基于复合纳米材料的乙酰胆碱酯酶生物传感器制备方法

摘要

本发明涉及一种基于复合纳米材料的乙酰胆碱酯酶生物传感器制备方法，其特征在于：多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化铵复合纳米材料的制备，进而制备了基于复合纳米材料的乙酰胆碱酯酶生物传感器。多壁碳和石墨烯具有独特的理化性质，但其难溶于一般溶剂，通过本方法可明显提高多壁碳和石墨烯在溶液中的溶解度。制备的复合纳米材料多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化铵能够明显改善电极表面的微环境，提高电极表面的电流响应，作为载体材料修饰电极，可制备较高灵敏度的电化学生物传感器。本方法制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器检测时间短，稳定性好，灵敏度高，再生能力好，并可用于实际果蔬样品有机磷农药的检测。

说明书

技术领域

本发明提供一种基于复合纳米材料的乙酰胆碱酯酶生物传感器制备方法，属于生物传感器技术领域。

背景技术

农药是用来防治农业病虫害和调节农作物生长的化学生物药剂。农药在世界农业生产中有着不可替代的作用。但同时，由于农药的不合理使用所引起的农药污染及其产生的危害后果是严重的，农产品中农药残留超标，严重威胁了人类的饮食安全。为了保护消费者的安全和健康，提高我国农产品的质量安全，增强国际竞争力，农产品的质量安全问题越来越受到关注，尤其是蔬菜中农药残留问题已经成为公众关注的焦点。为了从源头上阻止不合格的农产品进入市场，我国政府开始大力发展农药的各种检测技术，加强对农产品产地的实时监测。由于我国生产和使用的杀虫剂绝大多数品种为有机磷和氨基甲酸酯类农药，所以农药残留检测的重点也在有机磷和氨基甲酸酯类农药上。

目前，对农药残留检测的方法主要是气相色谱、液相色谱、薄层色谱、高效液相色谱及与质朴分析法结合等。这些方法虽然分析精度高，定量准确，也是国家规定的标准检测方法。但是这些方法大多需要对被分析样品进行前处理，操作复杂，费时久且费用昂贵，需要熟练的专业技术人员，不能满足现场快速检测样品的要求。我国农药残留的速测方法是酶抑制试纸法和酶抑制分光光度法（农残快速检测仪），可以实现有机磷农药及氨基甲酸酯类农药的现场快速检测，具有较好的实用性。速测卡是通过肉眼观察卡片的颜色变化，因此一般只能用于定性测量严重超标的蔬菜样品。酶抑制分光光度法也有比较广泛的应用，国内已有多种基于此原理的农药残留速测仪。分光光度法是基于吸光度值的变化进行检测的，但蔬菜水果含有的大量色素会对吸光度值造成很大影响，导致检测结果的不准确。并且上述方法存在回收率低，错检、漏检比例较高，重复性差，难以满足低残留和定量检测的要求等。

发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷，而且操作简单、响应时间短、价格低廉、灵敏度高的检测农药残留的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法。

其技术方案为：基于复合纳米材料的乙酰胆碱酯酶生物传感器制备方法，其特征在于：乙酰胆碱酯酶生物传感器的组装过程为将多壁碳(MWNTs)与石墨烯（GR）用聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶解，形成PDDA-MWCNTs-GR复合物，将此复合物滴涂到玻碳电极（GCE）上，然后滴涂乙酰胆碱酯酶（AChE），得到AChE/PDDA-MWCNTs-GR/GCE传感器。

所述的基于复合纳米材料的乙酰胆碱酯酶生物传感器制备方法，其特征在于：玻碳电极 (d=3mm) 的清洗，乙酰胆碱酯酶传感器敏感界面的构建及其过程表征，乙酰胆碱酯酶传感器工作曲线的建立，乙酰胆碱酯酶传感器性能的检测，乙酰胆碱酯酶传感器对实际样品的检测。

所述的基于复合纳米材料的乙酰胆碱酯酶生物传感器制备方法，其特征在于：所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的工作曲线为：西维因农药的浓度在0.5 - 50 ng/mL时，I% = 0.313c+20.228；西维因农药的浓度在50 - 3000 ng/mL时，I% = 0.0128c+36.185。乙酰胆碱酯酶传感器性能检测包括准确性、稳定性、可再生性，以及乙酰胆碱酯酶传感器对蔬菜样品回收率的测定。

其制备原理为：由于氨基甲酸酯类农药与乙酰胆碱酯酶具有较高的特异性结合，因此常用乙酰胆碱酯酶作为检测氨基甲酸酯类农药的分子识别元件。乙酰胆碱酯酶生物传感器是将乙酰胆碱酯酶固定在电极表面，酶催化底物乙酰胆碱水解生成胆碱和乙酸。农药在结构上与底物乙酰胆碱有些类似，它可以和乙酰胆碱的活性中心有效结合，抑制乙酰胆碱酯酶的活性。胆碱是一种电活性物质，能在一定电位下发生氧化反应，通过伏安扫描过程中硫代胆碱氧化峰的大小可以测定农药残留的浓度。通过比较有无农药时酶促反应电流信号的变化得到农药对酶的抑制率，该抑制率与农药的浓度成对应关系，便可测得有机磷或氨基甲酸酯类农药的含量。

本发明采用多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化铵复合物对玻碳电极进行修饰，与传统的方法相比，由于多壁碳和石墨烯具有良好的导电性、电化学稳定性和生物兼容性，一直被广泛应用于生物传感器，但它们的溶解性差，在普通试剂如壳聚糖、二甲基甲酰胺等溶剂中的溶解度均不理想，通过用聚二烯丙基二甲基氯化铵来溶解多壁碳和石墨烯，显著提高了它们的溶解性。且将多壁碳和石墨烯混合后，因为相互间的作用力，降低了各自溶解时的聚合、沉降作用，进一步促进了它们的溶解性。将玻碳电极用上述复合物修饰后制成的酶传感器，检测农药的精度更高，范围更广，检测限更低，可实现小型、便捷、适用于现场检测的目的。采用本发明制成的电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器可以在蔬果采收、上市前，进行农药残留的快速测定，直接对农药残留是否超标进行定量检测，为农产品安全生产与消费提供农药残留检测的技术支撑。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：基于复合纳米材料的乙酰胆碱酯酶生物传感器制备方法，其特征在于：(1) 电流型乙酰胆碱酯酶传感器制备前玻碳电极的清洗，活化和性能测试，当测试循环伏安曲线中的峰电位差在 80 mV 以下，并尽可能接近 64 mV 时，所述玻碳电极可以使用，否则要重新返回清洗步骤中，直到符合要求。(2) 配置多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化铵复合物，在清洗干净的玻碳电极上滴涂此复合物，室温下自然晾干后，用磷酸盐缓冲溶液清洗干净，滴涂乙酰胆碱酯酶，2h 后用磷酸盐缓冲溶液冲洗干净，电流型乙酰胆碱酯酶传感器制备结束，放入冰箱里 4 ℃ 条件下保存备用。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：基于复合纳米材料的乙酰胆碱酯酶生物传感器制备方法，其特征在于：(1) 配置一系列的西维因标准液，进行差分脉冲伏安扫描，求出抑制率，进一步得到上述制备的电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器的工作曲线、检测范围和检测限；(2) 将农药抑制后的电极浸入解磷定溶液中12 min，测得乙酰胆碱酯酶生物传感器的再生性能；(3) 对乙酰胆碱酯酶生物传感器的精确度和稳定性进行评价；(4) 对实际果蔬样品进行分析得出该传感器的回收率和重现性。

本发明通过制备多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化铵复合物，充分利用了多壁碳和石墨烯独特的理化性质，包括高的比表面积，优异的电导率，极高的机械强度，良好的吸附能力和优良的生物相容性。利用聚二烯丙基二甲基氯化铵溶解多壁碳-石墨烯复合物，有效提高了二者在溶液中的溶解度。且多壁碳和石墨烯混合后，它们之间的相互作用力降低了二者的聚合、沉降作用，进一步提高了它们的溶解性。多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化铵复合物能够改善电极表面的微环境，促进电化学反应中电子的传递，提高电极上的电流响应，因此可作为载体材料修饰电极，用来制备较高灵敏度的电化学生物传感器；通过羧基化的多壁碳中的羧基与乙酰胆碱酯酶中的氨基反应，形成酰胺键，将乙酰胆碱酯酶固定在电极表面，提高了生物传感器的稳定性。

所述基于复合纳米材料的乙酰胆碱酯酶生物传感器制备工艺如下：(1) 将7μL多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化铵复合物滴涂在预处理好的玻碳电极上，在室温下晾干后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗未固定上的复合物，而后用氮气小心吹干； (2) 取5 μL 乙酰胆碱酯酶溶液滴涂在上述修饰有复合膜的电极上，常温下放置2 h，然后用PH=7.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗表面，而后用氮气吹干，乙酰胆碱酯酶生物传感器制作完成，于4℃条件下保存备用。

具体实施方式

实施方式：(1) 多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化铵复合物的制备：首先将2 mg多壁碳和石墨烯的混合物（多壁碳：石墨烯 = 3:1）溶解于4 mL浓度为0.25%含有0.5M NaCl的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中超声溶解30 min。接着将上述溶液在14000 rpm下用去离子水离心分离清洗3次。最后，将上述溶液配制成浓度为1 mg/mL的溶液，每次使用前超声5 min，即得到多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化铵复合物。 (2)玻碳电极的清洗：玻碳电极修饰前，首先浸入 “piranha”溶液 (H₂SO₄:30% H₂O₂ = 3:1) 中浸泡 15 min，用水清洗干净，接下来用0.3 μm、30 nm的Al₂O₃浆在麂皮上抛光至镜面，放入超声水浴中清洗，每次5 min，重复二次，然后依次用 6 mol/L 的HNO₃、无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气小心吹干；(3) 玻碳电极的活化：彻底清洗后，电极在 0.5 mol/L H₂SO₄溶液中用循环伏安法于范围1.0V～-1.0V下扫描活化，直至达到稳定的循环伏安图为止。(4) 预处理好的玻碳电极的测试：在含有0.1 mol/L KCl的1×10^-3 mol/L K₃Fe(CN)₆溶液中进行循环伏安扫描，扫描速度50 mV/s，扫描范围为 -0.1 V～0.6 V；当所述循环伏安曲线中的峰电位差在 80 mV 以下，并尽可能接近 64 mV时，所述玻碳电极可以使用，否则要重新返回步骤 (2) 中，预处理玻碳电极，直至符合要求；(5) 将7μL多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化铵复合物滴涂在预处理好的玻碳电极上，在室温下晾干后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗未固定上的复合物，而后用氮气小心吹干；(6) 取5 μL 乙酰胆碱酯酶溶液滴涂在上述修饰有复合膜的电极上，常温下放置2 h，然后用PH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗表面，而后用氮气吹干，乙酰胆碱酯酶生物传感器制作完成，于4℃条件下保存备用。(7) 将上述制备好的乙酰胆碱酯酶传感器在含有1 mM的氯化硫代乙酰胆碱且 pH = 7.0 的磷酸盐缓冲溶液中以50 mV/s扫描速度进行差分脉冲伏安法测试，电位窗口为0.3 V~1.0 V；(8) 配置0.1 ng/mL - 4000 ng/mL的西维因标准溶液，农药测量时，将上述乙酰胆碱酯酶传感器浸入到不同浓度的农药标准溶液中12 min，然后在含有1 mM氯化硫代乙酰胆碱 (ATCl) 的磷酸盐缓冲溶液中进行差分脉冲伏安扫描，抑制率I可由下式求得：

I(%)=(i_P, control?i_P, exp)/i_P, control×100%

其中 i_P, control 和 i_P, exp 分别为测试电极未经过农药抑制和经过农药抑制后，在氯化硫代乙酰胆碱溶液中的峰电流，根据农药浓度与抑制率之间呈一定的线性关系，做出工作曲线图，得到农药浓度与抑制率之间的线性关系，以及检测限。(9) 乙酰胆碱酯酶生物传感器的精确性是通过组内偏差和组间偏差实验进行研究的。同一支电极进行五次重复测定获得组内变异系数，为 4.7%；用五支经过相同修饰的电极进行测定获得组间变异系数，为 4.1%。当电极不用时保存在 4 ℃冰箱中，根据 7 天和 30 天后电流响应的变化得到此传感器的稳定性，7 天之后电流响应值没有明显变化，30 天之后降为原电流值的 87%。(12) 将农药抑制后的传感器浸在 5.0 mM 的碘解磷定溶液中 12 min，用磷酸盐缓冲溶液冲洗干净，在1 mM ATCl 的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描，以检测其再生能力，电流响应值能恢复到原电流值的 93%。(13) 把蔬菜彻底清洗干净并用去离子水清洗 3 次，喷洒上一定浓度的农药，放置 24 h 后，用 10 mL 丙酮/0.1 M pH 7.0 磷酸盐缓冲溶液 (1/9, v/v) 做溶剂超声处理 15 min，然后再进行离心处理 (10 min, 10000 rpm)，得到的上清液用来检测实际样品的回收率，其回收率可以达到 92.3% -107%。

此种电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器检测农药残留的方法操作简单，便于掌握，且检测时间短，检测限低，检测农药范围广，稳定性好，灵敏度高，再生能力好以及对实际样品分析有较高的回收率和重现性，符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。