α-地中海贫血筛查试剂盒及其在产前筛查中的应用

摘要

本发明公开了一种α-地中海贫血筛查试剂盒及其在产前筛查中的应用，属于α-地中海贫血产前筛查技术领域。α-地中海贫血筛查试剂盒包括：（1）阴性对照样本；（2）阳性对照样本；（3）PCRMasterMIX；（4）PCR引物。其应用通过设计的引物对孕妇外周血中的胎儿DNA进行扩增来实现α-地中海贫血的产前筛查。本发明采集孕妇外周血进行α-地中海贫血的产前筛查，无需穿刺羊膜腔和插入绒毛组织，对胎儿无任何创伤，安全可靠；准确率可以达到99.99%，填补了α-地中海贫血无创伤产前筛查的技术空白，降低了病患儿的出生率。

说明书

技术领域

本发明涉及α-地中海贫血产前筛查。

背景技术

地中海贫血又称海洋性贫血，是一组遗传性疾病。其发病机制是合成血红蛋白的珠蛋白链减少或缺失导致血红蛋白结构异常，这种含有异常血红蛋白的红细胞变形性降低，寿命缩短，可以提前被人体的肝脾等破坏，导致贫血甚至发育等异常，这种疾病也就是医学上讲的溶血性贫血。

α-地中海贫血：人类α-珠蛋白基因簇位于16Pter -p13.3，每条染色体各有2个α-珠蛋基因，一对染色体共有4个α-珠蛋白基因。大多数α-地中海贫血（简称α地贫）是由于α-珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。若仅是一条染色体上的一个α基因缺失或缺陷，则α链的合成部分受抑制，称为α+地贫；若每一条染色体上的2个α基因均缺失或缺陷，称为 α0地贫。

重型α地贫 是α0地贫的纯合子状态，其4个α珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α链生成，因而含有α链的HhA、HbA2和HbF的合成均减少。患者在胎儿期即发生大量γ链合成γ4（Hb Bart's）。Hb Bart's对氧的亲合力极高，造成组织缺氧而引起胎儿水肿综合征。中间型和α地贫是α0和 α+地贫的杂合子状态，是由3个α-珠蛋白基因缺失或缺陷所造成，患者仅能合成少量α链，其多余的β链即合成HbH（β4）。HbH 对氧亲合力较高，又是一种不稳定血红蛋白，容易在红细胞内变性沉淀而形成包涵体，造成红细胞膜僵硬而使红细胞寿命缩短。

轻型α地贫 是α+地贫纯合子或α0地贫杂合子状态，它仅有2个α-珠蛋白基因缺失或缺陷，故有相当数量的α链合成，病理生理改变轻微。静止型α地贫是α+地贫杂合子状态，它仅有一个α基因缺失或缺陷，α链的合成略为减少，病理生理改变非常轻微。 

    迄今为止，医学上对于α-地中海贫血尚无有效的根治方法，因此开展产前基因筛查，防止新患儿出生，阻断有害基因下传是目前预防α-地中海贫血唯一可行有效的方法。

目前，阶段对于诊断地中海贫血常用的方法包括：Southern杂交，多重Gap-PCR，多重连接酶依赖探针扩增技术（MLPA）,PCR-寡核苷酸探针（ASO）法，实时荧光定量PCR，斑点杂交，直接测序技术等，以上诊断技术都建立在羊膜腔穿刺、绒毛吸取等侵入性基础上进行的细胞遗传学诊断，虽然诊断准确，但因其操作有创伤性，易引起宫内感染、流产、甚至对胎儿有一定的影响，属于侵入性检查。

发明内容

本发明提供一种α-地中海贫血筛查试剂盒，引物设计合理，可以实现α-地中海贫血的产前筛查，准确率高，有效防止新患儿出生，从根源上阻断有害基因下传，从而实现α-地中海贫血的预防。

本发明所采取的技术方案是：

一种α-地中海贫血筛查试剂盒，包括：（1）阴性对照样本；（2）阳性对照样本；（3）PCR Master MIX；（4）PCR引物；所述PCR引物是针对HBA1和HBA2基因的。

针对HBA1基因的引物包括3个引物对，其基因序列如SEQ ID NO.1-6。

针对HBA2基因的引物包括3个引物对，其基因序列如SEQ ID NO.7-12。

本发明还提供了α-地中海贫血筛查试剂盒在产前筛查中的应用，采集孕妇外周血进行α-地中海贫血的产前筛查，无需穿刺羊膜腔和插入绒毛组织，对胎儿无任何创伤，安全可靠；准确率可以达到99.99%，填补了α-地中海贫血无创伤产前筛查的技术空白，降低了病患儿的出生率。

α-地中海贫血筛查试剂盒在产前筛查中的应用，包括下述步骤：

（1）从孕妇外周血中提取游离胎儿DNA；

（2）以胎儿DNA为模板，用试剂盒中PCR Master MIX和PCR引物进行PCR扩增；

（3）对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测有条带后对PCR扩增产物进行酶反应纯化；

（4）用PCR引物对纯化后的PCR扩增产物进行测序反应；

（5）对PCR测序反应产物进行纯化；

（6）将纯化后的PCR测序反应产物放入测序仪进行序列分析；

（7）测序结果与阳性对照样本和阴性对照样本对比，确认婴儿是否患有α-地中海贫血。

胎儿DNA可以采用常规方法进行提取。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

1. 本发明的试剂盒，引物设计合理，可以实现α-地中海贫血的产前筛查，准确率高，有效防止新患儿出生，从根源上阻断有害基因下传，从而实现α-地中海贫血的预防。

2.本发明采集孕妇外周血进行α-地中海贫血的产前筛查，无需穿刺羊膜腔和插入绒毛组织，对胎儿无任何创伤，安全可靠；准确率可以达到99.99%，填补了α-地中海贫血无创伤产前筛查的技术空白，降低了病患儿的出生率。

具体实施方式

实施例

从3个医院中采取100份孕妇外周血各10mL，按照下述步骤进行α-地中海贫血的产前筛查。

（1）从孕妇外周血中提取游离胎儿DNA；

①无菌操作用15mL真空EDTA抗凝采血管采全血10mL， 避免溶血。

②低温离心机800g离心， 4°C， 10 分钟， 吸取上清液。

③取上清液（血浆约4-5mL）转入15 mL新聚丙烯试管，1600g 、4°C，离心 10 分钟。

④取上清液1mL (2.0 mL新聚丙烯试管)，加入1/10体积的蛋白酶K buffer (10X)，脉冲式震荡混匀30 秒；再加入蛋白酶K（proteinase K，30∪/mL,不含DNase和RNase），使终浓度为0.1-1 mg/mL，脉冲式震荡混匀30 秒。

⑤60°C水浴30分钟，4°C 低温，16,000g 离心10分钟。

⑥吸取含游离DNA片段的上清液，冷却至4 ℃, 加等体积Tris饱和酚, 震荡混匀30 秒充分混匀。4 ℃低温条件，4600g 离心30分钟；吸取上清液于另一新管中，重复一次。

⑦吸取上清液至新管，加等体积氯仿/异戊醇混合液(体积比24∶1), 震荡30秒充分混匀, 4 ℃低温条件下4600g离心5 分钟，吸取上层溶液。

⑧加入2. 5 倍体积冷95 %乙醇, 震荡30秒充分混匀。

⑨4 ℃低温条件，高速离心5 分钟，取得DNA沉淀；

⑩弃上清液，用1 mL的70 % 冷乙醇清洗DNA沉淀3- 4 次；抽真空干燥，或自然风干(倒置)，加100μl TE溶解DNA沉淀。

（2）以胎儿DNA（即fDNA）为模板，用试剂盒中PCR Master MIX和PCR引物进行PCR扩增，PCR引物见表1，扩增反应条件见表2。

表1  PCR引物对的核苷酸序列

表2 扩增反应条件

对上述反应体系进行PCR反应，反应条件见表3：

表3 PCR反应条件

（3）对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测有条带后对PCR扩增产物进行酶反应纯化，纯化试剂见表4：

表4 纯化试剂

加好各反应体系后，在PCR仪器上进行反应，反应条件见表5：

表5 纯化反应条件

（4）对纯化后的PCR扩增产物进行测序反应，反应试剂如表6：

表6 测序反应试剂

加好各试剂后，放在PCR仪上进行测序反应，反应条件如表7：

表7  测序反应条件

（5）对PCR测序反应产物进行纯化；

a.从PCR仪上取下反应板，4000rpm离心30 s。

b.向孔中加入30uL（酒精：乙酰胺=1:7），充分震荡2min，离心机4000rpm，4℃离心30分钟。

c.离心完毕后取出反应板，倒出孔中液体，板子倒扣在叠好的吸水纸上，倒离心(到700转停止)。

d.加50uL预冷的75%乙醇，充分振荡2min，离心10分钟，离心完毕后取出反应板，倒出孔中液体，板子倒扣在叠好的吸水纸上，倒离心(到700转停止)。

e.避光风干20 min，加10uLHI-DI， 振荡后短时间离心（4000rpm离心1min）。

f.变性（96℃，2min）。变性完后迅速取出放在冰箱内2min，取出进行离心（4000rpm离心30 s）。

（6）将纯化后的PCR测序反应产物放入测序仪进行序列分析；

（7）测序进行拼接并与阳性对照样本和阴性对照样本对比，确认婴儿是否患有α-地中海贫血。

经筛查分析，筛查出一例胎儿患有α-地中海贫血。