人类重度子痫前期发生相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用

摘要

本发明属于基因工程及临床医学领域，公开了人类重度子痫前期发生相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用。该标志物选自hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424和hsa-miR-10a中的多种。该标志物对重度子痫前期患者具有特异性和敏感性，可用于制备重度子痫前期的诊断或监测试剂盒。

说明书

发明领域

本发明属于基因工程及临床医学领域，涉及人类重度子痫前期发生相关的血清微 小核糖核酸（microRNA，miRNA）标志物及其应用。

背景技术

我国妊娠期高血压疾病发病率约为9.4%，国外报道为7%～12%，是孕产妇及围 生儿死亡的重要原因。妊娠期高血压疾病包括妊娠期高血压、子痫前期、子痫、慢性 高血压并发子痫前期以及慢性高血压。子痫前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特有的 涉及多系统的疾病，发病率为1%～5%，以妊娠20周后发生高血压、蛋白尿、水肿 等为主要临床特点。子痫前期根据病情轻重分为轻度和重度两类。轻度子痫前期是指 妊娠20周后出现血压≥140/90mmHg，尿蛋白（+）或尿蛋白≥300mg/24h，可伴有 上腹部不适、头痛等症状。子痫前期患者出现下述任一不良情况可诊断为重度子痫前 期：①血压持续升高：收缩压≥160mmHg和（或）舒张压≥110mmHg；②蛋白尿≥ 2.0g/24小时或随机蛋白尿≥（++）；③血清肌酐≥1.2mg/dL除非已知之前就已升高； ④血小板<100,000/ML（<100×10⁹/L）；⑤微血管病性溶血—LDH升高；⑥血清转氨 酶水平升高—ALT或AS；，⑦持续头痛或其他大脑或视觉障碍；⑧持续上腹部疼痛。 病情严重者可以导致子痫，甚至合并全身多脏器损害如肝肾功能损害、脑出血、心力 衰竭、弥漫性血管内凝血等，严重威胁母儿的安全。

子痫前期的好发因素包括初产妇、孕妇年龄小于18岁或大于40岁、多胎妊娠、 合并慢性高血压、慢性肾炎、抗磷脂综合征、糖尿病等内科疾病、营养不良以及子痫 前期家族史等。子痫前期发病愈早、母儿受损时间越长、并发症越多、预后也越差。 因此围生医学根据本病发病早晚又分为早发型子痫前期和迟发型子痫前期。近来研究 发现早发型与迟发型子痫前期在遗传背景、发病与复发风险、病理生理指标改变、临 床特点、远期心血管病风险有一定差别。早发型子痫前期主要表现为胎盘功能紊乱与 血管内皮功能障碍；而迟发型子痫前期常表现为母体的异常反应。如何确定早发型与 迟发型的分界？根据美国和加拿大等国家标准，一般把妊娠34周前发生的子痫前期 定为早发型子痫前期；≥34周发病的子痫前期称为迟发型子痫前期。但近年来又有 研究表明妊娠32周前发病的子痫前期引起的孕产妇死亡率是足月后发生子痫前期的 20倍，所以国内外有些学者也把妊娠32周作为早发型与迟发型子痫前期的分界。

子痫前期发病机制尚未完全阐明，目前大多认为是胎盘相关性疾病，胎盘的娩出 后病情缓解或治愈。具有遗传易感性，可能涉及血压调节、血栓形成、血管内皮细胞 功能、血管重铸、代谢免疫等等相关的基因。在多基因背景下、生活行为、环境等因 素相互作用，可能影响母胎免疫耐受、母胎界面滋养细胞功能障碍、侵袭力下降使胎 盘浅着床、或螺旋动脉重铸不足，胎盘缺血缺氧、局部细胞免疫反应增强、胎盘局部 出现氧化应激释放氧自由基导致血管内皮激活和损伤，血管内皮合成或分泌血管收缩 因子舒张因子平衡失调，导致小动脉痉挛、胎盘及全身脏器血液灌流量下降。此外血 管内皮损伤又可使凝血因子增加，抗纤溶活性增强，纤溶活性下降致血液高凝状态或 微血栓形成，甚至发生慢性血管内凝血（DIC），引起多脏器损害。胎盘功能减退、 胎盘缺血缺氧可以导致胎儿生长受限、胎儿宫内窘迫、医源性早产、胎死宫内甚至新 生儿死亡。

子痫前期治疗以监测母胎状态、对症治疗（如解痉、镇静、降压、促胎儿生长等）、 必要时终止妊娠以减少母儿并发症为主要处理措施，至今终止妊娠仍是唯一的治愈方 法。子痫前期临床诊断时间为妊娠20周后，但本病在发病前一段时期机体就可能发 生一系列病理生理改变，并且对母儿产生不同程度损害，甚至是无法挽回的不良结局。 因此我们需要在亚临床或更早、甚至孕前就采取相关的干预措施来避免或减少本病的 发生、减慢病程，减轻母儿的不良结局。为此我们迫切需要寻找本病特异标志物与治 疗靶点，从而尽早启动预防与干预措施，对减少本病的发生、改善母儿预后具有极其 重要的意义。

微小核糖核酸（microRNA，即miRNA）是近年刚刚兴起的研究热点，它是一类 长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，多位于基因组非编码区，进化上高度保守，可 在转录后水平对基因表达进行调节，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、 组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在 着紧密的联系。自参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA已逐渐 成为调控mRNA稳定性和蛋白翻译的研究热点，分别在2002年和2003年两度入选 Science杂志年度十大科技突破。现在预测miRNA至少能调控数千个人类基因，占所 有基因的30%以上。随着研究的深入，越来越多的miRNA被发现。目前，miRNA与 肿瘤的关系已成为研究的重点，已发现若干miRNA通过负调控基因的表达与慢性淋巴 细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。然而，血清miRNA与重度子痫前期 等的相互关系尚未见报道。

最新的研究成果发现血清中存在上百种的miRNA，性质稳定、含量丰富、易于定 量检测，且存在显著的疾病特异性，在肺癌、结肠癌中已经证实血清miRNA的表达谱 可作为早期诊断的潜在生物标志物。这一发现令人振奋，血清miRNA作为一类非编码 调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物，开拓了生物标 志物的新境界。该研究迅速引起国际媒体的广泛关注，路透社、合众社、《科学的美国 人》、美国《技术评论》等都对该研究成果进行了专门报道，《Nature》杂志也在其网 站首页的―最新研究进展‖专栏中展示了这一最新研究进展。然而血清中miRNA在重度 子痫前期早期诊断监测中的应用还未得到相应的关注，若能发现稳定的与重度子痫前 期发病相关的特异血清miRNA作为生物标志物，并研发相应疾病的诊断、监测试剂 盒，不仅在该领域处于国际领先地位，可创造令人瞩目的经济效益，对我国妊娠高血 压的防治也将是一次强有力的推动。

发明内容

本发明的目的是提供与人类重度子痫前期发生相关的血清microRNA标志物。

本发明的另一个目的是提供上述血清microRNA标志物的引物。

本发明还有一个目的是提供上述血清microRNA标志物或其引物的应用。

本发明再有一个目的是提供含有上述血清microRNA标志物或其引物的用于人类 重度子痫前期诊断或监测的试剂盒。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

与人类重度子痫前期相关的血清microRNA标志物，选自hsa-miR-193a-5p、 hsa-miR-424和hsa-miR-10a中的多种。

所述的血清microRNA标志物由hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424和hsa-miR-10a构 成。所述的血清microRNA标志物，其中hsa-miR-193a-5p的序列为 ugggucuuugcgggcgagauga（SEQ ID No.1），hsa-miR-424的序列为cagcagcaauucauguuuugaa （SEQ ID No.2），hsa-miR-10a的序列为uacccuguagauccgaauuugug（SEQ ID No.3）。

所述的血清microRNA标志物的引物，其中序列为SEQ ID No.1的标志物的上游引 物为SEQ ID No.4，下游引物为SEQ ID No.5；序列为SEQ ID No.2的标志物的上游引 物为SEQ ID No.6，下游引物为SEQ ID No.7；序列为SEQ ID No.3的标志物的上游引 物为SEQ ID No.8，下游引物为SEQ ID No.9。

所述的血清microRNA标志物或其引物在制备重度子痫前期诊断或监测试剂中的 应用。所述试剂是能够测定这些血清microRNA标志物在血清中表达量的试剂。

一种人类重度子痫前期诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述血清microRNA标志 物（hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424和hsa-miR-10a中的多种）的引物。

所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述引物（SEQ ID No.4和SEQ ID No.5， SEQ ID No.6和SEQ ID No.7，SEQ ID No.8和SEQ ID No.9）中的多对。

所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有下列3对引物SEQ ID No.4和SEQ ID  No.5，SEQ ID No.6和SEQ ID No.7，SEQ ID No.8和SEQ ID No.9。

试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。

本发明详细描述如下：

本发明人以标准操作程序（SOP）采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人 群基础信息和临床资料，并采用了RT-PCR方法、TaqMan miRNA Array、Real-time PCR （TaqMan探针和染料法）方法的一种或几种进行检测。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

一、研究对象选择和分组依据

A组：健康对照组（n=100，20人芯片筛选，40人一期验证，40人独立人群验 证），无其他全身性重大疾病。

B组：重度子痫前期组（n=100，20人芯片筛选，40人一期验证，40人独立人群 验证），无其他全身性重大疾病。

二、血液血清分离及前处理

（1）新鲜肝素抗凝血5ml于离心机3000rpm离心5min，取上清每100μl分装至 洁净1.5ml EP管中

（2）向EP管中加入900μl TRIzol，充分混匀后，12000rpm离心15min，立即取 上清至一洁净1.5ml EP管中。

（3）向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇，充分混匀后转移至离心柱， 10000rpm离心15秒，弃下层废液。

（4）在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液。

（5）在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。

重复一遍。

（6）将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓 冲液。

（7）将离心柱装在一个新的1.5ml的离心管中，并在柱子上加入50μlDEPC处理的 水，离心1分钟。

（8）-70℃保存处理后的样本。

本发明实验中使用的离心柱和配套试剂（RWT缓冲液、RPE缓冲液）均来自Qiagen  miRNeasy Mini Kit（货号217004）这个试剂盒，下同。

三、Real-time PCR方法测量血清miRNAs表达量

1.取经前处理的血清，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。

按下表所示配制反转录体系：

2.将PCR管反复颠倒混匀6次后做简短离心，冰上放置5分钟。

3.将PCR管放入PCR仪进行反转录，反应条件如下表所示：

反转录产物保存于4℃冰箱以用于下一步的预扩增。

4.逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增：

预扩增的反应条件如下表所示：

降至4℃后，将预扩增产物保存于4℃冰箱以用于下一步的Real-time PCR反应。

5.将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离 心。预扩增产物可以直接用于下面的Real-time PCR。

预扩增产物进行Real-time PCR按下表所示配制反应体系：

考虑到吸液损失而放量12.5%。

6.检测并比较健康对照组、重度子痫前期组血清样本中miRNAs表达量

的差异。

检测到的存在差异表达的健康对照和重度子痫前期患者血清miRNAs包括 hsa-miR-193a-5p（SEQ ID No.1）、hsa-miR-424（SEQ ID No.2）、hsa-miR-10a（SEQ ID  No.3）。这些miRNAs在重度子痫前期患者中的拷贝数都显著低于健康对照组，并且 这些miRNAs在血清中表达具有稳定性。

四、Real-time PCR方法验证血清miRNAs表达量

1.设计3条目标miRNAs的引物：运用Stem-loop PCR方法设计引物。

2.加入荧光染料进行Real-time PCR反应。检测并比较健康孕妇、重度子痫前期 患者血清样本中miRNAs表达量的差异（病例和对照各100人）。

3.选择独立人群（对照和病例各40人）进行Real-time PCR检测，结果一致的有 3条miRNAs，具体为：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424、hsa-miR-10a。

因此，最终确认为存在差异表达的健康孕妇和重度子痫前期患者血清miRNAs包 括hsa-miR-193a-5p（SEQ ID No.1）、hsa-miR-424（SEQ ID No.2）、hsa-miR-10a（SEQ  ID No.3），具体引物见表1。它们在重度子痫前期患者血清中的拷贝数都显著低于健 康对照组，并且这些miRNAs在血清中表达具有稳定性。采用SEQ ID No.1、SEQ ID  No.2、SEQ ID No.3这3个构成的组合可以将对照组、重度子痫前期组区分开。虽然 这3条单独也可以分开两组人群，但如果只用1条，可能会有重合，而如果同时使用 3条，即使1条差异不大，但另外2条表达差异都很大，就可以将其带入评分高的组。

五、诊断试剂盒制备方法

根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于重度子痫前期动态监测 的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者血清中稳定存在且可检测的成熟 hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424、hsa-miR-10a的引物和工具。诊断试剂盒包括一批血清 miRNAs引物，还可以包括Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸等试剂。

本发明的有益效果：

本发明人通过分离和比较正常对照和重度子痫前期患者血清中的miRNAs，发现 了血清中存在可用于评估是否患有重度子痫前期患者的特异性和敏感性（实施例5的 ROC曲线提示具有较好的灵敏度，实施例6对其实际效果进行了验证，即重度子痫前 期患者均被正确检测识别）的miRNA组合，因而提出了重度子痫前期患者的血清 miRNA标志物组合，以及该血清miRNA标志物或其引物在制备重度子痫前期诊断或 监测试剂中的应用，研制出可便于临床应用的重度子痫前期诊断、监测试剂盒。

本发明采用血清miRNA作为重度子痫前期评价的标志物的优越性在于：

（1）血清miRNA是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、 微创、易于检测，且定量精确，将大大提高重度子痫前期诊断的敏感性和特异性，该类 小分子RNA生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，将为妊 娠合并综合症的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

（2）本发明提供的血清miRNA标志物可用作重度子痫前期诊断标志物，可避免侵 入性诊断，并可在早期进行辅助诊断，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快 速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支 持，延缓和阻止疾病进展。

（3）本发明采用符合重度子痫前期和健康对照人群的样本进行验证，证明这几种 标志物表达量存在显著性差异并具有稳定性，以说明该标志物具有特异性，可作为标 志物使用。

（4）本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选多种血清 miRNAs，应用Real-time PCR等方法进行二次验证和独立人群验证，采用分层评分系统 对诊断结果进行标化，并在另一组独立人群中对血清miRNA标志物和诊断试剂盒进行 盲法评价，保证了该血清miRNA生物标志物和诊断试剂盒的可靠性。

附图说明

图1以hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424、hsa-miR-10a作为标志物对健康对照和 重度子痫前期组进行区分。

图2个体血清miRNAs连续表达水平波动性分析。

图3正常对照组和重度子痫前期组之间的ROC曲线。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1研究对象选择和分组依据

本发明人于2009年7月到2011年10月间分三次从南京医科大学附属医院搜集 符合要求的重度子痫前期患者及健康对照孕妇血液样品，通过对样品资料的整理，从 中选择了符合要求的100例健康对照（平均年龄：27.63±3.25天）、100例重度子痫 前期患者（平均年龄：28.56±4.15天）作为Real-time PCR检测miRNA表达的实验 对象。具体的样品归类标准如下：

A组：健康对照组（n=100，20人芯片筛选，40人一期验证，40人独立人群验 证）：

1.无其他全身性重大疾病。

B组：重度子痫前期组（n=100，20人芯片筛选，40人一期验证，40人独立人群 验证）：

1.经临床诊断为重度子痫前期；

2.无其他全身性重大疾病。

实施例2TaqMan miRNA array筛选

制备cDNA样品：a）取100μl血清；b）加入900μl Trizol，振荡混匀，4℃，12000 rpm离心15分钟，弃下层废液；c）加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀，转 至离心柱，12000rpm离心15秒，弃下层废液；d）在离心柱上加入700μl RWT缓冲液， 10000rpm离心15秒，弃下层废液。e）在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm 离心15秒，弃下层液。f）重复e。g）将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm 离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。h）在柱子上加入50μlDEPC处理水12000rpm离 心收集RNA。i）然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl10mM dNTP混合液（Takara公司）、0.5μl RNA酶抑制剂（Takara 公司）、1μl AMV（Takara公司）以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤 为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟。（若针对不同miRNA则采 用对应的miRNA反向引物按上述步骤进行）

逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增：

预扩增的反应条件如下表所示：

将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预 扩增产物可以直接用于下面的实时荧光定量PCR（qPCR）。

预扩增产物进行qPCR按下表所示配制反应体系：

考虑到吸液损失而放量12.5%。

检测并比较健康对照、重度子痫前期血清样本中miRNAs表达谱的差异，筛选 出有4倍差异以上的miRNAs。经生物信息学分析和动物实验结果，选定其中3条成 为候选并进行进一步验证，具体为：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424、hsa-miR-10a。

实施例3Real-time PCR方法测量血清miRNA表达量

设计引物（表1）分别对80例健康对照、80例重度子痫前期患者的血清进行各 miRNAs的定量Real-time PCR检测。

（1）制备cDNA样品：a）取100μl血清；b）加入900μl Trizol，振荡混匀，4℃， 12000rpm离心15分钟，弃下层废液；c）加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀， 转至离心柱，12000rpm离心15秒，弃下层废液；d）在离心柱上加入700μl RWT缓冲 液，10000rpm离心15秒，弃下层废液。e）在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm 离心15秒，弃下层液。f）重复e。g）将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm 离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。h）在柱子上加入50μl DEPC处理水12000rpm离 心收集RNA.i）然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl10mM dNTP混合液（Takara公司）、0.5μl RNA酶抑制剂（Takara 公司）、1μl AMV（Takara公司）以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤 为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；

（2）Real-time PCR：染料法：取1μl cDNA，将cDNA倍比稀释，加入0.3μl Taq 酶（Takara公司），1μl20×EVA GREEN，0.25μl10μM上述单一miRNA对应的正向 引物，0.25μl10μM通用反向引物（URP），1.2μl25mM MgCl₂，1.6μl2.5mM dNTP 混合液（Takara公司），2μl10×PCR缓冲液，12.4μl纯水，20μl体系进行荧光定量 PCR。10μl TaqMan universal PCR master Mix，6.6μl H₂O，20μl体系进行q-PCR。仪 器使用的都是ABI Prism7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件都是：95℃、5分 钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。检测并比较健康对照、 重度子痫前期患儿血清样本中miRNA表达量的变化，各组样品血清miRNA的表达 量比值可用方程2^–△G表示，其中△G=C_Tgroup1–C_Tgroup2。为保证各次实验间的可比性， 我们在每板上都设置了U6，以其表达量作为内参调整计算表达量。

从结果分析得出，hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424、hsa-miR-10a这三条miRNA 在各组间均有显著差别（图3）。非参数的趋势性检验也显示了相同的差异。

表1  miRNAs的引物序列

实施例4个体血清miRNA表达量的稳定性分析

采用实施例3的方法对8名孕妇的血清miRNA水平的稳定性进行评价。和实施 例1同样的采集方法采集研究对象连续3次血清（间隔时间为2天，间隔期内无疾病）。 结果显示，血清中hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424、hsa-miR-10a这三个miRNA表达 水平较稳定（图2）。这些都提示了个体血清miRNA的表达量较为稳定，具备作为诊 断/监测标志物的特性。

实施例5miRNA组合对重度子痫前期的判断

根据上述Real-time PCR方法，本发明人通过对病例和对照组血清样品的miRNAs 表达水平的分析，以健康对照组miRNAs表达量的五分位数为阈值，对 hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424、hsa-miR-10a进行评分，进一步求得总得分，以此绘 制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这三个miRNAs低表达或高表 达对重度子痫前期的评估能力。ROC分析结果显示，hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424、 hsa-miR-10a以81.00%的AUC（ROC曲线下面积）将正常对照组和重度子痫前期组分 开（图3）。

在上述一系列研究结果的基础上，本发明人证明了采用hsa-miR-193a-5p、 hsa-miR-424、hsa-miR-10a能够很好地将重度子痫前期患者和健康对照分开。

实施例6miRNA分层评分和独立人群盲法验证

当对hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424、hsa-miR-10a这三个标志物的表达水平进行 分层评分时（五分位数分层后累加），能够对是否患有重度子痫前期进行评估，表述为 积分越高，确认为重度子痫前期的风险越高。

表3  三个miRNAs五分位数得分并求和

注：每个miRNA按表达量的五分位数分为五个等级0、1、2、3、4，最低的0 分，最高的4分，3条miRNA综合可以得分为0～12分，而重度子痫前期组绝大多数 得分很低（表达量低，积分按反向计算），而正常对照组绝大多数得分很高。举例来说， 如有一个样本评分为12分（最高的分值组），则其不可能为重度子痫前期病例，而应 为正常对照。

针对得出的评估分值（即根据具体得分判断其分组，得高分的归入对照组，得 低分的归入重度子痫前期组；比较而言，≥9算高分，≤3算低分），对另一组独立采 集的人群进行盲法首诊，即采用双盲试验，对独立人群（另一医院采集的40例孕妇） 同时进行常规诊断分析和血清样品的miRNA检测，结果显示通过3个miRNA检测评 分，可以将重度子痫前期及对照孕妇很好的区分开（40例随机选择样本中有7例评分 较低（≤3分），其中达到0分（最高分）的有4例，这4例经诊断均为重度子痫前 期，其余评分较高（≥9分）的均为非重度子痫前期），提示这几种miRNA可作为评 估重度子痫前期的标志物。

实施例7用于重度子痫前期诊断和监测的miRNA诊断试剂盒的制作

该miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于RT-PCR、Real-time PCR技术。

首先通过测序的方法和Real-time PCR方法确定正常人和重度子痫前期患者血清 中有一个以上拷贝的miRNA。然后通过定量PCR等技术筛选与重度子痫前期相关的 一类血清miRNA，作为预测是否患有重度子痫前期以及诊断的指标。最后筛选出对 应的血清miRNA的数量控制在几条，这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。 此试剂盒包括一批血清miRNA引物，其中miRNA的引物包括hsa-miR-193a-5p、 hsa-miR-424、hsa-miR-10a、U6的正反向引物（见表1）。还可以有相关PCR技术常 用的试剂，如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl₂、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、染料等 试剂，这些试剂也可采用相应的市售产品。此试剂盒的价值在于只需要一次抽出少量 （1～2ml）血液，即可检测血清miRNA标志物的变化趋势，再通过该变化趋势预测 重度子痫前期发生可能性或诊断重度子痫前期病，并易于进行动态监测和观察治疗效 果。

具体试剂盒组成如下：

引物也可以是以下三对引物中的二对或三对：SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，SEQ  ID NO.6和SE Q ID NO.7，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，各10μM0.25μl。

试剂盒中还可以含有0.3μl Taq酶，1μl20×EVA GREEN，1.2μl25mM MgCl₂，1.6μl 2.5mM dNTP混合液，2μl10×PCR缓冲液，12.4μl纯水。

试剂盒中还可以含有内参U6的正反向引物一对（表1）。

或者试剂盒中除正向引物外还含有1μl10μM通用反向引物，10μl TaqMan通用 PCR混合液，6.6μl H₂O。

试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于miRNA含量检测的相 应试剂。

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