一种用于筛选转基因动物生物标志物的血清代谢组学方法

摘要

一种用于筛选转基因动物生物标志物的血清代谢组学方法，采用超高效液相色谱-质谱技术对正常动物与转基因动物血清进行分析获得代谢指纹图谱，并通过多变量统计分析方法分析比较正常动物与转基因动物代谢指纹图谱差异，筛选出转基因动物潜在生物标志物。本发明可更全面、综合地体现转基因动物代谢产物的变异状况，适用于转基因动物生物标志物的筛选。

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学和生命科学领域，具体涉及一种用于筛选转基因动物生物标志物的代谢组学方法，是一种转基因动物高通量检测的新方法。

背景技术

转基因动物是通过基因转移技术获得的整合有外源基因的动物个体。随着生物科学技术的不断完善，转基因动物正以它特有的、潜在的优势蓬勃发展，但我国乃至全球尚缺乏转基因动物的有关检测体系和标准。为此，开展转基因动物快速、精准、高通量检测方法研究势在必行。

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，其效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的重要组成部分，它借助高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术，对生物体液中分子质量较低的代谢物及整体组成进行动态跟踪和分析，借助多变量统计分析方法，来辩识和解析被检测对象的生理、病理状态及其与基因组成等的关系，考察生物体系受刺激或扰动后其代谢物组分或含量的变化，从而对转基因产品进行筛选和鉴定。

代谢物是基因表达的终产物，基因表达上极微小的变化也可导致代谢物的大幅度改变，利用现代分析方法对某生物或细胞在特定生理时期内所有相对分子质量较低的代谢物（如小分子蛋白质、活性多肽、活性氨基酸及衍生物、胺类物质、单糖、脂类介质和金属离子等）进行分析，通过考察生物体系受刺激或扰动后，其代谢物组分或含量的变化来筛选转基因动物生物标志物，从而可鉴定转基因产品，解决转基因动物高通量检测技术问题。

目前尚无筛选转基因动物生物标志物的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于建立一种采用超高效液相色谱质谱联用技术筛选转基因动物生物标志物的血清代谢组学方法。该方法能够筛选出转基因动物生物标志物，解决转基因动物高通量检测技术问题，为转基因动物的深入研究提供根据。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：采用超高效液相色谱-质谱技术对正常动物与转基因动物血清进行分析获得代谢指纹图谱，并通过多变量统计分析方法分析比较正常动物与转基因动物代谢指纹图谱差异，筛选出转基因动物潜在生物标志物。

具体实现步骤如下：

（1）血清样品采集：收集n只正常动物与m只转基因动物的血液，血液分别置于不含肝素的负压管中，负压管在冰上凝集15-20min，在温度为4-8℃、离心力为1600-1800g条件下离心时间15-20min后取上清液，即为所需的n+m个血清样品；其中n为大于5的正整数，m为大于5的正整数；

（2）血清样品预处理：于血清样品中分别加入其2-4倍体积的乙腈沉淀蛋白，在温度为2-4℃、离心力为12000-15000g条件下离心时间10-15min，后取上清液，即得到n+m个血清样本；

（3）样品质谱分析：对n+m个血清样本依次进行超高效液相色谱质谱联用分析，

液相色谱条件：采用Waters公司ACQUITY UPLC液相色谱系统，该系统含二元溶剂管理器、样品管理器和HT柱温箱；色谱柱为Waters ACQUITY^TM UPLC BEH C18柱，规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温：45℃；进样量：1-5μL；流动相：A为5mM甲酸氨+0.1%甲酸水溶液，B为5mM甲酸氨+0.1%甲酸（90%乙腈+10%水）溶液；梯度洗脱条件：0～1min为99%A相，1-23min线性变化至100%B相并保持3min，再切换99%A相并保持2min；流速为0.45ml/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测；

质谱条件：应用Waters Xevo G2QTof串联四级杆飞行时间质谱系统进行检测，其条件为电喷雾ESI离子源，扫描方式：正、负离子扫描模式，毛细管电压：2.5KV，锥孔电压：30V，离子源温度：120℃，脱液剂气温度：450℃，锥孔气流量：20L/h，脱液剂气流量：800L/h，碰撞能量:10～40V，离子能量：1V，每0.2s采集1次图谱，质量扫描范围：20～1200m/z，依次获得被分析血清样品的总离子流图；最终得到n+m个样本的总离子流图，其即为血清代谢指纹图谱；

（4）多元变量统计分析，筛选生物标志物：采用MetaboLynx^TMXS数据处理软件对n+m个样本的血清代谢指纹图谱据进行去噪音、质谱峰提取、反卷积处理、峰排列、对齐、合并、峰合并后开始列表去噪音、缝隙填补处理，得到各个峰的峰高或者峰面积以及质量数和保留时间等数据，根据正常动物组和转基因动物组谱图的差异性比较，应用SPSS统计软件进行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和正交偏最小方差判别分析（Orthogonal toPartial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA），并选择变量重要性因子对分类贡献最大的检测离子，这些检测离子对应的代谢物可被认为是转基因动物代谢产生影响的生物标志物；

（5）标志物结构鉴定：对筛选出的标示物,使用Elemental Composition分子式预测软件和MassFragment子离子确认软件可以确证，最终对筛选出的标志物进行结构鉴定。

本发明在对n+m个血清样本依次进行超高效液相色谱质谱联用分析过程中，每个样本重复进样5针，以监控实验过程中超高效液相色谱质谱联用仪有无较大系统偏差，考察其重现性，确保获得可靠的数据。

本发明获得的血清样品可冷冻储存于超低温-80℃的冰箱中，备用。

本发明具有的效果是：本发明所采用血清样品预处理过程简易，不需要衍生化，误差小，这些优点对标志物的筛查特别重要。采用基于超高效液相色谱-四离子杆与飞行时间质谱联用的代谢组学研究平台，可以快速高效的对复杂样品进行分离，分析周期一般小于25min，用四离子杆与飞行时间检测器可以得到高分辨率、高精度的分子质量，并结合MetaboLynx^TMXS软件的多元变量统计分析及元素分析功能可推断得到准确分子式。

附图说明

图1为本发明方法的实现流程图；

图2为本发明中血清代谢指纹图谱；

图3为本发明中转基因猪与正常猪样品的主成分分析（PCA）得分图；

图4为本发明中S-Plot图，右上角和左上角的点是置信度和贡献度双高的化合物；

图5为本发明中分子式预测与离子结构确认图。

具体实施方式

如图1所示，本发明方法的具体实现过程如下：

1、血清样品采集：收集了8头正常猪和6头转IGF-1基因猪血液，血液分别置于不含肝素的负压管中，冰上凝集15-20min，在温度为4-8℃、离心力为1600-1800g条件下离心时间15-20min后取上清液，上清液即为所需的14个血清样品；血清样品冷冻储存于-80℃冰箱，备用。

2、血清样品预处理：在上述14个血清样品中分别加和其2-4倍体积的乙腈沉淀蛋白，在温度为2-4℃、离心力为12000-15000g条件下离心时间10-15min，后取上清液，即得到14个血清样本。

3、样品质谱分析：对14个血清样本依次进行超高效液相色谱质谱联用分析，其实验条件如下：

液相色谱条件：采用Waters公司ACQUITY UPLC液相色谱系统，该系统含二元溶剂管理器、样品管理器和HT柱温箱；色谱柱为Waters ACQUITY^TM UPLC BEH C18柱，规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温：45℃；进样量：5μL；流动相：A为5mM甲酸氨+0.1%甲酸水溶液，B为5mM甲酸氨+0.1%甲酸（90%乙腈+10%水）溶液；梯度洗脱条件：0～1min为99%A相，1-23min线性变化至100%B相并保持3min，再切换99%A相并保持2min；流速为0.45ml/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测；

质谱条件：应用Waters Xevo G2QTof串联四级杆飞行时间质谱系统进行检测，其条件为电喷雾ESI离子源，扫描方式：正、负离子扫描模式，毛细管电压：2.5KV，锥孔电压：30V，离子源温度：120℃，脱液剂气温度：450℃，锥孔气流量：20L/h，脱液剂气流量：800L/h，碰撞能量:10～40V，离子能量：1V，每0.2s采集1次图谱，质量扫描范围：20～1200m/z，依次获得被分析血清样品的总离子流图；最终得到14个样本的总离子流图，其即为血清代谢指纹图谱。图2展示了1个血清样品1次进样分析后得到的血清代谢指纹图谱，横向坐标表示出峰时间，纵向坐标表示峰的高度。

对14个样本重复进样5针，以监控实验过程中超高效液相色谱质谱联用仪有无较大系统偏差，考察其重现性，确保获得可靠的数据。

4、数据预处理：采用MetaboLynx^TMXS数据处理软件对14个样本的血清代谢指纹图谱据进行去噪音、质谱峰提取、反卷积处理、峰排列、对齐、合并、峰合并后开始列表去噪音、缝隙填补处理，得到各个峰的峰高或者峰面积以及质量数和保留时间等数据。

5、多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物：对上述数据用SPSS统计软件进行主成分分析(Principal component analysis,PCA)分析，根据正常动物组和转基因动物组谱图的差异性比较，选择变量重要性因子对分类贡献最大的检测离子，这些检测离子对应的代谢物可被认为是转基因动物代谢产生影响的生物标志物。

图3则表示经过主成分分析（PCA）得分图，图中每个点代表一个样品，表明了转IGF-1基因猪(样品组)和正常猪组（参照组）间差异明显。按图3得分图结果，使用SPSS统计中正交偏最小方差判别分析（OPLS-DA）将转IGF-1基因猪(样品组)和正常猪组（参照组）分成两组进行分析，得到S-Plot图4，S-Plot图能够鲜明的突显出两组间差异最大的化合物，即右上角和左上角的点是置信度和贡献度双高的化合物，这些检测离子贡献度最大，图4右上角的点6.14_290.2689可被认为是转基因动物代谢产生影响的潜在标志物。

6、潜在生物标志物鉴定：从图4可见，右上角的点6.14_290.2689即为潜在标志物，使用Elemental Composition分子式预测软件和MassFragment子离子确认软件可以确证，如图5所示，最终鉴定潜在生物标志物保留时间：6.14min，质荷比m/z=290.2689Dalton的化合物为N,N,N tris(2-hydroxyethyl)-decan-1-aminium（N-十烷基三羟乙基铵），这为开展转基因猪研究工作提供了依据。

本发明说明书未详细阐述部分属于本领域公知技术。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。