一种葡萄霜霉病菌的快速分子检测方法与应用

摘要

本发明属于作物病害诊断与防治技术领域，具体涉及一种葡萄霜霉菌的分子检测方法及应用。本发明根据已公开的多种霜霉目真菌和其他常见的植物病原真菌的ITS序列信息，通过生物信息分析，自行设计了一组LAMP引物，结合葡萄霜霉病菌的基因组DNA快速提取技术，采用一步LAMP反应，仅需55min即可从不同葡萄种植区不同品种的葡萄霜霉病样中快速检测出33fg/μL水平葡萄霜霉病菌基因组DNA的存在。本发明特异性强、灵敏度高、检测准确率高、适用范围广，可作为葡萄霜霉病菌的快速检测技术在各地推广应用。

说明书

(一)技术领域

本发明“一种葡萄霜霉病菌的快速分子检测方法与应用”，本发明属于作物病害诊断与 防治技术领域，具体涉及一种葡萄霜霉菌的分子检测方法及应用。

(二)背景技术

葡萄(Vitis vinifera)是世界上栽培面积最大、产量最多的果树之一，已经具有5000～7000 年的栽培历史，世界葡萄产业的贸易额超过581亿美元(2010年度葡萄产业技术发展报告)， 远远超过其他果树。葡萄作为一种世界性的水果，具有多种价值，随着人民生活水平的提高， 无公害葡萄及葡萄产品的需求量逐渐增加，葡萄产业向着优质、绿色、健康的方向发展是大 势所趋。葡萄霜霉病一直是制约葡萄和葡萄酒产业的一大瓶颈，一般年份可减产10～20％，严 重的可达70～80％，并且严重影响次年的产量和品质，目前该病的最主要防治手段仍是喷施化 学农药，但随着施药量的增加，出现了如果实品质下降、环境污染、病菌抗性产生等一系列 问题。及时、准确预测霜霉病的发生时期、流行强度，确定药剂使用时期、次数和剂量能够 提高药效、减少施药次数、降低生产成本、减轻环境污染等因农药使用所带来的负面影响， 为霜霉病的综合防治提供依据。因此，开展葡萄霜霉病预测预报研究对于科学防治葡萄霜霉 病具有重要的意义。目前，还没有葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)快速检测技术的报道， 因此，建立高效、快速的早期检测技术将为葡萄霜霉病的科学防控提供新的思路，推动葡萄 产业的健康发展。

传统的霜霉早期检测方法往往根据病组织的症状、病原菌的特征以及研究人员的经验进 行，但是，霜霉菌引起的早期褪绿与其他病原引起的症状相似，很难准确判断。另一方面， 霜霉菌是专性寄生菌，不能进行人工培养，因此不能单靠传统的分离培养、血清鉴定和ELISA 等方法进行检测难度较大，霜霉目真菌的检测方法为葡萄霜霉病菌的检测提供了很好的借鉴。

霜霉目真菌的检测方法主要有菌体化学染色法、荧光检测法、酶联免疫吸附法、特异性 聚合酶链式反应等手段。近年来，酸性品红、苯胺蓝、棉兰藏红等染色剂都被用于对玉米组 织中大孢指疫霉(Sclerospora macropsora)菌丝体的检测。周肇慧等提出了棉兰一藏花红染 色法能有效地检出向日葵种子中的霜霉菌，崔铁军等在对向日葵种子带菌规律的研究过程中， 也发现了霜霉菌的自体荧光现象，并据此建立了向日葵霜霉病种子带苗的荧光检验法，结果 显示：在荧光显微镜的视野内，寄主组织不发生荧光或只具微弱的黄色荧光，霜霉菌菌丝和 吸器发出亮蓝色荧光，形态和结构清晰可见。向日葵种子中潜藏的其它种带病菌(主要为半知 菌)菌丝不发出荧光或荧光极弱，很容易与霜霉菌区分。但当病菌在寄主组织中仅以菌丝体的 形态存在时，染色法只能准确地判断病菌是否为卵菌，仍缺乏分类上种的鉴定能力。

合适的分子靶标是开发病原菌分子检测技术的基础，目前大多数植物病原菌的分子检测 靶标都是基于ITS序列。Valsesia等基于葡萄叶片霜霉菌(P.viticola)的ITS序列的定量实时 荧光PCR的高通量检测方法，检测灵敏度可达0.1pg。刘艳等建立了基于大豆霜霉菌 (Peronospora man-schurica)的rDNA ITS序列的早期检测方法，灵敏度可以达到0.1pg。同 时为了快速准确的检测土壤中辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)，王淑芳等建立了基于辣椒疫 霉病菌ITS序列的实时荧光定量检测体系，利用构建的标准曲线和优化的实时荧光定量体系 对人工接种含梯度浓度的辣椒疫霉菌的土壤样品进行实时荧光定量PCR检测，效果良好。孟 军等就三种在农业生产上危害比较严重的疫霉菌P.nicotianae、P.infestans、P.sojae和首次在 我国报道的疫霉种P.tentaculata的分子检测靶标进行了研究，采用普通PCR、套式PCR等技 术对以上四种疫霉菌的游动孢子、卵孢子、发病植株、病田的土壤样品进行分子检测，结果 显示：普通PCR检测灵敏度均为100pg，套式PCR对游动孢子和厚垣孢子的检测精度可达 1～3个游动孢子和1个卵孢子，该体系可用于田间土壤和发病植物组织中的P.nicotianae、 P.infestans和P.tentaculata进行快速灵敏的检测。但是，由于ITS存在着无法区分一些病原菌 与其亲缘种的缺点，因此开发出更精确的病原菌检测方法势在必行。

窦坦德等利用间接ELISA和夹心ELISA技术建立了大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)的 快速检测体系，并利用其检测了20株不同来源的大豆疫霉菌，结果表明间接法(I-ELISA)和 夹心法(Das-ELISA)均能较好地检测纯培养的大豆疫霉菌，但在检测病组织时，夹心ELISA 的特异性较强。酶联免疫吸附法虽操作简单，费用较低，但ELAISA方法检测靶标比较单一， 由于农业生产和口岸检疫植物病原物的复杂性，而该方法存在着无法同时检测多种病原物的 缺点，因此催生出了多靶标分子检测技术。

近年来随着分子生物学的快速发展，多靶标分子检测技术取得了一系列的重要进展。 Sikora等利用锁式探针与微阵列技术相结合，建立了基于ITS序列的、能够同时检测出多种 Phytophthora spp.的通用微阵列检测方法，孟军等利用同样的方法建立了10种植物病原菌的 高通量分子检测技术，不同探针的灵敏度分别为20pg和10pg。

但是以上这些方法都存在检测耗时长、对设备要求高、操作程序复杂、很难适应多种检 测环境等缺点，大大限制了其在基层检测的应用和推广，并且以上方法由于DNA提取方法 的限制，并不能真正满足“快速”检测的需求，因此有必要建立一种精确、高效、快速、灵 敏、经济的检测方法。

(三)发明内容

技术问题

本发明的目的是研制一种能够快速、高效、准确检测葡萄霜霉病菌的分子检测方法，以 期达到快速、准确、低成本检测出葡萄霜霉病菌(P.viticola)目的，为快速监测组织中霜霉 菌潜伏侵染并及早采取防治措施提供积极的指导作用。本发明采用环介导等温扩增法 (Loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)，利用针对靶基因的6个区域设计4条特异 引物，外加一条环引物，利用Bst DNA聚合酶的链置换活性，在同一反应体系中恒温高效扩 增，无需昂贵、精密的试验仪器设备，大大简化了检测的步骤，结合DNA快速提取技术，55 min即可检测出33fg/μL水平的P.viticola基因组DNA，灵敏度是常规PCR检测法的100倍。扩增 产物可以通过目测法、琼脂糖凝胶电泳法、荧光染料法等多种方法实现判读，另外，该方法 不仅检测准确率高，适用范围也很广，不仅适用于酿酒、鲜食葡萄品种组织内霜霉菌的检测， 还适用于有核、无核品种葡萄组织内霜霉菌的检测；不仅适用于不同地区的相同葡萄品种霜 霉菌的检测，相同地区的不同葡萄品种霜霉菌的检测，还适用于不同地区的不同葡萄品种霜 霉菌的检测。总之，该方法特异性强、灵敏度高、产物检测方便、成本低廉、操作步骤简单， 可以试剂盒的形式在我国大规模推广。

本发明是这样实现的：利用已经公开发表的多个霜霉目真菌ITS的序列信息，通过序列 比对，找到葡萄霜霉病菌ITS相对保守性差的区段作为模板，设计一组LAMP引物。经过一 次LAMP扩增后，产物经目测法、琼脂糖凝胶电泳法、荧光染料法等多种方法，根据有无白 色沉淀、有无梯形条带、产物颜色有无变化，直接判断样品中有无葡萄霜霉病菌，完成检测。

技术方案

用于检测葡萄霜霉病菌的LAMP方法，包括：

1)用于检测的DNA模板的快速制备

用枪头在样品叶片上挑取少量霉层(葡萄霜霉病菌孢子囊)放入PCR管，加入50μL Buffer  A溶液(100mM NaOH，2％20，BufferA用10M NaOH和20％20现配现用)， 95℃温育10min。再加入50μL Buffer B溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振荡混匀， 12000rpm离心15s，取1μL上清液做LAMP扩增的模板，直接加到LAMP反应体系中。 DNA提取过程耗时15min。

2)用于检测葡萄霜霉病菌的特异性LAMP引物

表1葡萄霜霉病菌特异性LAMP引物

3)LAMP扩增的反应体系及程序

总反应体系25μL，包含2.5μL10×ThermoPol Reaction buffer，8mM MgCl₂，1.4mM dNTP，1M Betain，1.4μM内引物(FIP和BIP)，0.2μM外引物(F3和B3)，1.4μM LB环引物， 8U Bst DNA聚合酶大片段，1μL模板DNA，ddH₂O3.4μL，反应体系置于65℃恒温反应 30min。

4)LAMP产物检测

取出PCR管，对着光用肉眼观察浊度或400nm光下使用浊度仪检测浊度就能判定结果， 或者取5μL LAMP产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳130V分离30min，经溴化乙锭染色后于紫 外灯下根据梯形条带的有无判定结果，或者向PCR管内加入2μL1000×SYBRGreenI后于紫 外灯下根据绿色荧光的有无判定结果。

有益效果

本发明根据已经公开发表的多种霜霉目真菌和常见的多种植物病原真菌的ITS序列信息， 通过序列比对，找到葡萄霜霉病菌ITS相对保守性差的区段作为模板，设计了一组LAMP引 物，仅需55min即可高效、可靠的检测出葡萄霜霉病菌，与常规PCR方法检测结果完全吻 合。与国内外现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：

1)特异性强。本方法针对葡萄霜霉病菌ITS序列的6个区域设计了4条特异引物，并且这6 个区段的顺序也有规定，T_m值和GC含量均有一定的要求，因此可以根据是否扩增来判断目 标基因的存在与否，特异性强。本发明以37种参照菌株DNA(表2)为模板，以葡萄霜霉 病菌DNA为阳性对照，水为阴性对照，进行LAMP特异性检测，结果显示，该方法特异性 强(见图2)。

2)操作简便快捷。本发明DNA的快速提取和检测过程均没有复杂的操作步骤，仅需按照体 系加入样品，恒温反应后检测产物即可，整个过程无需复杂的操作。

3)检测速度快。该方法无需PCR反应中的退火、复性等温度的变化，30min内即可完成检 测，结合DNA快速提取技术，55min即可完成从DNA提取到检测结果判读的全过程。 扩增产物可结合即可完成，大大提高了检测的效率。

4)灵敏度高。该方法可检测出33fg/μL水平的P.viticola基因组DNA，灵敏度是常规PCR 检测法的100倍(见图3)。

5)产物检测方便。LAMP扩增产物可以经目测法、琼脂糖凝胶电泳法、荧光染料法等多种

方法，根据有无白色沉淀、有无梯形条带、产物颜色有无变化实现结果判读。

6)应用范围广。该方法不仅适用于酿酒、鲜食葡萄品种组织内霜霉菌的检测，还适用于有 核、无核品种葡萄组织内霜霉菌的检测；不仅适用于不同地区的相同葡萄品种霜霉菌的检 测，相同地区的不同葡萄品种霜霉菌的检测，还适用于不同地区的不同葡萄品种霜霉菌的 检测。

7)成本低。本方法无需昂贵、精密的试验仪器设备，且所用DNA快速提取和PCR过程均 为常规试剂，价格低廉。

因此本方法实用性强，可满足葡萄霜霉病菌的快速检测，为葡萄霜霉病的综合防控提供了 新的思路。

(四)附图说明

图1：本发明技术流程图

图2：LAMP引物特异性验证结果

M：100bp DNA Ladder；0：P.viticola；1-37：菌株编号与表1一致；ck1：健康葡萄叶片DNA；ck2： 阴性对照

图3：LAMP反应/PCR反应检测葡萄霜霉病菌引物灵敏度试验结果

M：100bp DNA Ladder；1：3.3ng/μL；2：330pg/μL；3：33pg/μL；4：3.3pg/μL；5：330fg/μL；6：33 fg/μL；7：3.3fg/μL；8：0.33fg/μL

图4：不同地区的相同葡萄品种的霜霉菌的检测

M：100bp DNA Ladder；1-36：菌株编号与表2一致；ck1：健康葡萄叶片DNA；ck2：阴性对照

图5：相同地区的不同葡萄品种的霜霉菌的检测

M：100bp DNA Ladder；1-17：菌株编号与表3一致；ck1：健康葡萄叶片DNA；ck2：阴性对照

图6：不同地区的不同葡萄品种的霜霉菌的检测

M：100bp DNA Ladder；1-27：菌株编号与表4一致；ck1：健康葡萄叶片DNA；ck2：阴性对照

(五)具体实施方式

实施实例1：中国不同地区同一葡萄品种霜霉菌的检测

1)菌株来源

菌株采自中国15个省2个直辖市3个自治区的葡萄种植区(见表3)，选择目前中国范 围内栽培的主要葡萄品种——红地球为供试靶标(没有栽培红地球的地区以中国最古老的品 种——巨峰代替)。

表3本发明采用的中国不同地区的相同葡萄品种的霜霉菌菌株

2)菌株DNA的快速提取

用已灭菌的牙签或枪头在样品表面上挑取少量霉层，放入PCR管，加入50μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％20，Buffer A用10M NaOH和20％20现配)， 95℃温育10min。再加入50μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振荡混匀， 12000rpm离心15s，取1μL上清液做LAMP扩增的模板，直接加到LAMP反应体系中。 DNA提取过程耗时15min。

3)特异性LAMP引物的合成

FIP：5’-GAAGCCAACCATACCGCAAATCGGCGACCAATTTATTTGCTGTTG-3’

BIP：5’-GAATCGGTGAACCGTAGCTATATGTAAGCTGCCACTCTACTTCG-3’

F3：5’-GTTTGTCTATTGTGGCCAGTC-3’

B3：5’-CCAAATGGATCGACCCTCG-3’

LB：5’-GACTATGCTTTCAATCAGTTT-3’

引物均由上海生工生物有限公司合成。

4)LAMP扩增的反应体系及程序

总反应体系25μL，包含2.5μL10×ThermoPol Reaction buffer，8mM MgCl₂，1.4mM dNTP， 1M Betain，1.4μM内引物(FIP和BIP)，0.2μM外引物(F3和B3)，1.4μM LB环引物，8U Bst DNA聚合酶大片段，1μL模板DNA，3.4μL ddH₂O，65℃恒温反应30min。

5)LAMP产物的鉴定

取出PCR管，向其中加入2μL1000×SYBRGreen I染料后于紫外灯下照射，根据绿色 荧光的有无判定结果。

实施结果

利用本发明的LAMP引物组合以中国各地区的同一葡萄品种霜霉菌DNA为模板，LAMP 扩增。结果如图4，紫外灯下编号为1～36的PCR管均显示出绿色荧光，说明样品内均含有 不同量的葡萄霜霉病菌DNA，健康葡萄叶片DNA和ddH₂O为模板的阴性对照均不显示绿色 荧光，因此检出率100％。

实施实例2：中国相同地区不同葡萄品种霜霉菌的检测

菌株采自于中国北京通州葡萄大观园，具体品种信息如表4。LAMP扩增反应及程序、 LAMP产物鉴定同实施实例1。

表4本发明采用的中国相同地区的不同葡萄品种的霜霉菌菌株

实施结果

利用本发明的LAMP引物组合以中国相同地区的不同葡萄品种霜霉菌DNA为模板， LAMP扩增。结果如图5，紫外灯下编号为1～17的PCR管均显示出绿色荧光，说明样品内 均含有不同量的葡萄霜霉病菌DNA，两个对照的模板分别为健康葡萄叶片DNA和ddH₂O为 模板的阴性对照均未显示绿色荧光，因此检出率100％。

实施实例3：中国不同地区不同葡萄品种霜霉菌的检测

菌株采自于中国7个省、2个直辖市、2个自治区的葡萄种植区，共有20个品种，具体 信息见表5。LAMP扩增反应及程序、LAMP产物鉴定同实施实例1。

表5本发明采用的中国不同地区的不同葡萄品种的霜霉菌菌株

实施结果

利用本发明的LAMP引物组合以中国不同地区的不同葡萄品种霜霉菌DNA为模板， LAMP扩增。结果如图6，紫外灯下编号为1～27的PCR管均显示出绿色荧光，说明样品内 均含有不同量的葡萄霜霉病菌DNA，健康葡萄叶片DNA和ddH₂O为模板的阴性对照均未显 示绿色荧光，因此检出率100％。