去氧肾上腺素的生物素衍生物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种去氧肾上腺素的生物素衍生物及其制备方法，包括以下步骤：(1)双异端基聚乙二醇的合成；(2)去氧肾上腺素的哌嗪衍生物的合成；(3)去氧肾上腺素哌嗪衍生物的生物素化的合成。本发明公开了此去氧肾上腺素的生物素衍生物作为荧光探针的应用。首次合成了可用于连接链霉亲和素化量子点的α

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物素衍生物，具体涉及一种α₁肾上腺素受体激动剂去氧肾上腺素的 生物素衍生物及其制备方法和应用，特别是利用聚乙二醇连接激动剂去氧肾上腺素与生物 素的方法，属于药物化学、有机合成化学、高分子化学领域。

背景技术

受体是许多药物的治疗靶点。受体与药物相互作用机制的研究对于发病机制的阐释以 及药物的研发具有重要的意义。受体与药物的相互作用主要发生在细胞内部或者由细胞表 面进入内部的过程中。对这些过程的研究需要对活细胞内的受体进行示踪。早期研究中采 用放射性配体标记或荧光标记方法来示踪受体。尽管这些标记方法各有优势，但仍存在一 些缺点。放射性配体标记法不能实现对活细胞内受体的可视化，并且对实验对象和操作者 会造成放射性伤害。荧光标记物的低光稳定性限制了其在长时间受体成像中的应用。因此 需要一种具有生物兼容性及高光稳定性的新型标记物。

量子点（QDs）由于其独特的性质，包括大小可调、发射光谱窄、激发光谱宽、光稳定 性高、耐光漂白性好，具有作为长时间示踪受体的荧光标记物的潜力。为了能够有效的标 记细胞内受体，量子点需要用一些生物兼容性的分子如磷脂、两性聚合物、肽类以及核酸 包被，再与生物识别的分子结合。许多生物活性分子如蛋白质、核酸以及抗体均与QDs相 连并用于受体的标记。最常用的方法是将生物素与生物活性分子相连，再将生物素化的配 体与链酶亲和素化的量子点相结合。如Rajan与Vu用RTA抗TrkA抗体与量子点相连用于 示踪TrkA受体在PC12细胞中的受体动力学过程。

另一种方法是合成具有活性的小分子的衍生物并与量子点相连。与肾上腺素相互作用 的肾上腺素受体配体在这一方面特别受到关注。肾上腺素在心血管、呼吸、内分泌系统中 有广泛的生理作用，同时是许多药物的靶点。细胞膜表面的肾上腺素在激动剂的刺激下可 以内吞入细胞内部。肾上腺素还可以激活多种信号转导途径如肌醇磷酸钙信号系统和甘油 二酯-蛋白激酶C信号系统。肾上腺素的分布变化以及信号转导对于血压的调节、神经系统 以及新陈代谢的研究具有重要的意义。α₁-肾上腺素是肾上腺素的一种，α_1B-肾上腺素是α₁- 肾上腺素的一个亚型，由于其在细胞内的高表达以及仅分布在细胞膜表面的特性而可以被 用来作为示踪肾上腺素的模型。前期研究中合成了由哌唑嗪的衍生物和量子点构成的探针 用于在活细胞中定位细胞表面α₁-肾上腺素，但不能可视化细胞内的动态过程。缺少可以示 踪受体细胞内动态过程的探针限制了受体作用机制的研究。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种去氧肾上腺素的生物素衍生物。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种去氧肾上腺素的生物素衍生物，结构式如下：

其中n=25-60。

一种去氧肾上腺素的生物素衍生物的制备方法，包括以下步骤：

（1）双异端基聚乙二醇的合成：

在干燥密封的反应瓶中，加入体积比为1∶1.5-1∶2.1的六甲基二硅基胺基钾和环氧乙烷， 用有机溶剂溶解，搅拌，冰浴反应15-25小时，然后加入六甲基二硅基胺基钾物质的量的 0.3-0.6倍的丁二酸酐，继续反应5-6个小时，最后加入过量冰醋酸，避光搅拌反应3-4个小 时，将反应液滴入乙醚中沉降即得到双异端基聚乙二醇固体；

（2）去氧肾上腺素的哌嗪衍生物的合成：

将去氧肾上腺素的氨基进行保护，然后与对甲苯磺酸乙二醇二酯以摩尔比为1∶5-1∶9的 比例在有机溶剂中反应，最后与六水哌嗪在氨基保护的去氧肾上腺素物质的量的25-30倍的 二氧六环中以摩尔比为1∶2-1∶3进行反应，将去氧肾上腺素连接到哌嗪的一端；

（3）去氧肾上腺素哌嗪衍生物的生物素化的合成：

将双异端基聚乙二醇、生物素的衍生物、DMAP按质量比为30-35∶4-5∶1加入到封闭干 燥的反应瓶中，有机溶剂溶解，40℃避光、搅拌反应35-50小时，然后加入与生物素的衍生 物同质量的二环己基碳二亚胺反应15-25小时；向反应液中加入与二环己基碳二亚胺同质量 的N-羟基琥珀酰亚胺，40℃水浴中避光、搅拌反应30-40小时；然后继续向反应液中加入 与N-羟基琥珀酰亚胺同等物质的量的去氧肾上腺素哌嗪衍生物，40℃避光、搅拌反应30-40 小时；最后加入与N-羟基琥珀酰亚胺同等物质的量的三氟乙酸，搅拌反应1-2个小时以去 掉氨基保护基团，将反应液逐滴滴入乙醚中沉降，即得到固体产物。

优选的，步骤（1）和（3）中所述的双异端基聚乙二醇为一端氨基，一端羧基的聚乙 二醇NH₂-PEG-COOH。

优选的，步骤（1）中所述的有机溶剂为无水四氢呋喃。

优选的，步骤（1）和（3）中，将反应液滴入乙醚中沉降三次，得到的固体在40℃下 真空干燥15-25小时。

优选的，步骤（2）中将去氧肾上腺素的氨基用二碳酸二叔丁酯进行保护；所述的有机 溶剂依次为N，N’-二甲基甲酰胺和二氧六环。

优选的，步骤（3）中所述的有机溶剂为双异端基聚乙二醇质量3%的无水二甲基亚砜； 所述的生物素的衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯；所述的生物素的衍生物、二环己基 碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、去氧肾上腺素哌嗪衍生物的物质的量相同，均为双异端基 聚乙二醇的1.5倍。

去氧肾上腺素的生物素衍生物作为荧光探针的应用。本发明的有益效果是：

本发明发展了一种由受体激动剂的衍生物与量子点构成的探针用于长时间示踪α_1B-肾 上腺素受体细胞膜和细胞内的动态过程。特别的是，受体激动剂的衍生物与链酶亲和素化 的量子点之间连有PEG链。使用PEG链可以有效减少量子点与受体配体间的空间位阻，从 而可以减少细胞表面的非特异性吸附。

选用了去氧肾上腺素作为受体的激动剂。去氧肾上腺素是一种α₁-肾上腺素受体的选择 性激动剂，对各个亚型没有选择性，可以特异性的与α_1B-肾上腺素受体结合，激活受体， 产生肾上腺素样作用，并引起受体内吞。本工作选择了过度表达α_1B-肾上腺素受体的人胚 胎肾293α_1B（HEK293α_1B）细胞作为模型示踪活细胞中的α_1B-肾上腺素受体。我们证明了 去氧肾上腺素-PEG-QD可以有力并特异性的与α_1B-肾上腺素受体结合。去氧肾上腺素的生 物活性不受QD介入的影响。与哌唑嗪探针相比，该探针可以用于细胞内过程的研究。该 探针有望用于长时间的细胞内的受体作用动态过程的追踪研究。

本发明在合成前对去氧肾上腺素中具有生物活性的氨基进行了保护，使其在生物素化 后仍然保留活性。生物素化过程中采用连续加料的方式，以上述原料聚乙二醇 H₂N-PEG-COOH为基础，利用酯的胺解反应使一端的氨基与N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯反 应，从而将生物素连接到PEG上；同样，另一端的羧基被N-羟基琥珀酰亚胺活化后通过胺 解反应与药物一端的氨基反应，将其连接到PEG的另一端，形成产物。合成的整个过程中 严格控制水的存在，并保持40℃的恒温，避光下反应。为了提高反应的效率，适当延长了 反应的时间，增加了小分子物质的量，使其与PEG的摩尔比为1.5∶1。由于合成过程中的 小分子物质都可以溶解于反应液和大量乙醚的混合溶液中，所以通过多次沉降的方法可以 除去未反应的小分子物质，提高产物的纯度。

本发明制备方法的优点在于：

1、首次合成了可用于连接链霉亲和素化量子点的α₁肾上腺素受体激动剂去氧肾上腺素 的生物素衍生物，保留了其药物活性部分，为今后量子点在α₁肾上腺素受体研究领域的应 用提供了工具。

2、方法使用PEG连接α₁肾上腺素受体激动剂和生物素，可以降低量子点的非特异性 吸附及连接激动剂后对其带来的空间位阻。

3、采用连续加料的方式，方法简捷有效，减少了中间步骤，使用乙醚沉降法进行提纯， 操作简单，提纯效果好。

附图说明

图1是合成产物Bio-PEG-去氧肾上腺素的¹H NMR图谱；

图2是合成产物Bio-PEG-去氧肾上腺素的基质辅助-激光解吸飞行时间质谱图；

图3是去氧肾上腺素-PEG-QD与细胞结合特异性实验的全内反射荧光显微图像；

图4是去氧肾上腺素-PEG-QD与细胞结合特异性实验的流式细胞直方图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为 了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为分析纯，且可从商业途径得到。

本发明涉及的氨基保护过程，对甲磺酸乙二醇二酯合成过程以及其他具体的合成过程 见硕士论文（周国桁，《基于量子点的α₁肾上腺素受体荧光探针的设计、合成及其在活细 胞中的初步应用[D].山东：山东大学化学与化工学院,2010.35-38.）

一种去氧肾上腺素的生物素衍生物的制备方法，反应路线如下：

实施例1：

双异端基聚乙二醇H₂N-PEG-COOH的合成

在干燥密封的单口瓶中，加入2.2mL六甲基二硅基胺基钾和4.5mL环氧乙烷，以18mL 无水四氢呋喃溶解，搅拌，冰浴反应24小时，然后加入0.50g丁二酸酐，继续反应5-6个 小时，最后加入过量冰醋酸，避光搅拌反应3-4个小时，将反应液滴入大量乙醚中沉降三次， 将所得固体在40℃下真空干燥24小时得到棕色固体3.64g，产率95.6%。

实施例2：

t-Boc-去氧肾上腺素的合成

将去氧肾上腺素的氨基进行保护：向25mL单口瓶中加入1.21g(6mmol)盐酸去氧肾上 腺素，用7mL2MNaOH溶液溶解，磁子搅拌20分钟后放入冰浴中。将1.47g(6.7mmol) 二碳酸二叔丁酯溶解于1mL四氢呋喃中配成溶液，用恒压滴液漏斗将溶液缓慢滴加入单口 瓶中，并加快搅拌。滴加完成后撤去冰浴，在室温下搅拌，TLC（薄层色谱分析）跟踪反 应，24小时反应完毕，用冰醋酸调节反应液至pH=7，用15mL×3二氯甲烷萃取，蒸干二 氯甲烷层，得到黄色粘稠样产物1.39g，产率：91.6%。

实施例3：

对甲苯磺酸乙二醇二酯的合成

向带有干燥管的三口瓶中加入9.5g对甲苯磺酰氯，并用20mL丙酮溶解，将三口瓶放 入冰浴中，加入两滴吡啶、10mL三乙胺和2.75mL乙二醇，溶液变浑浊，有白色固体生成， TLC跟踪，20小时反应完毕，过滤后将滤液蒸干，用30mL二氯甲烷溶解，20mL×3蒸馏 水萃取，蒸干二氯甲烷层，用20mL氯仿：30mL石油醚的混合溶液重结晶，得到白色固 体，用二氯甲烷∶石油醚=1∶3为洗脱剂，硅胶柱层析，得白色产物6.56g，产率：76.7%， 熔点：123-124℃。

实施例4：

N-甲基-N-Boc-2-羟基-2-{3-[1-o-对甲苯磺酰基-2-乙氧基]-苯基}-乙胺的合成

向带有干燥管的单口瓶中加入1.09g t-Boc-去氧肾上腺素，用16mL DMF溶解，随后 加入8.34g对甲苯磺酸乙二醇二酯和0.79g无水碳酸钾粉末，磁子搅拌，在45℃下反应36 小时。反应完成后将反应液过滤，向滤液中加入60-70mL蒸馏水，有白色固体析出，静置 2-3个小时后过滤，得米白色固体，70℃下真空干燥2个小时，用10mL×3二氯甲烷重结晶 三次，所得固体用二氯甲烷为洗脱剂，硅胶柱层析，得黄色粘稠状产物0.74g，产率：56.7%。

实施例5：

N-甲基-N-Boc-2-羟基-2-{3-[1-(1-哌嗪基-2-乙氧基)-2-乙氧基]-苯基}-2-乙胺的合成

向带有冷凝管和温度计的三颈瓶中加入0.74g(1.4mmol)N-甲基-N-Boc-2-羟基 -2-{3-[1-o-对甲苯磺酰基-2-乙氧基]-苯基}-乙胺，用7mL二氧六环溶解，再加入1.35g(7 mmol)六水哌嗪，60℃下磁子搅拌，TLC跟踪，18个小时反应完毕。冷却反应液，静置分 层，分液后蒸干二氧六环层，用10mL二氯甲烷溶解，10mL×3蒸馏水萃取，水层用10mL×3 二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层并蒸干，用二氯甲烷∶乙醇=5∶1为洗脱剂，硅胶柱层析， 得到0.51g黄色粘稠状产物，产率：76.5%。

实施例6：

生物素化去氧肾上腺素（Bio-PEG-去氧肾上腺素）的合成

将0.7g双异端基聚乙二醇(NH₂-PEG-COOH)和0.1gN-羟基琥珀酰亚胺生物素酯，0.02g DMAP，和18mL无水DMSO溶液加入到封闭干燥的单口瓶中，0℃水浴中避光、搅拌反应 48小时，然后加入0.10g二环己基碳二亚胺（DCC）反应24小时。向反应液中加入0.10gN- 羟基琥珀酰亚胺，40℃水浴中避光、搅拌反应36小时。然后继续向反应液中加入0.1g N- 甲基-N-Boc-2-羟基-2-{3-[1-(1-哌嗪基-2-乙氧基)-2-乙氧基]-苯基}-2-乙胺，40℃水浴中避光、 搅拌反应36小时。将反应液过滤，将滤液滴入大量乙醚中沉降，重复三次，向得到的固体 中滴加三氟乙酸直至溶解，搅拌反应2个小时以去掉Boc保护，将反应液逐滴滴入大量乙 醚中沉降三次。将得到的固体在40℃下真空干燥24小时，称重所得最后产品0.53g，产率 88.33%。

¹H NMR(300MHz,DMSO,RT):δ7.28(t,1H),7.03(q,2H),6.40(s,1H),4.71(t,1H), 4.12-4.34(m,16),4.12(m,2H),3.51(m,87H),2.81(s,5H),2.59-2.65(m,5H),2.50-2.56(m,13H), 2.36(t,1H),1.63(m,2H),1.53(m,3H),1.34(d,9H)（图1）。

MALDI-TOF MS:C₁₂₂H₂₃₀N₆O₅₂S(n=44)calcd for[M+Na]⁺2668.19,found 2668。（图 2）。

合成的产物Bio-PEG-去氧肾上腺素使用¹H NMR和基质辅助激光解吸飞行时间质谱 （MALDI-TOF）进行表征。其氢核磁共振谱中，在δ≈3.51处发现了属于PEG连接臂的密 集峰。去氧肾上腺素中苯环上的氢的化学位移分别为δ≈7.28、7.03和6.40，生物素连接的 四个CH₂由于不与氧原子或氮原子相连，其化学位移分布在δ≈1.34。

在得到的MALDI-TOF图谱中发现了产物的K⁺和Na⁺的离子加和峰。产物的 MALDI-TOF图谱基本呈现出正态分布，最高峰为m/z=2668，计算值为2668.19，聚合度n=44。 K⁺或Na⁺离子加和峰的峰值之间相差一个环氧乙烷单元的分子量44。此外，通过计算，峰 值符合M+Na⁺/K⁺=706.89+44.05n+23(Na⁺)/39(K⁺)（n为聚乙二醇的聚合度）的公式，说 明PEG两端成功地修饰上了去氧肾上腺素和生物素，并具有很好的纯度。PEG连接臂长度 不尽相同，但对于接下来单细胞中受体的标记不会产生影响。

¹H NMR和MALDI-TOF的结果综合表明，药物小分子和生物素被PEG连接臂成功地 连接在了一起。

实施例7：

去氧肾上腺素-PEG-QDs探针溶液的配制

将链酶亲和素化的量子点（QDs-streptavidin）与Bio-PEG-Ligand按照摩尔比1：32混合 在细胞培养液中，配制成含有不同浓度去氧肾上腺素的荧光探针溶液。QDs-streptavidin与 Bio-PEG-Ligand的结合是通过量子点表面包被的链霉亲和素与PEG上的生物素的反应实现 的。生物素与链霉亲和素的离解常数达10^-15mol/L，两者一经结合便形成稳定的复合物，只 有在苛刻的条件下使之变性，如在pH 1-2的条件下，才能解离。故利用生物素与链霉亲和 素的反应连接PEG和量子点，可以保证它们形成的复合物在生理条件下稳定存在。

实施例8：

细胞膜α_1B肾上腺素受体结合去氧肾上腺素-PEG-QDs的特异性

为了证明去氧肾上腺素-PEG-QDs与α_1B-肾上腺素受体结合的特异性，我们采用如下实 验来加以验证。将HEK293α_1B分别在1.35nmol/L QDs-streptavidin（图3A和3E），45.0nmol/L 去氧肾上腺素-PEG-QDs（事先用450.0nmol/L乌拉地尔溶液孵育15min，图3B和3F），和 45.0nmol/L去氧肾上腺素-PEG-QDs（图3D和3H），将HEK293细胞在含有45.0nmol/L去 氧肾上腺素-PEG-QDs（图3C和3G）的培养液中37℃孵育15min。其中，图3A~D为明 场成像，图3E~H为荧光成像，标尺为10μm。将HEK293α_1B细胞与QDs-streptavidin共同 孵育，细胞上几乎观察不到荧光点(图3B和3F)。说明没有biotin-streptavidin桥式亲和系统 的作用，QDs-streptavidin不能结合在细胞表面上。将HEK293α_1B细胞先与α₁-肾上腺素受体 拮抗剂乌拉地尔孵育，然后再与去氧肾上腺素-PEG-QDs共同孵育，细胞上也几乎观察不到 荧光点(图3C和3G)，说明大量乌拉地尔首先占据了α_1B-肾上腺素受体的位点，而且由于 1000倍的乌拉地尔的亲和活性比较强，所以去氧肾上腺素无法将其取代。将没有表达α_1B- 肾上腺素受体的HEK293细胞与去氧肾上腺素-PEG-QDs共同孵育，细胞上也几乎观察不到 荧光点(图3D和3H)。上述实验结果说明，用PEG修饰去氧肾上腺素后，必须通过与 QDs-streptavidin耦合形成去氧肾上腺素-PEG-QDs复合物和通过去氧肾上腺素与α_1B-肾上腺 素受体的特异识别作用后，才能实现通过量子点达到标记细胞表面的α_1B-肾上腺素受体的 目的。

图4为去氧肾上腺素-PEG-QD与细胞结合特异性实验的流式细胞术（FCM）直方图， 将HEK293α_1B分别在1.35nmol/L QDs-streptavidin（Group 1），45.0nmol/L去氧肾上腺素 -PEG-QDs（事先用乌拉地尔处理过，Group 2），和45.0nmol/L去氧肾上腺素-PEG-QDs （Group 4），将HEK293细胞在含有45.0nmol/L去氧肾上腺素-PEG-QDs（Group 3）的培 养液中37℃孵育15min。FCM测定结果与TIRFM（全内反射荧光显微镜）结果相同，除 Group 4外，均无明显荧光。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并 非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出 创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。