精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明提供了一种精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒，包括如下组分：获能缓冲液；荧光结合物；荧光封固液。本发明还提供了用所述的试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测的方法。本发明相对于现有技术，在方法学的各环节进行了最优化设计，包括获能和上游法的最佳缓冲液配比、专业组织载片提供了稳定的反应场所、特异性结合的精子双标记技术配方，并消除了精液中脱落细胞等非精子物质对检测结果的影响，从而保证了方法学的可靠性，检测结果特异，重复性好；由于采用了优化检测方案，减少了操作步骤和操作时间，大大提高了检测效率；由于采用了优化检测方案，减化了试剂结构，较大程度地降低了检测成本；由于操作简单、采用即用型试剂且性能稳定。

说明书

技术领域

本发明属于体外检测试剂类，特别涉及精子酪氨酸磷酸化的检测 试剂盒及其检测方法。

背景技术

精子和卵母细胞结合启动了顶体反应，释放游离的溶解性顶体成 分并暴露出结合的可溶解性顶体成分，在经过超激活而增强的鞭毛运 动的驱动下使精子穿透卵透明带基质。为了检测这一过程，需要使用 来源于尸检、外科卵巢切除术或体外授精得到的人卵母细胞。这些试 验可使用盐水中储存的卵母细胞，但试验受到人卵母细胞来源稀少的 限制。

现有技术使用仓鼠卵来代替人卵母细胞作为筛查的方法，这种方 法存在以下缺点：①仓鼠饲养繁琐；②仓鼠取卵及后续操作复杂；③ 检测方案试剂不够完善；④检测成本昂贵。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种性能稳定、重复性好且便于 应用推广的精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒，利用此试剂盒，不需受 卵母细胞来源稀少的限制，即可整体判断精子-卵透明带结合能力， 本发明还提供了利用此试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化的检测方法，其 方法特异、结果易于判定、操作简单、易于推广应用。

本发明提供了一种精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒，包括如下组 分：

1）获能缓冲液，其pH值为7.0～9.0，是以蒸馏水溶解以下物 质配制而成，每1000ml获能缓冲液含有：

生化缓冲液：0.4～24.0g，

牛血清蛋白：0.35～20.0g，

乳酸钠：0.3～20.0g，

葡萄糖:0.1～10.0g，

余量为蒸馏水；

2）荧光结合物，其pH值为7.0～9.0，是含荧光素标记的酪氨 酸磷酸化抗体的量为1～10mg/L的磷酸盐缓冲液；

3）荧光封固液,其pH值为7.0～9.0，是以蒸馏水溶解以下物质 配制而成，每100ml含有：

Na₂HPO₄·12H₂O：0.06～6.00g，

KH₂PO₄：0.005～0.500g，

NaN₃：0.002～0.200g，

对苯二氨0.025～2.500g，

甘油：2～45ml，

余量为蒸馏水。

所述生化缓冲液为磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、三羟 甲基氨基甲烷或N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸中的任意一种。

所述荧光素为异硫氰酸荧光黄、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸 罗丹明、藻红蛋白或7-氨基-4-甲基香豆素中的任意一种。

所述精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒还包括固定液、组织载片、 可盛装组织载片的载玻片桶以及盖玻片。

所述固定液为体积含量为10～100%的有机溶液，所述有机溶液 为乙醇溶液、乙醚酒精液、甲醇溶液、乙酸溶液、丙酮溶液、carnoy 固定液或中性缓冲甲醛液中的任意一种。

本发明还提供了所述的试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测的方 法，包括如下步骤：

步骤一：在试管底部加入完全液化的新鲜的精液标本，在精液上 层加入体积为精液体积1～1.5倍的获能缓冲液；

步骤二：保持液面分层且试管呈45°角倾斜，放置于37℃、CO₂占总体积含量5%、空气占总体积含量95%的CO₂培养箱中孵育2小时， 以诱导精子获能，在其最上层形成含有活动精子的获能培养液；

步骤三：吸取最上层的获能培养液，并在其中加入体积为前述吸 取的获能培养液体积8～20倍的生理盐水悬浮精子，离心得到精子沉 淀团；

步骤四：在精子沉淀团中加入生理盐水重新悬浮精子并计数精子 密度；

步骤五：以生理盐水将精子沉淀团调配至密度为1×10⁶～30×10⁶ 活动精子/ml的精子悬液；

步骤六：取上述调配后的精子悬液5μl，均匀涂片于组织载片 上的涂片窗内，空气中自然干燥；

步骤七：将涂布有精子悬液的组织载片完全浸泡于盛有固定液的 载玻片桶内，盖紧盖后置室温固定20～40min，蒸馏水洗涤；

步骤八：去除组织载片表面及涂片窗内的水分，在涂片窗内加入 荧光结合物30～50μl进行染色，水平放置于湿盒内，2～8℃冰箱过 夜反应或者30～45℃反应0.5～1.5小时；

步骤九：取出组织载片，蒸馏水洗涤，去除组织载片表面及涂片 窗内的水分；

步骤十：在每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖玻片，使用 有蓝色荧光滤色片的荧光显微镜在激发光450-490nm、100倍物镜下 观察结果，其中，每个涂片窗至少观察400个精子，记录精子酪氨 酸磷酸化的数量，精子酪氨酸磷酸化判定标准：精子头部呈橙红色， 精子中尾部明显增粗且呈明亮的黄绿色荧光，表示发生了酪氨酸磷酸 化；然后记录头部呈橙红色的精子，即被观察精子的总数，来计算精 子酪氨酸磷酸化发生率：

精子酪氨酸磷酸化发生率（%）=精子酪氨酸磷酸化的数量/被观 察精子的总数×100%。

步骤五中的以精子悬液的密度被调配至10×10⁶活动精子/ml的 精子悬液。

所述步骤十中是在荧光显微镜的100W荧光汞灯下观察结果。

所述步骤七和步骤九所述的蒸馏水洗涤，其洗涤次数为3次，每 次浸泡2min。

本发明相对于现有技术，具有如下有益效果：本发明在方法学的 各环节进行了最优化设计，包括获能和上游法的最佳缓冲液配比、专 业组织载片提供了稳定的反应场所、特异性结合的精子双标记技术配 方，并消除了精液中脱落细胞等非精子物质对检测结果的影响，从而 保证了方法学的可靠性，检测结果特异，重复性好；由于采用了优化 检测方案，减少了操作步骤和操作时间，大大提高了检测效率；由于 采用了优化检测方案，减化了试剂结构，较大程度地降低了检测成本； 由于操作简单、采用即用型试剂且性能稳定。

附图说明

图1为510±40nm蓝色滤色块荧光激发下发生酪氨酸磷酸化和未 发生酪氨酸磷酸化的精子的显微照片。

图2为与图1同一视野中500-550nm绿色荧光滤色块荧光激发下 滤去中尾部黄绿色荧光只显示精子头部的橙红色荧光的精子的显微 照片。

图3为与图1同一视野中450-490nm蓝色荧光滤色块荧光激发下 中尾部呈明亮黄绿色且明显增粗的精子数量的显微照片。

具体实施方式

本发明的检验原理是荧光染色法，精子体外获能后经历浆膜流体 性增强、超活化运动和cAMP激活等一系列复杂的分子和生化反应， 精子中尾段发生酪氨酸磷酸化，发生酪氨酸磷酸化的精子可与异硫氰 酸荧光素（FITC）标记的抗酪氨酸磷酸化抗体结合，450～490nm蓝 光激发后精子中尾部发出绿色荧光。

本发明所用的仪器、设备和材料：

1.适用仪器：荧光显微镜

2.操作过程中用到的其他设备：

1）2－8℃冰箱                       5）光学显微镜

2）－20℃冷柜                       6）二氧化碳培养箱

3）37℃水浴箱                       7）超净工作台

4）低速离心机                       8）精子计数装置

3.其他需要的材料

1）精液采样装备                     5）5ml玻璃试管

2）液化剂                           6）15ml锥形离心管

3）1-10μl数字可调移液枪和一次吸头  7）Eppendorf管

4）一次性塑料吸管                   8）湿盒

实施例1

一、试剂盒制备

1.配制获能缓冲液

1）称取N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸（HEPES）4.766g、牛血 清蛋白3.5g、乳酸钠3.7g、葡萄糖1.0g溶于800毫升蒸馏水中，搅 拌溶解；

2）用0.5mol/L的NaOH溶液调pH至7.5，用蒸馏水定容至1000毫 升，即为获能缓冲液，置于4℃保存，每套试剂盒只需60ml。

2.配制固定液

称取100ml甲醇作为本试剂盒的固定液。

3.荧光结合物配制

使用1.0ml的浓度为0.5mg/ml的酪氨酸磷酸化抗体-FITC与99ml的 浓度为0.01mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲液配制成含酪氨酸磷酸化抗 体-FITC浓度为5mg/L的100ml磷酸盐缓冲液，即为荧光结合物，每 套试剂盒只需2ml。其中酪氨酸磷酸化抗体-FITC是购买于Southern  Biotechnology Associates,Inc.的Mouse Anti-Phosphotyrosine  FITC,(Clone PY20)(规格：0.5mg/ml,1.0ml)。

4.配制荧光封固液

1）称取Na₂HPO₄·12H₂O0.6g、KH₂PO₄0.05g、NaN₃0.02g、对苯二 氨0.25g置于烧杯，加蒸馏水至70ml；

2）再加入20ml甘油，搅拌混匀；

3）最后用0.5mol/L的NaOH溶液调pH至8.0，加蒸馏水至100ml， 搅拌均匀即为荧光封固液，4℃保存，每套试剂盒只需3ml。

5.组织载片和长形盖玻片

1）组织载片规格25.4×76.2mm，厚度1～1.2mm，进行烤漆处理，每 张载玻片上形成8个直径8mm的透明视窗，用于精子涂布。

2）长形盖玻片规格：24×60mm。

综上，将上述各种试剂、组织载片和长形盖玻片制备出试剂盒组 成如下：

二、用上述试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测

（一）精子样本准备

受试者禁欲3天，通过手淫法（或用特制的精液采集套以性交方 式）留取全部精液标本，取此新鲜精液标本，将新鲜的精液标本置 37℃或室温30-60min，待其完全液化后1小时内进行检测，若精液 液化迟缓或粘稠度过高，可加入适量的液化剂如精子洗涤液，以吸管 反复吹打精液促进其完全液化并降低粘稠度。

（二）试剂准备

临用前将获能缓冲液置于37℃、5%CO₂培养箱中至少平衡1小时。

固定液、组织载片、荧光结合物和荧光封固液置室温至少平衡 0.5小时。

（三）检测步骤

步骤一：在洁净的5ml玻璃小试管（或无毒圆底塑料小试管）底 部，加入上述完全液化的新鲜精液1ml，在精液上层加入1.2ml获能 缓冲液。（获能缓冲液开封后一次性分装放-20℃保存，用前取出解冻， 由于获能缓冲液容易被细菌污染，从已开盖后的试剂瓶中吸取获能缓 冲液时，应严格执行无菌操作，不得使用已产生絮状沉淀物的获能缓 冲液，未用完的获能缓冲液置2～8℃保存，尽量避免多次反复使用）

步骤二：勿打乱液面分层，保持试管45°角倾斜，置于37℃、5%CO₂（CO₂占总体积含量5%，空气占总体积含量95%，本申请其它处同此） 培养箱中孵育2小时，以诱导精子获能，在其最上层形成获能培养液。

步骤三：小心吸取最上层含有活动精子的获能培养液0.5ml至锥 底离心管中，加入8ml生理盐水，悬浮精子，300g离心10分钟在其 管底形成精子沉淀团。

步骤四：弃去精子沉淀团上方的液体，在底下精子沉淀团中加入 生理盐水至总体积0.2ml，重新混匀悬浮精子并计数精子密度。

步骤五：以生理盐水调配至密度为1×10⁶活动精子/ml的精子 悬液。

步骤六：取上述调配后的精子悬液5μl，均匀涂片于组织载片 上的涂片窗内，空气中自然干燥。

步骤七：将干燥后的组织载片完全浸泡于盛有固定液的载玻片桶 内，盖紧盖后置于室温固定30min；蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。 （注意：载玻片桶内的固定液可至少反复使用3～5次，使用过程中 应尽量避免固定液长时间暴露于空气中，以免试剂挥发而失效。）

步骤八：去除组织载片表面及涂片窗内的水分（可用洗耳球轻轻 吹干），在涂片窗内加入上述荧光结合物40μl进行染色，水平放置 于湿盒内，2～8℃冰箱过夜反应8～20小时。

步骤九：从冰箱取出组织载片，蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。 去除组织载片表面及涂片窗内的水分（可用洗耳球轻轻吹干或空气中 自然干燥）。

步骤十：在每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖玻片，在荧 光显微镜激发光450-490nm（蓝色荧光滤色块）、100×物镜条件且在 100W荧光汞灯下观察结果。每个涂片窗至少观察计数400个精子， 记录发生酪氨酸磷酸化的精子数量。

(四)结果判定与计算

精子酪氨酸磷酸化判定标准：精子头部呈橙红色（见图中圆形 状），精子中尾部明显增粗且呈明亮的黄绿色荧光（见图中长条状）， 表示发生了酪氨酸磷酸化。

具体来说，经510±40nm（蓝色滤色块）荧光激发后，精子头部 呈橙红色；精子中尾部明显增粗且呈明亮的黄绿色荧光，表示发生了 酪氨酸磷酸化（图1中“→”所示）；精子中尾部无荧光或呈淡绿色 荧光，则表示精子未发生酪氨酸磷酸化（图1中无“→”标识的精 子）。且每标本至少观察计数400个头部呈橙红色的精子，记录发生 酪氨酸磷酸化的精子数量。

精子头部染色荧光染料的激发光510±40（470-550）nm，发射 光620±50nm。某些发射光范围较窄（450-490nm）的蓝色荧光滤色 块，可能只能观察到发生酪氨酸磷酸化精子的中尾部黄绿色荧光，而 看不到精子头部的橙红色荧光（图3），这时需要用到绿色荧光滤色 块（500-550nm），即先在绿色荧光滤色块下计数被观察精子（头部呈 橙红色发荧光）的总数（图2），不移动视野，切换到蓝色荧光滤色 块后，再计数在同一视野内中尾部呈明亮黄绿色且明显增粗的精子数 量，即发生酪氨酸磷酸化的精子数量（图3中“→”所示）。

本实施例中观察了400个精子，其中中尾部呈明亮黄绿色且明 显增粗的精子数量为38,被观察精子（头部呈橙红色发荧光）的总 数为400个，精子酪氨酸磷酸化发生率=38/400*100%=9.5%。

(五)重复性验证

取上述已液化的新鲜精液分为20等份（分别标记为样品1，样 品2…，样品20），按照上述试剂盒检测方法对每份进行检测，精子 酪氨酸磷酸化发生率依次为：9.8%，9.6%，9.9%，10.1%，9.8%，9.6%， 9.9%，9.7%，9.8%，9.7%，9.8%，9.5%，9.9%，9.7%，9.6%，10.0%， 9.9%，9.9%，10.0%，9.5%。经计算以上精子酪氨酸磷酸化发生率的 平均值9.79%，变异数（CV）1.7%，变异数较小，变异程度也较小（波 动较小），因为此检测方法重复性和稳定性好。

实施例2

一、试剂盒制备

1.配制获能缓冲液

1）称取N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸（HEPES）0.4766g、牛血 清蛋白0.35g、乳酸钠0.37g、葡萄糖0.1g溶于800毫升蒸馏水中， 搅拌溶解；

2）用0.01mol/L NaOH调pH至7.0，用蒸馏水定容至1000毫升，即 为获能缓冲液，置于4℃保存，每套试剂盒只需60ml。

2.配制固定液

称取90ml乙醇，用蒸馏水定容至100ml，作为每套试剂盒的固定液。

3.荧光结合物配制

使用1.0ml的浓度为0.5mg/ml的酪氨酸磷酸化抗体-FITC与499ml 的浓度为0.01mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲液配制成含酪氨酸磷酸化 抗体-FITC浓度为1mg/L的500ml磷酸盐缓冲液，即为荧光结合物， 每套试剂盒只需2ml。其中酪氨酸磷酸化抗体-FITC是购买于 Southern Biotechnology Associates,Inc.的Mouse  Anti-Phosphotyrosine FITC,(Clone PY20)(规格：0.5mg/ml， 1.0ml)。

4.配制荧光封固液

1）称取Na₂HPO₄·12H₂O0.06g、KH₂PO₄0.005g、NaN₃0.002g、对苯 二氨0.025g置于烧杯，加蒸馏水至70ml；

2）加入2ml甘油，搅拌混匀；

3）最后用0.01mol/L的NaOH溶液调pH至7.5，加蒸馏水至100ml， 搅拌均匀即为荧光封固液，4℃保存，每套试剂盒只需3ml。

5.组织载片和长形盖玻片

1）组织载片规格25.4×76.2mm，厚度1～1.2mm，进行烤漆处理，每 张载玻片上形成8个直径5mm的透明视窗，用于精子涂布。

2）长形盖玻片规格：24×60mm。

综上，将上述各种试剂、组织载片和长形盖玻片制备出试剂盒组 成如下：

二、用上述试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测

（一）精子样本准备

受试者禁欲7天，通过手淫法（或用特制的精液采集套以性交方 式）留取全部精液标本，取此新鲜精液标本，待其完全液化后1小时 内进行检测，若精液液化迟缓或粘稠度过高，可加入适量的液化剂， 其中液化剂是深圳市博锐德生物科技有限公司的精液液化剂，按10 μl液化剂/ml精液的比例加入，促进精液完全液化并降低粘稠度。

（二）试剂准备

临用前将获能缓冲液置于37℃、5%CO₂培养箱中至少平衡1小时。

固定液、组织载片、荧光结合物和荧光封固液置室温至少平衡 0.5小时。

（三）检测步骤

步骤一：在洁净的5ml玻璃小试管（或无毒圆底塑料小试管）底 部，加入上述完全液化的新鲜精液1ml，在精液上层加入1.2ml获能 缓冲液。（获能缓冲液开封后一次性分装放-20℃保存，用前取出解冻， 由于获能缓冲液容易被细菌污染，从已开盖后的试剂瓶中吸取获能缓 冲液时，应严格执行无菌操作，不得使用已产生絮状沉淀物的获能缓 冲液，未用完的获能缓冲液置2～8℃保存，尽量避免多次反复使用）

步骤二：勿打乱液面分层，保持试管45°角倾斜，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育1小时，以诱导精子获能，在其最上层形成获能培养液。

步骤三：小心吸取最上层含有活动精子的获能培养液0.8ml至锥 底离心管中，加入10ml生理盐水，悬浮精子，200g离心20分钟在 其管底形成精子沉淀团。

步骤四：弃去精子沉淀团上方的液体，在底下精子沉淀团中加入 生理盐水至总体积0.3ml，重新混匀悬浮精子并计数精子密度。

步骤五：以生理盐水调配至密度为10×10⁶活动精子/ml的精子 悬液。

步骤六：取上述调配后的精子悬液5μl，均匀涂片于组织载片 上的涂片窗内，空气中自然干燥。

步骤七：将干燥后的组织载片完全浸泡于盛有固定液的载玻片桶 内，盖紧盖后置于室温固定3小时；蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。 （注意：载玻片桶内的固定液可至少反复使用3～5次，使用过程中 应尽量避免固定液长时间暴露于空气中，以免试剂挥发而失效。）

步骤八：去除组织载片表面及涂片窗内的水分（可用洗耳球轻轻 吹干），在涂片窗内加入上述荧光结合物40μl进行染色，水平放置 于湿盒内，2～8℃冰箱过夜反应8～20小时。

步骤九：从冰箱取出组织载片，蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。 去除组织载片表面及涂片窗内的水分（可用洗耳球轻轻吹干或空气中 自然干燥）。

步骤十：在每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖玻片，在荧 光显微镜激发光450-490nm（蓝色荧光滤色块）、100×物镜条件且在 100W荧光汞灯下观察结果。每个涂片窗至少观察计数400个精子， 记录发生酪氨酸磷酸化的精子数量。

(四)结果判定与计算

结果判定与计算见实施例1。

本实施例中观察了400个精子，其中中尾部呈明亮黄绿色且明 显增粗的精子数量为71,被观察精子（头部呈橙红色发荧光）的总 数为400，精子酪氨酸磷酸化发生率=71/400*100%=17.8%.

(五)重复性验证

取上述已液化的新鲜精液分为20等份（分别标记为样品1，样 品2…，样品20），按照上述试剂盒检测方法对每份进行检测，精子 酪氨酸磷酸化发生率依次为：17.5%，16.9%，17.9%，17.9%，18.5%， 17.3%，17.7%，17.8%，18.7%，18.0%，18.1%，18.7%，17.6%，17.5%， 18.2%，17.8%，17.7%，17.3%，18.3%，18.0%。经计算以上精子酪氨 酸磷酸化发生率的平均值17.9%，变异数（CV）2.6%，变异数较小， 变异程度也较小（波动较小），因为此检测方法重复性和稳定性好。

实施例3

一、试剂盒制备

1.配制获能缓冲液

1）称取N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸（HEPES）23.83g、牛血 清蛋白20.0g、乳酸钠20.0g、葡萄糖10.0g溶于800毫升蒸馏水中， 搅拌溶解；

2）用0.5mol/L NaOH调pH至9.0，用蒸馏水定容至1000毫升，即 为获能缓冲液，置于4℃保存，每套试剂盒只需60ml。

2.配制固定液

称取100ml乙酸，作为每套试剂盒的固定液。

3.荧光结合物配制

使用1.0ml的浓度为0.5mg/ml酪氨酸磷酸化抗体-FITC与49ml的浓 度为0.01mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲液配制成含酪氨酸磷酸化抗体 -FITC的浓度10mg/L的50ml磷酸盐缓冲液，即为荧光结合物，每套 试剂盒只需2ml。其中酪氨酸磷酸化抗体-FITC是购买于Southern  Biotechnology Associates,Inc.的Mouse Anti-Phosphotyrosine  FITC,(Clone PY20)(0.5mg/ml,1.0ml)。

4.配制荧光封固液

1）称取Na₂HPO₄·12H₂O6g、KH₂PO₄0.5g、NaN₃0.2g、对苯二氨2.5g 置于烧杯，加蒸馏水至50ml；

2）加入45ml甘油，搅拌混匀；

3）最后用0.5mol/L的NaOH溶液调pH至9.0，加蒸馏水至100ml， 搅拌均匀即为荧光封固液，4℃保存，每套试剂盒只需3ml。

5.组织载片和长形盖玻片

1）组织载片规格25.4×76.2mm，厚度1～1.2mm，进行烤漆处理，每 张载玻片上形成8个直径10mm的透明视窗，用于精子涂布。

2）长形盖玻片规格：24×60mm。

综上，将上述各种试剂、组织载片和长形盖玻片制备出试剂盒组 成如下：

二、用上述试剂盒进行精子酪氨酸磷酸化检测

（一）精子样本准备

受试者禁欲7天，通过手淫法（或用特制的精液采集套以性交方 式）留取全部精液标本，取此新鲜精液标本，待其完全液化后1小时 内进行检测，若精液液化迟缓或粘稠度过高，可加入适量的液化剂， 其中液化剂是深圳市博锐德生物科技有限公司的精液液化剂，按10 μl液化剂/ml精液的比例加入，促进精液完全液化并降低粘稠度。

（二）试剂准备

临用前将获能缓冲液置于37℃、5%CO₂培养箱中至少平衡1小时。

固定液、组织载片、荧光结合物和荧光封固液置室温至少平衡 0.5h。

（三）检测步骤

步骤一：在洁净的5ml玻璃小试管（或无毒圆底塑料小试管）底 部，加入上述完全液化的新鲜精液1ml，在精液上层加入1.2ml获能 缓冲液。（获能缓冲液开封后一次性分装放-20℃保存，用前取出解冻， 由于获能缓冲液容易被细菌污染，从已开盖后的试剂瓶中吸取获能缓 冲液时，应严格执行无菌操作，不得使用已产生絮状沉淀物的获能缓 冲液，未用完的获能缓冲液置2～8℃保存，尽量避免多次反复使用）

步骤二：勿打乱液面分层，保持试管45°角倾斜，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育3小时，以诱导精子获能，在其最上层形成获能培养液。

步骤三：小心吸取最上层含有活动精子的获能培养液1.0ml至锥 底离心管中，加入10ml生理盐水，悬浮精子，400g离心5分钟在其 管底形成精子沉淀团。

步骤四：弃去精子沉淀团上方的液体，在底下精子沉淀团中加入 生理盐水至总体积0.2ml，重新混匀悬浮精子并计数精子密度。

步骤五：以生理盐水调配至密度为30×10⁶活动精子/ml的精子 悬液。

步骤六：取上述调配后的精子悬液5μl，均匀涂片于组织载片 上的涂片窗内，空气中自然干燥。

步骤七：将干燥后的组织载片完全浸泡于盛有固定液的载玻片桶 内，盖紧盖后置于室温固定20min；蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。 （注意：载玻片桶内的固定液可至少反复使用3～5次，使用过程中 应尽量避免固定液长时间暴露于空气中，以免试剂挥发而失效。）

步骤八：去除组织载片表面及涂片窗内的水分（可用洗耳球轻轻 吹干），在涂片窗内加入上述荧光结合物40μl进行染色，水平放置 于湿盒内，37℃反应1小时。

步骤九：取出组织载片，蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。去 除组织载片表面及涂片窗内的水分（可用洗耳球轻轻吹干或空气中自 然干燥）。

步骤十：在每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖玻片，在荧 光显微镜激发光450-490nm（蓝色荧光滤色块）、100×物镜条件且在 100W荧光汞灯下观察结果。每个涂片窗至少观察计数400个精子， 记录发生酪氨酸磷酸化的精子数量。

(四)结果判定与计算

结果判定与计算见实施例1。

本实施例中观察了400个精子,其中中尾部呈明亮黄绿色且明显 增粗的精子数量为137个,被观察精子（头部呈橙红色发荧光）的总 数为400个，精子酪氨酸磷酸化发生率=137/400*100%=34.3%。

(五)重复性验证

取上述已液化的新鲜精液分为20等份（分别标记为样品1，样品2…， 样品20），按照上述试剂盒检测方法对每份进行检测，精子酪氨酸磷 酸化发生率依次为：34.4%，33.9%，34.6%，33.9%，34.5%，34.3%， 33.7%，33.8%，34.7%，33.3%，34.1%，34.7%，33.6%，34.5%，34.5%， 33.8%，33.6%，33.3%，34.2%，34.1%。经计算以上精子酪氨酸磷酸 化发生率的平均值34.1%，变异数（CV）1.3%，变异数较小，变异 程度也较小（波动较小），因为此检测方法重复性和稳定性好。