乱中起到重要作用，有助于我们更清楚地了解RA 发病的免疫机制和疾病活动状况。更重要的是，申请人发现CD38是很好的潜在的RA标志 物，可用于该病的临床检测。鉴于上述理由，本发明的申请人发明了以CD38作为RA标记 物的流式细胞临床诊断试剂盒。该试剂盒一改依托ELISA技术为基础的常用的RF和anti-CCP 检测试剂，利用流式细胞术方便、快捷、灵敏和低成本的优势。由于只需要一个CD38抗体 和各医院均配备的流式细胞仪，检验价格可降至25～50元/每人份，检测时间也降至40分钟。

一种用于检测类风湿性关节炎的试剂盒，由FITC标记的CD3、CD4单克隆抗体，PE标 记的CD56单克隆抗体及Percp-Cy5.5标记的CD38单克隆抗体组成。

进一步地，所述试剂盒中，各抗体的用量均为20μl。

所述试剂盒，在应用时，使用方法为：取待检测者的200μl外周血以及相应流式抗体各 20μl置流式上样管中，4℃避光孵育30min，利用Q-Prep Workstation（Beckman公司，美 国）进行血液标本制备后置FACSAria^TMII流式细胞仪(BD Biosciences)上机检测。本发明 进行了相关的实验研究，结果显示，RA患者外周血淋巴细胞中的CD38+细胞的比例为 17.29±5.93%，健康人外周血淋巴细胞中的CD38+细胞的比例为10.15±3.3%,RA患者外周 血淋巴细胞中CD38+细胞的比例明显高于健康人（p=1.92E-09）。在其他指标中，RA组患者 外周血中CD38+CD56+细胞的比例为8.04±5.26%，健康人者周血中的CD38+CD56+细胞的比 例为0.0556±0.0264%,RA患者外周血淋巴细胞中的CD38+CD56+细胞的比例明显高于健康人 （p=0.007）。因此，通过本发明的实验的结果，可以确信蛋白CD38可作为类风湿性关节炎诊 断标记物进行应用，检测诊断标准为：若患者外周血淋巴细胞中的CD38+细胞的比例高于15%， 则被检测患者应诊断为患有类风湿性关节炎。

本发明基于发现通过流式细胞术可检测出CD38在RA外周血中高表达，提供了一种新 的类风湿性关节炎诊断标记物——蛋白CD38，还提供了一种以蛋白CD38为细胞标记物的试 剂盒，具有简便、快速、成本低等优点。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1 通过流式细胞术检测CD38在RA外周血中的表达

本发明的申请人对103位20～74岁的RA患者进行静脉穿刺采集血液标本，其中75人为 女性。外周血被采集至EDTA-K2抗凝的真空采血管。所有患者的选取符合美国风湿病学会 （American College of Rheumatology，ACA）对RA的诊断标准：患者关节均存在三年以上 的慢性炎症，其红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate,ESR）、C反应蛋白 （C-reactive protein，CRP）及类风湿因子（rheumatoid factor，RF）检测值均明显高于 正常范围，分别为19～22mm/H，8～196U/ml及10.5～2,090U/ml。研究以包括80名女 性在内的120位24～58岁的健康人为对照。

本发明的申请人取200μl外周血与相应流式抗体各20μl置流式上样管中，4℃避光孵 育30min，利用Q-Prep Workstation（Beckman公司，美国）进行血液标本制备后置FACSAria^TMII流式细胞仪(BD Biosciences)上机检测。该实验中使用的流式抗体包括：FITC标记的CD3、 CD4、CD22单克隆抗体（Beckman），PE标记的CD56、CD25、CD19单克隆抗体（Beckman）及 Percp-Cy5.5标记的CD38单克隆抗体（Biolegend）。

本发明的申请人研究利用流式细胞法对RA患者及健康人外周血中的CD38及其他免疫标 记物进行检测。结果发现，70%患者外周血淋巴细胞都高表达CD38，RA患者外周血淋巴细胞 中的CD38+细胞的比例为17.29±5.93%，健康人外周血淋巴细胞中的CD38+细胞的比例为 10.15±3.3%,RA患者外周血淋巴细胞中CD38+细胞的比例明显高于健康人（p=1.92E-09）。 在其他指标中，RA组患者外周血中CD38+CD56+细胞的比例为8.04±5.26%，健康人者周血 中的CD38+CD56+细胞的比例为0.0556±0.0264%,RA患者外周血淋巴细胞中的CD38+CD56+ 细胞的比例明显高于健康人（p=0.007），表达上调较为明显。而在健康人中，几乎所有人淋 巴细胞低表达CD38。流式检测结果详见表1。本发明的申请人也检测了38例AS患者外周血 中CD38的表达，几乎所有AS患者淋巴细胞低表达CD38，只有各两例AS患者外周血淋巴细 胞中度表达CD38。

本发明的申请人对RA患者外周血中CD38表达水平与ESR，CRP和RF的关系也进行了研 究，发现CD38阳性细胞的表水平与RF水平成显著相关（p=0.026），而与ESR（p=0.102）、 CRP（p=0.112）的相关性不大。

表1.流式细胞术淋巴亚群分析结果