郁金香类黄酮-3’-羟化酶TfF3’H蛋白及其编码基因

摘要

本发明涉及一种郁金香类黄酮-3’-羟化酶TfF3’H蛋白及其编码基因，所述蛋白质为如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质或如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香类黄酮-3’-羟化酶活性的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的如SEQ ID NO.3所示的核酸序列。本发明中郁金香类黄酮-3’-羟化酶基因通过构建过表达载体转化到烟草中后50%以上转基因烟草花色粉色加深，相应地，转基因烟草花瓣里矢车菊素含量上升20-30%。这表明郁金香类黄酮-3’-羟化酶能作用于花色苷合成途径，影响矢车菊素合成，改变植物花色。

说明书

技术领域

本发明涉及郁金香花色苷合成途径中的关健酶及其编码基因，具体涉及一种郁金香类黄酮-3’-羟化酶TfF3’H蛋白及其编码基因，属于分子技术领域。

背景技术

花的颜色是影响植物传粉的重要因素，同时也决定一种花卉的商品价值和观赏价值。改变花色，创造新花色，可以增加花卉的商品价值和观赏价值。花朵的颜色是花瓣细胞中积累花色素的结果，花色素主要包括类黄酮、类胡萝卜素以及甜菜碱类。类黄酮是花色素的一大类，它使花朵产生从黄到紫的全部颜色。

类黄酮-3’-羟化酶（flavonoid3’-hydroxylase,F3’H，以前文献中曾称为二氢黄酮醇-3’-羟化酶，现多称为类黄酮-3’-羟化酶）属于细胞色素P450单加氧酶，它具有催化多种依赖NADPH或NADH的底物氧化反应的功能，在植物类黄酮的合成以及次生代谢中起重要作用。它能在辅因子NADPH和O₂的作用下，催化单加氧反应，分别将柚皮素（naringenin）和二氢山奈酚（dihydrokaempferol）B-环的3’位置羟基化，催化形成圣草酚和二氢槲皮素。而圣草酚和二氢槲皮素是合成花色素的重要前体物质，是花的重要成色物质，对于花青素的生物合成起重要作用，从而形成不同的花色素苷，使植物表现不同的花色。F3’H基因的表达活性会直接影响花朵的最终颜色，例如在矮牵牛中表达其自身得到的F3’H基因使得缺失F3’H基因和F3’5’H基因的淡粉色矮牵牛变为深粉色；将龙胆F3’H基因转化入烟草中，发现在转基因烟草体内出现花青素和槲皮素含量的增加，从而影响了烟草的花色；F3’H基因的缺失时，裂叶牵牛（Ipomoea nil）、三色牵牛（Ipomoea tricolor）和圆叶牵牛（Ipomoea purpurea）会产生含有天竺葵色素衍生物的浅红色的花。因此，对F3’H基因表达进行调控是改变花色的途径之一。

F3’H基因已在多种植物中得到克隆，但在郁金香（Tulipa fosteriana）中，F3’H基因的克隆、表达模式及F3’H蛋白编码序列目前尚不清楚。目前，未有任何与郁金香F3’H蛋白及其编码基因序列相关的文献报道。

发明内容

本发明填补郁金香F3’H基因家族成员的克隆、表达模式分析以及郁金香F3’H蛋白及其编码基因的空白，提供了一种郁金香TfF3’H蛋白序列，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。本发明公开了郁金香TfF3’H蛋白及其核苷酸序列在郁金香不同器官、不同发育阶段的表达模式；构建了TfF3’H基因过表达载体并转化烟草，分析了TfF3’H基因对转基因烟草花色苷合成及花色的影响。利用本发明提供的郁金香类黄酮3’-羟化酶TfF3’H，能为基因工程改变花色，获得创新花色提供一种有效的技术手段。此外，此外，利用本发明的郁金香TfF3’H基因，通过各种常规筛选方法，可筛选出与F3’H发生相互用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明是通过以下技术方案实现的，

本发明目的在于提供一种具有郁金香类黄酮-3’-羟化酶活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香类黄酮-3’-羟化酶活性的由（a）衍生的蛋白质。该蛋白质在花朵花瓣的不同着色阶段、不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。

优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。

进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。

另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。

优选的，所述核酸序列具体为：

（a）碱基序列如SEQ ID NO.3第1～1533位所示；

或（b）与SEQ ID NO.3第1～1533位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；

或（c）能与SEQ ID NO.3第1～1533位所示的核酸进行杂交的序列。

优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.3第1～1533位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。

此外，本发明还提供了一种检测上述核酸序列的探针，所述探针为具有上述核酸序列8～100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码郁金香F3’H相关的核酸分子。

本发明提供的分离出的DNA分子，该分子包括：具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的DNA分子；或者编码具有郁金香TfF3’H蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且与SEQ IDNO.3所示序列有至少70%的同源性；或者能与SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸序列杂交。

在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

在本发明中，术语“郁金香类黄酮-3’-羟化酶蛋白编码序列”指编码具有郁金香TfF3’H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3所示序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3所示序列的同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3所示序列中从核苷酸第1～1533位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的郁金香TfF3’H相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3所示序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加为60个以内核苷酸。

在本发明中，术语“郁金香类黄酮-3’-羟化酶TfF3’H蛋白”是指具有郁金香TfF3’H蛋白活性的SEQ ID NO.4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然郁金香TfF3’H相关相同功能的、SEQ ID NO.4所示序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括郁金香TfF3’H蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的郁金香TfF3’H多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与郁金香TfF3’H相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用郁金香TfF3’H多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“郁金香TfF3’H保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.4所示序列的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

最初的残基代表性的取代优选的取代Ala(A)Val;Leu;IleValArg(R)Lys;Gln;AsnLys

Asn(N)Gln;His;Lys;ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro;AlaAlaHis(H)Asn;Gln;Lys;ArgArgIle(I)Leu;Val;Met;Ala;PheLeuLeu(L)Ile;Val;Met;Ala;PheIleLys(K)Arg;Gln;AsnArgMet(M)Leu;Phe;IleLeuPhe(F)Leu;Val;Ile;Ala;TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr;PheTyrTyr(Y)Trp;Phe;Thr;SerPheVal(V)Ile;Leu;Met;Phe;AlaLeu

发明还包括郁金香TfF3’H蛋白或多肽的类似物。这些类似物与郁金香TfF3’H相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、γ-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析郁金香TfF3’H基因产物的表达模式，即分析TfF3’H基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

本发明检测样品中是否存在郁金香TfF3’H相关核苷酸序列的检测方法，包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于郁金香TfF3’H相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15～50个核苷酸。

此外，根据本发明的郁金香TfF3’H核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选郁金香TfF3’H相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与郁金香TfF3’H相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选郁金香cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对郁金香TfF3’H相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自郁金香的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别与郁金香TfF3’H相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的郁金香TfF3’H相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

在获得了有关序列后，可用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产（Stewart等人，（1969）固相多肽合成，WH Freeman Co.,San Francisco;Merrifield J.（1963）J.Am Chem.Soc85:2149-2154）。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪（Foster City,CA）来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的郁金香TfF3’H蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与郁金香TfF3’H发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明郁金香类黄酮-3’-羟化酶基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根癌农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等。如pBin系列载体、pBI系列载体、Gateway^TM系列载体、pCAMBIA系列载体或其它衍生植物表达载体，所述的出发载体还可以为在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、pUC系列载体等。

使用本发明中郁金香类黄酮-3’-羟化酶基因或其同源序列构建表达载体时，在其转录超始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。组成型启动子可为花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子等；组织特异性启动子可以为根、叶片、花瓣、种子等特异性表达启动子；诱导型启动子可为受乙烯、书醇等诱导的启动子。上述启动子可以单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，利用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物基因、具抗性的抗生素标记物基因、或是抗化学试剂标记基因等。所述含新霉素磷酸转移酶（NPTII）基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物等进行筛选，含潮霉素转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

本发明的一个具体实施方式是以pHB（pCambia1300切除GUS基因的改造载体）为植物表达载体，构建含有本发明郁金香类黄酮-3’-羟化酶基因的过表达植物载体pHB-TfF3’H。携带有本发明郁金香类黄酮-3’-羟化酶基因或其同源序列的植物表达载体可通过原生质体-化学介导法、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，培养花色苷合成变化的植物细胞系、组织或器官，并进一步培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果、愈伤组织、根、茎尖、叶片和种子等。

郁金香为世界十大切花之一，观赏价值极高，应用广泛，人们对新花色的需求也越来越大。首次克隆郁金香花瓣类黄酮合成通路分支点处的关键酶类黄酮-3’-羟化酶TfF3’H蛋白的编码序列，并将本发明中郁金香类黄酮-3’-羟化酶基因通过构建过表达载体转化到烟草中，结果发现在相同的培养条件下，转基因烟草与对照（未转化）烟草相比，50%以上转基因烟草花色的粉色加深，相应地，转基因烟草花瓣里矢车菊素含量上升20-30%。这表明郁金香类黄酮-3’-羟化酶能作用于花色苷合成途径，影响矢车菊素合成，改变植物花色。类黄酮-3’-羟化酶为花色素合成途径中矢车菊素合成的关键酶，本发明提供的郁金香类黄酮-3’-羟化酶基因TfF3’H为利用基因工程改变花色，获得创新花色提供了一种有效的技术手段。此外，利用本发明的郁金香TfF3’H蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与郁金香TfF3’H发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的郁金香TfF3’H基因与百合F3’H基因mRNA的核苷酸序列的同源比较（GAP）结果；

图2为本发明的郁金香TfF3’H基因与百合F3’H基因mRNA的核苷酸序列的同源比较（GAP）结果；

图3为本发明的郁金香TfF3’H基因与百合F3’H基因mRNA的核苷酸序列的同源比较（GAP）结果；

图4为本发明的郁金香TfF3’H与百合F3’H的氨基酸序列的同源比较（FASTA）结果，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

图5为植物过表达载体pHB-TfF3’H构建示意图。

图6为未转化烟草（a）和转TfF3’H基因烟草(b,c)的花色比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、郁金香TfF3’H基因的克隆

1.植物材料的获得

将健康、大小一致的郁金香球茎（Tulipa fosteriana‘Shangnongzaoxia’，已通过上海市农作物品种审定委员会审定。编号：沪农品认花卉2011第004号）按常规种植并进行田间管理，待花朵完全开放，花瓣完全着色时采集花瓣组织，用于提取RNA。

2.RNA的抽提

利用“RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒”抽提总RNA（RNA prep pure PlantKit：天根生化科技（北京）有限公司）。用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计（Thermo Scientific NANODROP1000Spectrophotometer）上测定RNA的纯度及浓度。

3.基因的全长克隆

根据其它物种中F3’H基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法（3’-Full RACE Core Set Ver.2.0：宝生物工程（大连）有限公司，SMARTer^TM RACEcDNA Amplification Kit:Clontech Laboratories,Inc.）进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

（1）RT-PCR获得基因中间片段

将提取的RNA进行反转录（Prime ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit：宝生物工程（大连）有限公司），以第一链cDNA为模板，利用引物F1（SEQ ID NO.1）和R1（SEQ ID NO.2）进行PCR，扩增得到约1000bp片段，回收并连接到pMD18-T Simplevector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记（Big-Dye,Perkin-Elmer,USA）的方法，在ABI377测序仪（Perkin-Elmer,USA）上进行测序。测序结果通过在NCBI网站进行BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对已有的数据库（GenBank），知其核酸序列及编码蛋白与已知的百合属类黄酮-3’-羟化酶基因的同源性很高，故初步认为它是一个类黄酮-3’-羟化酶基因。

（2）3’RACE

3’端的序列通过使用3’-Full RACE Core Set Ver.2.0：宝生物工程（大连）有限公司获得，二轮巢式PCR完成3’末端序列的扩增：

第一轮：Outerprimer+F3’H3-1（5’-CTTCCACATCCCCAAGCACGCCACT-3’）

第二轮：Innerprimer+F3’H3-2（5’-GTGGAGTTCAAGCCTTCCCGGTTCA-3’）

Outerprimer和Innerprimer为试剂盒提供。3’RACE得到TfF3’H的3’末端序列（476bp），回收，连接到pMD18-T Simple vector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记（Big-Dye,Perkin-Elmer,USA）的方法，在ABI377测序仪（Perkin-Elmer,USA）上进行测序，测序结果通过在NCBI网站进行BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对已有的数据库（GenBank），知其核酸序列及编码蛋白与已知的百合属类黄酮-3’-羟化酶基因的同源性高。

（3）5’RACE

5’端的序列通过使用SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit获得，以5’RACEready cDNA为模板，通过二轮巢式PCR获得：

第一轮：UPM+F3’H5-1（5’-GACTGCGGGGTCTCGAGCAATGG-3’）

第二轮：NUP+F3’H5-2（5’-ACCAGCACACTCAGCAAATCCCTCCCA-3’）

UPM和NUP为试剂盒提供。5’RACE扩增获得TfF3’H的5’末端序列（836bp），回收连接后用同上面一样的方法进行测序。

将通过上述3种方法获得的序列的测序结果进行拼接，将拼接序列提交BLAST分析，结果证明从郁金香中新得到的TfF3’H基因确为一个与类黄酮-3’-羟化酶相关的基因。将测序结果结合NCBI的ORF Finding（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf）预测，发现了郁金香TfF3’H基因的起始密码子与终止密码子，根据获得的序列，分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物ORF-F（5’-ATGGAAGCTCAACCTCTCCTCCT-3’），ORF-R（5’-TCACTCCTTCCCATACGCCCTCGCT-3’），以郁金香cDNA为模板进行PCR，扩增得到1533bp郁金香TfF3’H蛋白的全长编码基因序列（SEQ ID NO.3）。

实施例2、郁金香TfF3’H基因的序列信息与同源性分析

郁金香TfF3’H全长CDS开放读码框序列为1533bp，详细序列见SEQ ID NO.3所示序列；根据CDS开放读码框序列推导出郁金香TfF3’H的氨基酸序列，共510个氨基酸残基，分子量为55482.2道尔顿，等电点（pI）为6.98，详细序列见SEQ ID NO.4所示序列。

将郁金香TfF3’H的CDS开放读码框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与百合F3’H基因（GenBank登陆号AB699162.1）在核苷酸水平上具有82%的相同性，如图1、图2和图3所示；在氨基酸水平上，它与百合F3’H基因（GenBank登陆号BAM28972.1）也有88%的一致性和94%的相似性，如图4所示。由此可见，郁金香TfF3’H基因与百合F3’H基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。

实施例3、郁金香F3’H基因在花朵不同发育阶段及在郁金香不同组织中的表达差异性

1.材料的获得

在郁金香花朵的4个不同发育阶段（花蕾，花瓣未着色；花蕾，花瓣开始着色；花朵部分开放，花瓣未完全着色；花朵完全开放，花瓣完全着色），于田间采取其花瓣，同时采取其叶片、地上茎、花部器官雄蕊、雌蕊、花瓣（各着色阶段花瓣的混合样），将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。

2.RNA的提取

利用RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒（RNA prep pure Plant Kit：天根生化科技（北京）有限公司）提取郁金香不同发育阶段花朵的花瓣以及不同组织中的RNA。

3.RNA的完整性、纯度、浓度的确定

用普通琼脂糖凝胶电泳（胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min）检测完整性；电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀以及A₂₆₀/A₂₃₀约为2.0左右；用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。

4.cDNA的获得

以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScript^TM RT reagent KitPerfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。

5.实时荧光定量PCR分析TfF3’H基因在各器官与组织中的表达量

根据已经获得的郁金香Tf3’H基因的序列，利用引物设计软件primer premier5.0设计用于Real-time PCR中郁金香TfF3’H基因定量分析的特异性引物：F3’H-F（5’-CCTTCCTCCAAGCCATCA-3’）和F3’H-R（5’-GTCGCTACCTTTCACATCCA-3’），内参基因为Actin（GenBank登陆号AB456684），其引物为Actin-F（5’-AGTCAGTCATACAGTGCCAATC-3’），Actin-R（5’-TCATAAGAGAGTCGGTCAAATCC-3’）。

6.制作目的基因及内参基因的标准曲线

用EASY Dilution（试剂盒提供）将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线；分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物；通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。

7.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析

以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在BIO-RAD Chromo4实时定量仪上进行，反应体系为20μL，反应采用三步法，94℃变性20s，接着41个循环：94℃15s；56℃15s；72℃25s；每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生；

采用2^-△△Ct法作相对定量分析，结果表明TfF3’H基因的表达水平随着花朵的发育逐渐上升缓缓上升。花瓣完全着色时TfF3’H的表达量为花瓣刚着色阶段表达量的2.6倍，说明该基因的表达与花瓣的着色有相关性；TfF3’H基因在茎、叶、雄蕊、雌蕊、花瓣中均有表达。其中，TfF3’H基因在雄蕊中表达量最高，在叶片中表达量最低，表达水平从高到低依次为雄蕊、雌蕊、花瓣、茎、叶，这说明TfF3’H基因的表达具有明显的空间差异性。

实施例4、郁金香TfF3’H转基因功能验证

1.植物过表达载体的构建

（1）克隆载体的构建

在扩增TfF3’H基因ORF的上下游引物两端分别加上HindⅢ和XbalⅠ酶切位点。上游引物序列为5’-CCAAGCTTATGGAAGCTCAACCTCTCCT-3’，下游引物为5’-GCTCTAGATCACTCCTTCCCATACGCC-3’。通过PCR扩增TfF3’H cDNA的ORF片断，电泳后在紫外灯下割取目的条带，用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒回收片断。

将回收片断连接至pMD18-T vector，构建pMD18-TfF3’H克隆载体，连接体系见说明书。冻融法转化大肠杆菌DH5α感受态，在含100mg·l^-1氨苄的LB固体平板培养基上37℃培养过夜。LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g·l^-1，酵母提取物5g·l^-1，氯化钠10g·l^-1。调节pH至7.0，灭菌。LB固体培养基配方为在LB液体培养基中，加入15g·l^-1琼脂粉，灭菌。挑取单菌落PCR鉴定，送阳性菌落测序确定测序的正确性。将测序正确的含pMD18-TfF3’H载体的DH5α菌落，加入2ml含100mg·l^-1氨苄的LB液体培养基过夜培养到OD₆₀₀值约为1.0。使用质粒提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取pMD18-TfF3’H载体，具体操作参照试剂盒说明书。

使用的限制性内切酶HindⅢ和XbalⅠ同时对pMD18-TfF3’H载体和植物表达载体pHB在37℃进行双酶切，时间15min。酶切体系参照酶切说明书。对酶切产物进行凝胶电泳，电泳后用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒分别回收酶切产物。

使用DNA Ligation Kit试剂盒（TaKaRa,China）对酶切后获得的目的片断和pHB载体进行连接，连接方法参见试剂盒说明书。将连接产物冻融法转化感受态DH5α菌株，在含100mg·l^-1卡那霉素的LB固体平板培养基上37℃培养过夜，挑取单菌落，PCR鉴定筛选含pHB-TfF3’H植物过表达载体的DH5α菌落。挑取含pHB-TfF3’H植物过表达载体的DH5α菌落，加入2ml含100mg·l^-1卡那霉素的LB液体培养基过夜培养至OD₆₀₀值约为1.0。使用质粒提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取pHB-TfF3’H重组质粒，具体操作参照试剂盒说明书。LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g·l^-1，酵母提取物5g·l^-1，氯化钠10g·l^-1，调节pH至7.0，灭菌。LB固体培养基配方为在LB液体培养基中，加入15g·l^-1琼脂粉，灭菌。

2.植物过表达载体转化根癌农杆菌

将pHB-TfF3’H植物过表达载体液氮冻融法转化感受态根癌农杆菌菌株GV3101，具体方法：向100μl GV3101感受态细胞中加入至少6μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃热击3min，迅速置于并上1-2min；加入800μl含50mg·l^-1利福平和50mg·l^-1庆大霉素的YEB培养基，28℃，200rpm复苏3h；4000rpm离心5min，吸掉800μl LB培养基；混匀剩余菌液，涂抹于含100m g·l^-1卡那霉素，50mg·l^-1利福平，和50m g·l^-1庆大霉素的YEB平板上；28℃倒置培养30-48h；然后以ORF-F和ORF-R为引物进行阳性克隆的PCR检测。YEB液体培养基配方：牛肉浸膏5g·l^-1，胰蛋白胨5g·l^-1，酵母提取物1g·l^-1，蔗糖5.0g·l^-1，MgSO₄·7H₂O0.5g·l^-1，调节pH至7.0，灭菌。YEB固体培养基配方为在YEB液体培养基中加入15g·l^-1琼脂粉。

3.农杆菌介导的烟草遗传转化

本实验中使用材料为烟草(Nicotiana tabacum)。所用的培养基配方：

MS_O:MS粉+蔗糖30g·l^-1,琼脂粉15g·l^-1，pH5.8；

MS₁(共培养培养基):MS_O+6-BA2mg·l^-1+NAA O.2mg·l^-1,pH5.8；

MS₂(筛选培养基):MS₁+潮霉素50mg·l^-1+头孢霉素300mg·l^-1,pH5.8；

MS₃(生根培养基):1/2MS_O+潮霉素50mg·l^-1+头孢霉素300mg·l^-1,pH5.8；

(1)农杆菌的活化

从YEB培养平板上挑取经PCR检测后的农杆菌的阳性单菌落，接种于5ml YEB液体培养基中(含100m g·l^-1卡那霉素，50mg·l^-1利福平，和50mg·l^-1庆大霉素)。28℃，200rpm振荡培养24h；再从中吸取800μl菌液转接于40ml含相应抗生素的YEB液体培养基中，继续在28℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀值0.6。4℃，5000rpm离心10min收集菌体，用一定体积的MS₀液体培养基悬浮菌体至OD₆₀₀值为0.4左右用于浸染。

(2)烟草的遗传转化

将种在MS₀基本培养基上的无菌烟草，切去叶片边缘和主要叶脉，切成0.4×0.6cm大小。将切好的外植体在上述OD₆₀₀为0.4的农杆菌菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，将小叶片摆放在铺有一层滤纸的芽分化培养基MS₁上进行共培养（叶背面向上），25℃暗培养3天。将经过共培养的烟草外植体转移到含有抗生素的抗性芽筛选培养基MS₂中进行培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，2-3周后即可生芽。待抗性芽生长至1-2cm高时，切下小芽转入生根培养基MS₃中诱导生根，1-2周后就会有不定根形成。等根系发达后,将烟草植株取出,用无菌水洗净掉固体培养基,再移入土壤中,刚开始几天用薄膜盖几天,待植株健壮后再取掉薄膜,置于温室中25℃培养。

4.转基因烟草的鉴定及矢车菊含量的测定

（1）阳性株的鉴定

采用CTAB法提取以转基因烟草基因组DNA，以此DNA为模板，用扩增TfF3’H基因ORF片断的引物ORF-F和ORF-R进行PCR扩增以筛选转基因阳性植株。PCR反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；58℃，1min；72℃2min（35个循环）；72℃延伸10min。

（2）转基因植株矢车菊素含量的测定

测定转基因阳性植株和对照植株矢车菊苷元含量的。总花色苷元的提取方法如下：称取新鲜花瓣样品约0.2g,液氮急速冷却后直接研磨成粉末,用2ml提取液(V_乙醇∶V_乙酸：V_水=10：1：9)在4℃浸提24小时；4000rpm离心10min,取上清加入4ml3M的HCl,在100℃水浴90min用以水解花色苷的糖苷；水解结束后加入2ml的异戊醇萃取花色苷元。之后用中速滤纸过滤,再用过滤器(0.2μm)过滤待测,之后直接用于UPLC分析。花色苷元的分离与含量的测定采用美国Waters公司的超高效液相色谱–二极管阵列器（Ultra performance liquid chromatography with a photodiode arraydetector，UPLC–PAD）检测，该系统装备有高压二元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、色谱工作站（Masslynx V4.1数据处理软件）。色谱柱为ACQUITYUPLCBEH的C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm）。UPLC分析条件：柱温45℃，流速0.5ml·min^-1，进样体积2μl。流动相A液为0.1%的甲酸溶液（V_甲酸：V_水=0.1：99.9）；B液为含0.1%甲酸的乙腈（V_甲酸：V_乙腈=0.1：99.9）。梯度洗脱程序：0min，93%A，7%B；1min，93%A，7%B；11min，82%A，18%B；11.5min，10%A，90%B；13min，10%A，90%B；13.1min，93%A，7%B；15min，93%A，7%B。在特征吸收波长520nm下，通过与标准品矢车菊苷元（Cyanidin chloride，Sigma）的保留时间比对，确定提取物中矢车菊苷元的组分。花色苷提取物中矢车菊苷元的含量通过与已知浓度标准品的峰面积的比例进行换算。

结果表明，种植于温室的转基因烟草与对照（未转化）烟草相比，在相同的培养条件下，50%以上转基因烟草花色由粉色变为深粉色。如图6所示，a为未转化的烟草花朵，b、c为转TfF3’H基因烟草的花朵，可以看到转基因烟草的花朵花色较未转化烟草颜色更深。相应地，转基因烟草花瓣里矢车菊素含量上升20-30%。这表明TfF3’H能作用于花色苷合成途径，影响矢车菊素合成，改变植物花色。

实施例5、郁金香TfF3’H酶功能验证

1.原核表达载体的构建

在扩增TfF3’H基因ORF片断的上下游引物两端分别加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。上游引物序列为5’-CGCGGATCCATGGAAGCTCAACCTCTCCT-3’，下游引物为5’-ATTCTCGAGTCACTCCTTCCCATACGCC-3’。通过PCR扩增TfF3’H cDNA的ORF片断，电泳后在紫外灯下割取目的条带，用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒回收片断。

使用的限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ同时对TfF3’H片断和原核表达载体pMAL-c2x(New England BioLabs)在37℃进行双酶切，时间15min。酶切体系参照酶切说明书。对酶切产物进行凝胶电泳，回收。

使用DNA Ligation Kit试剂盒（TaKaRa,China）对酶切后的TfF3’H片断和pMAL-c2x进行连接，连接方法参见试剂盒说明书。将连接产物转化大肠杆菌BL21感受态。在含50mg·l^-1氨卞的LB固体平板培养基上37℃培养过夜。挑取单菌落，PCR鉴定阳性后送测序确认TfF3’H片断与pMAL-c2x成功连接。LB液体及固体培养基的配方同上。

2.TfF3’H的融合蛋白诱导

挑选生长状态良好的BL21菌株单克隆，转接至10ml含50mg·l^-1氨卞的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。按1：50的比例转接至300ml含50mg·l^-1氨卞的LB液体培养中37℃，200rpm培养至OD₆₀₀为0.8左右。将培养物转入20℃的摇床中200rpm,振荡培养1小时。加入1ml1M IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)(终浓度为1mM)，继续培养6h诱导融合蛋白表达。

将过夜培养物4℃，12000rpm离心10min，收集菌体，弃上清。用50ml裂解溶液重悬沉淀，然后冰上放置10min。在冰浴条件下，使用超声波（200-300w）破碎细胞，超声/间隔=10s/10s,6次。随后将破碎的细胞在4℃，12000rpm条件下离心30min，收集上清液用于纯化。在上清中加入1ml用裂解溶液清洗并平衡的直链淀粉树脂(Amylose resin)(New England Biolabs)，同时再向溶液加入另50ml裂解溶液，4℃孵育过夜。孵育后4℃，1000rpm离心1min后，弃上清。用50ml清洗溶液清洗树脂三次后，用1ml洗脱溶液洗脱蛋白。菌体裂解溶液的配方：20mMTris-HCl，pH8.0，200mM氯化钠，1mM PMSF，EDTA-free的蛋白酶抑制剂(Promega)，10％甘油；清洗溶液的配方：20mM Tris-HCl，pH8.0，200mM氯化钠，10％甘油；洗脱溶液的配方：20mM Tris-HCl，pH8.0，200mM氯化钠，50mM麦芽糖，10％甘油。

将收集到的TfF3’H融合蛋白与底物进行孵化。孵化的底物为柚皮素和二氢山奈酚。孵化体系体积为500μl,包含2-40μM底物，200mg TfF3’H融合蛋白提取物,1mMNADPH，0.1M磷酸二氢钾（pH7.4）。反应条件：25℃反应30min。反应结束后用500μl的乙酸乙酯萃取两次，萃取液经液氮吹干后再溶解于200μl甲醇溶液中。然后进行UPLC分析。标准品黄烷酮[柚皮素和圣草酚(eriodictyol)]购自于ExtrasyntheseSA公司，标准品二氢黄酮醇[二氢山奈酚和二氢槲皮素（hidydroquercetin）]构自于PLANTECH公司。在280nm波长下对应标准品的洗脱时间确定孵化产物的种类；根据相应标准品的浓度和峰面积换算产物中相应生成物的含量。

结果显示，柚皮素和二氢山奈酚在TfF3’H融合蛋白的作用下生成了圣草酚和二氢槲皮素，并且TfF3’H对二氢山奈酚的活性要高于对柚皮素的活性。这个结果表明TfF3’H能使柚皮素和二氢山奈酚的B环3’位点发生羟化作用，具有类黄酮-3’-羟化酶的活性，同时还具有一定的底物选择性。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。