尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法

摘要

尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法，使用衍生化后HPLC-MS-MS法测定尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL，包括用测定旋光并比对的方法确定(S)-NNAL和(R)-NNAL的构型并作为参照，或用Mosher方法确定(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的构型并作为参照；配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的混合标准溶液，再进行Mosher衍生化，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析;最后进行尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL检测。该方法具有检测限低、稳定性好、前处理简单、快速准确的优点。

说明书

技术领域

本发明属于烟草特有亚硝胺在尿液中的生物标志物理化检验技术领域， 具体涉及尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测 方法。

背景技术

烟草特有亚硝胺（TSNAs）是烟草内源性生物碱与硝酸盐和亚硝酸盐通 过亚硝化作用而产生，只存在于烟草、烟草制品和卷烟烟气中。近年来，随 着吸烟与健康问题受到人们的广泛关注，国内外对于烟气中各种有害化学成 分的研究也日益深入。由于烟草特有亚硝胺中的4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡 啶基）-1-丁酮(NNK）对动物可能有致癌性，因此，现在烟草行业以及卫生 机构等迫切需要建立一种准确评价不同人群对NNK暴露程度的方法，而生物 标志物法是一种公认且有效的监测NNK暴露人群暴露程度的方法。

在NNK分子中没有手性碳原子，因此NNK分子没有对映异构体，但NNK 分子中有一个羰基，该羰基随着NNK进入人体后被羰基还原酶还原为羟基， 生成一对NNAL对映异构体，分别为(S)-NNAL和(R)-NNAL，部分NNAL可以进 一步被糖苷化物为NNAL糖苷化合物（包括NNAL-O-Glucuronide和 NNAL-N-Glucuronide），这些代谢产物主要通过尿液和其它体液排出体外， 研究还发现在吸烟者的尿液中不含游离形式的NNK。

由于人体本身就是一个动态的不对称化学反应有机系统，所以卷烟烟气 中的NNK被加氢还原酶还原生成(S)-NNAL和(R)-NNAL的比例以及进一步代 谢产物比例必然反映出人体相关器官的解毒能力以及受到NNK的损害程度， 因此尿液中(S)-NNAL、(R)-NNAL、(S)-NNAL-糖苷化合物和(R)-NNAL-糖苷 化合物的含量以及比例一直受到关注。2002年，Hecht等的研究发现揭示， 人体尿样中游离形式的(R)-NNAL的含量略约是(S)-NNAL含量的1.1倍，但 人尿样中(R)-NNAL糖苷化合物的含量是(S)-NNAL糖苷化合物含量的的两倍 左右，这说明(S)-NNAL和(R)-NNAL的进一步代谢途径差别很大，同时也说 明人体对(S)-NNAL有一种立体选择性的保留能力，特别是老鼠在摄入NNK 后相当长一段时间内其肺部(S)-NNAL的比例也远高于(R)-NNAL。其他学者 的研究结果也显示吸烟的肺癌患者尿样中(S)-NNAL与(R)-NNAL的比值明显 大于普通吸烟者。结合流行病学调查分析结果，人们推测人肺脏内可能有 (S)-NNAL的受体，此受体可特异性结合(S)-NNAL，这可能就是吸烟吸收NNK 导致肺癌的原因之一。

由于中式卷烟每支卷烟烟气中释放的NNK只有几个纳克，而NNK进入人 体后又被代谢为多种物质，加之尿样基质复杂，所以尿样中的(S)-NNAL和 (R)-NNAL的检测非常困难，国内外许多相关行业都无法开展尿样中 (S)-NNAL和(R)-NNAL的检测工作。在这种背景下，许多相关行业迫切需要 建立一种能够快速准确测定人体尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的含量和比例 的方法，以便为肺癌的早期检测等提供进一步参考信息。

发明内容：

本发明的目的在于针对现有方法很难开展尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL 的检测工作的不足，提供一种尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱- 质谱-质谱联用检测方法，为评估个体对烟气中NNK的暴露程度提供一种科 学的判定方法，该方法具有检测限低、稳定性好、快速准确等优点。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法， 包括以下步骤：

①用测定旋光并比对的方法确定(S)-NNAL和(R)-NNAL的构型并作为参 照，或用Mosher方法确定(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸 酯和(R)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的构型并 作为参照；

②配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的混合标准溶液，再进 行Mosher衍生化，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析; 用确定构型后的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和 (R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯通过保留时间确定相应 的色谱峰保留时间，采用内标法分别建立(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α- 三氟甲基苯乙酸酯对其相应内标的标准溶液工作曲线和(R)-NNAL-(S)-(+)- α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯对其相应内标的标准溶液工作曲线；

③将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取10mL于50mL试管中， 加入rac-NNAL-甲基-d3溶液，再用MIP-NNAL固相萃取小柱净化，淋洗后洗 脱，干燥过滤后进行Mosher衍生化，浓缩至干，再用7/3的乙腈/水溶解后 上HPLC-MS-MS检测。

所述的尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检 测方法，其中在分析检测尿样中尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL时进行Mosher 衍生化,并使用rac-NNAL-甲基-d3作为内标。

所述的尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检 测方法，使用微波辅助萃取仪在37℃对尿样进行恒温酶解。

所述的尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检 测方法，其中向尿液样品加入rac-NNAL-甲基-d3溶液、磷酸二氢氨缓冲溶 液（pH6.4,50mM）和β-葡糖苷酸酶混匀后置入恒温振荡器或微波辅助萃取 仪中在37℃恒温酶解,再将酶解后的尿样经过MIP-NNAL固相萃取小柱净化， 淋洗后用二氯甲烷洗脱，加入无水硫酸钠干燥后过滤，减压浓缩至干，加入 三乙基胺无水乙腈溶液、(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙 腈溶液，衍生化后再对样品进行HPLC-MS-MS分析，进而换算出尿样中 (S)-NNAL和(R)-NNAL的含量。

具体实施方式

以下结合应用实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描 述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。

实施例1：

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。

尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法， 该方法包括以下步骤：

1、化学试剂

(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐(CAS号20445-33-4)， (S)-(+)-α--甲氧基-(三氟甲基)苯乙酸酐(CAS号85541-57-7),4-(-甲基亚 硝氨基)-1-(3-吡啶基)-丁醇(NNAL)(rac NNAL,CAS号76014-81-8),4-(甲 基-d3-亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(rac-NNAL-甲基-d3CAS号 1020719-61-2)，三乙基胺，β-葡萄糖甘酸酶（类型IX-A，来自大肠杆菌）。

(S)-NNAL和(R)-NNAL的制备和绝对构型的确定：制备型OD-H手性色 谱柱，流动相异丙醇：正己烷的比例为10：90，分别收集两个流出色谱峰， 分别浓缩直至其残留物重量都大于1mg。分别取两个色谱峰的浓缩物，用2 ml乙醇溶解，测定其比旋光度值，比旋光度值为负值的浓缩物为(S)-NNAL， 比旋光度值为正值的浓缩物为(R)-NNAL。

2.标准曲线建立

外消旋体NNAL标准溶液：以无水乙腈为溶剂，配制浓度为1μg／mL的 rac NNAL标准品单标溶液，保留四位有效数字；以同样方式以无水乙腈为溶 剂分别配制浓度为1μg／mL的rac-NNAL-甲基-d3的单标溶液；以无水乙腈 为溶剂，按表1配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的混合标准溶 液；配制浓度为10ng／mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无 水乙腈溶液;配制浓度为10ng／mL的三乙基胺的无水乙腈溶液;分别取 0.5mL混合标准溶液于HPLC-MS-MS色谱瓶中,再按照表2分别加入(S)-(+)- α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室 温下反应过夜，在氮气氛围中真空浓缩至干，再用100μL乙腈/水（7/3） 溶解，然后立即对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析;将确定 构型后的(S)-NNAL或(R)-NNAL用乙腈溶解抽干，(S)-(+)-α-甲氧基-α-三 氟甲基苯乙酸酐进行衍生化，通过保留时间确定衍生化后的 (S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)- α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的色谱峰。外消旋体NNAL标准溶液衍生化 生成的一对非对映异构体的峰面积为1:1。以HPLC-MS-MS色谱图中 (S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的浓度与(S)-NNAL-甲 基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的浓度之比为横坐标，以色 谱图中(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的定量离子对峰 面积与(S)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的定量 离子对峰面积之比为纵坐标，建立(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲 基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线，以同样方法建立(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲 氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线。

表1rac-NNAl和氘代rac-NNAL-甲基-d3的混合标准溶液

表2混合标准溶液的衍生化

3、尿液样品处理

将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取10mL于50mL试管中， 加入100μL浓度为1ng/mL的rac-NNAL-甲基-d3溶液，再加入10mL的磷 酸二氢氨缓冲溶液（pH6.4,50mM）和500μL的β-葡糖苷酸酶（1000U/mL 尿液），充分混匀后置于恒温振荡器中或置入微波辅助萃取仪37℃避光恒温 酶解（游离NNAL的测定在加入内标后即可上MIP-NNAL固相萃取小柱净化， 不需酶解，可将酶解步骤省略）。将酶解后的尿样上样到已经分别用2mL二 氯甲烷、2mL甲醇、2mL水活化好的MIP-NNAL固相萃取小柱上进行净化，先 用4*1mL去离子水淋洗后抽干、再用2mL甲苯、2mL甲苯/二氯甲烷（9/1） 淋洗后抽干，最后用3*1mL二氯甲烷进行洗脱，合并洗脱液，加入1.0g无 水硫酸钠干燥后过滤，在氮气氛围中浓缩至干，加入0.2mL浓度为1μg/mL 的三乙基胺无水乙腈溶液，震荡1分钟，再在无水条件下加入0.3mL浓度为 1μg/mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐，室温下反应过夜，浓缩 至干，再用100μL乙腈/水（7/3）溶解后上HPLC-MS-MS检测。

4、HPLC-MS-MS检测条件

液相条件：Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm i.d．×100mm， 1.7μm)，等度洗脱：35%乙腈/65%10mM乙酸铵（PH=7.0），色谱柱温度：30 ℃，进样量：5μL，流速为：0.2mL/min。

质谱条件：电离方式：大气压化学电离；正离子模式（APCI⁺）；离子源 温度：120℃；电晕针电流：10uA；气化室温度：350℃；脱溶剂气流速：800 L/hr；气帘气：80L/hr；碰撞气：0.19mL/min；扫描时间：200ms；多反 应检测（MRM）模式,分析物特征离子对如表3。

表3分析物特征离子对

上述方法中涉及的NNK、(S)-NNAL和(R)-NNAL的化学结构式为：

实施例2：

1、外消旋体NNAL的衍生化：以无水乙腈为溶剂，配制浓度为1μg／mL 的rac NNAL标准品单标溶液，保留四位有效数字；以同样方式以无水乙腈 为溶剂分别配制浓度为1μg／mL的rac-NNAL-甲基-d3的单标溶液；以无 水乙腈为溶剂，按表1配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的混合 标准溶液；配制浓度为10ng／mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸 酐的无水乙腈溶液;配制浓度为10ng／mL的三乙基胺的无水乙腈溶液;分别 取0.5mL混合标准溶液于HPLC-MS-MS色谱瓶中,再按照表2分别加入 (S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈 溶液室温下反应过夜，在氮气氛围中浓缩至干，再用100μL乙腈/水（7/3） 溶解后立即对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析。

2、实际样品检测

将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取10mL于50mL试管中，加 入100μL浓度为1ng/mL的rac-NNAL-甲基-d3溶液，再加入10mL的磷酸二 氢氨缓冲溶液（pH6.4,50mM）和500μL的β-葡糖苷酸酶（1000U/mL尿液）， 充分混匀后置于恒温振荡器中，37℃避光恒温酶解过夜，将酶解后的尿样上 样到已经分别用2mL二氯甲烷、2mL甲醇、2mL水活化好的MIP-NNAL固相萃 取小柱上进行净化，先用4*1mL去离子水淋洗后抽干、再用2mL甲苯、2mL 甲苯/二氯甲烷（9/1）淋洗后抽干，最后用3*1mL二氯甲烷进行洗脱，合并 洗脱液，加入1.0g无水硫酸钠干燥后过滤，在氮气氛围中浓缩至干，加入 0.2mL浓度为1μg/mL的三乙基胺无水乙腈溶液，震荡1分钟，再在无水条件 下加入0.3mL浓度为1μg/mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐， 室温下反应过夜，浓缩至干，再用100μL乙腈/水（7/3）溶解后上HPLC-MS-MS 检测。使用(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液 工作曲线和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液 工作曲线计算待测样品中的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙 酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯，进而换算出该 尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的浓度分别为0.97ng/mL和0.89ng/mL。

实施例3：

1、(S)-NNAL和(R)-NNAL的制备和绝对构型的确定：用rac NNAL标准 品的无水乙腈溶液、(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈 溶液和(R)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙胺 分别进行Mosher反应，再经过纯化和1H NMR谱图测试，用Mosher方法确定 (S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)- α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的绝对构型。

2、外消旋体NNAL的衍生化和标准曲线的建立：以无水乙腈为溶剂，配 制浓度为1μg／mL的rac NNAL标准品单标溶液，保留四位有效数字；以同 样方式以无水乙腈为溶剂分别配制浓度为1μg／mL的rac-NNAL-甲基-d3的 单标溶液；以无水乙腈为溶剂，按表1配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL- 甲基-d3的混合标准溶液；配制浓度为10ng／mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α- 三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液;配制浓度为10ng／mL的三乙基胺的无水 乙腈溶液;分别取0.5mL混合标准溶液于HPLC-MS-MS色谱瓶中,再按照表2 分别加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙 基胺乙腈溶液室温下反应过夜，在氮气氛围中浓缩至干，再用100μL乙腈/ 水（7/3）溶解后立即对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析; 将确定构型后的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和 (R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯通过保留时间比对确 定衍生化后尿样中的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯 和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的色谱峰。外消旋体 NNAL标准溶液衍生化生成的一对非对映异构体的峰面积为1:1。以 HPLC-MS-MS色谱图中(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯 的浓度与(S)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的 浓度之比为横坐标，以色谱图中(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基 苯乙酸酯的定量离子对峰面积与(S)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯的定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立 (S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线， 以同样方法建立(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标 准溶液工作曲线。

3、实际样品检测

将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取10mL于50mL试管中，加 入100μL浓度为1ng/mL的rac-NNAL-甲基-d3溶液，再加入10mL的磷酸二 氢氨缓冲溶液（pH6.4,50mM），充分混匀后上样到已经分别用2mL二氯甲烷、 2mL甲醇、2mL水活化好的MIP-NNAL固相萃取小柱上进行净化，先用4*1mL 去离子水淋洗后抽干、再用2mL甲苯、2mL甲苯/二氯甲烷（9/1）淋洗后抽 干，最后用3*1mL二氯甲烷进行洗脱，合并洗脱液，加入1.0g无水硫酸钠 干燥后过滤，在氮气氛围中浓缩至干，加入0.2mL浓度为1μg/mL的三乙基 胺无水乙腈溶液，震荡1分钟，再在无水条件下加入0.3mL浓度为1μg/mL 的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐，室温下反应过夜，浓缩至干， 再用100μL乙腈/水（7/3）溶解后上HPLC-MS-MS检测。使用 (S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线和 (R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线计 算待测样品中的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和 (R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯，进而换算出该尿液中 游离的(S)-NNAL和(R)-NNAL的浓度分别为0.30ng/mL和0.26ng/mL。

实施例4：

1、外消旋体NNAL的衍生化：外消旋体NNAL标准溶液：以无水乙腈为 溶剂，配制浓度为1μg／mL的racNNAL标准品单标溶液，保留四位有效数 字；以同样方式以无水乙腈为溶剂分别配制浓度为1μg／mL的rac-NNAL- 甲基-d3的单标溶液；以无水乙腈为溶剂，按表1配制含有rac-NNAL和氘代 rac-NNAL-甲基-d3的混合标准溶液；配制浓度为10ng／mL的(S)-(+)-α- 甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液;配制浓度为10ng／mL的三乙 基胺的无水乙腈溶液;分别取0.5mL混合标准溶液于HPLC-MS-MS色谱瓶中, 再加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液和三乙基 胺乙腈溶液70℃下反应过夜，在氮气氛围中浓缩至干，再用100uL乙腈/ 水（7/3）溶解后立即对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析。

2、实际样品检测

将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取10mL于50mL试管中，加 入100μL浓度为1ng/mL的rac-NNAL-甲基-d3溶液，再加入10mL的磷酸二 氢氨缓冲溶液（pH6.4,50mM）和500μL的β-葡糖苷酸酶（1000U/mL尿液）， 充分混匀后置入微波辅助萃取仪，37℃恒温酶解100s,静置10分钟，再37 ℃恒温酶解100s，将酶解后的尿样上样到已经分别用2mL二氯甲烷、2mL 甲醇、2mL水活化好的MIP-NNAL固相萃取小柱上进行净化，先用4*1mL去 离子水淋洗后抽干、再用2mL甲苯、2mL甲苯/二氯甲烷（9/1）淋洗后抽干， 最后用3*1mL二氯甲烷进行洗脱，合并洗脱液，加入1.0g无水硫酸钠干燥 后过滤，在氮气氛围中浓缩至干，加入0.2mL浓度为1μg/mL的三乙基胺 无水乙腈溶液，震荡1分钟，再在无水条件下加入0.3mL浓度为1μg/mL 的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯，室温下反应过夜，浓缩至干， 再用100μL乙腈/水（7/3）溶解后上HPLC-MS-MS检测。使用 (S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线和 (R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线计 算待测样品中的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和 (R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯，进而换算出该尿液中 (S)-NNAL和(R)-NNAL的浓度分别为1.08ng/mL和1.03ng/mL。

需要指出，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发 明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均 应包含在本发明的保护范围之内。

与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：

1、本发明使用衍生化HPLC-MS-MS法测定尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL， 具有检测限低、稳定性好、快速准确等优点；

2、本发明方法的检测结果受主观判断因素影响小，易于推广应用。

3、本发明适用于尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质 谱联用检测，是一种科学评估个体对烟气中NNK的暴露程度的方法，填补了 这一技术领域的空白。

4、本发明的方法具有检测限低、速度快、准确度和灵敏度高的特点， 适用于各种人体尿液常见样本中的(S)-NNAL和(R)-NNAL的检测，对于检测尿 液中的(S)-NNAL和(R)-NNAL的含量以及评估人体对烟气中NNK的暴露程度具 有重要意义。