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法律状态信息
法律状态
2017-02-22
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07K19/00 授权公告日:20140528 终止日期:20151231 申请日:20121231
专利权的终止
2014-05-28
授权
授权
2013-05-01
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K19/00 申请日:20121231
实质审查的生效
2013-04-03
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸。
背景技术
老年人骨质疏松发病率较高,全球有2亿骨质疏松患者,并且女性多于 男性。根据世界卫生组织(WHO)的标准,美国国家健康和营养调查( NHANES Ⅲ,1988~1994年)结果表明,骨质疏松严重影响老年人生活 质量,50岁以上人群中,1/2的女性、1/5的男性在他们的一生中都会 出现骨质疏松性骨折,一旦患者经历了第一次骨质疏松性骨折,继发 性骨折的危险明显加大。中国老年人居于世界首位,现有骨质疏松症 患者9000万,占总人口的7.1%。随着社会老龄化的进程,骨质疏松症 的发病率呈上升趋势,预计到2050 年将增加到2.21亿,那时全世界 一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲,绝大部分在中国。有学者 对1995~1996年美国骨质疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年发生数进 行调查显示,每年发生骨质疏松性骨折150万次,其中椎体骨折70万次 ,腕部骨折20万次,髋部骨折30万次,其它骨折30万次。
肥胖与骨量关系临床观察表明,肥胖与骨密度(BMD)提高有关。肥胖是 骨量的保护因素,超重和肥胖的妇女绝经后较同龄非超重妇女骨量高 且骨丢失较慢。体重下降是绝经早期骨丢失的危险因素,提高体重指 数可减缓绝经后骨丢失。但肥胖也常常引发高血糖、高血压、高血脂 、高血粘、高尿酸、高胰岛素血症、冠心病、脑卒中、下肢静脉曲张 、脂肪肝、胆石症、睡眠呼吸暂停症、糖尿病、痛风症及关节炎,是 很多疾病的诱因之一。
发明内容
本发明既要降低肥胖者的体重,使之远离高血糖、高血压、高血脂、 高血粘、高尿酸、高胰岛素血症、冠心病、脑卒中、下肢静脉曲张、 脂肪肝、胆石症、睡眠呼吸暂停症、糖尿病、痛风症及关节炎等风险 ;同时又增加其骨量,避免骨质疏松的发生,而提供的一种用于治骨 质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸。
本发明用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID NO:2所示。
本发明上述用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序 列如SEQ ID NO:1所示。
本发明OGP-rhLeptin融合蛋白采用人为改造的Leptin和成骨生长肽基 因编码翻译而成。具有降低使用者体重,并防治骨质疏松的效果。
本发明用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白微生物制剂, 不产生拮抗反应,使用安全。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式,还包括各具体实 施方式间的任意组合。
具体实施方式一:本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin 融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序 列如SEQ ID NO:1所示,该核酸序列由生物工程公司合成,制成含 有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC(OGP/Obese’)。将pUC(OGP/Obe se’)载体用BamH I和EcoRⅠ双酶切出来(酶切反应体系如表1所示 ,酶切反应在37℃条件下反应10h,然后1.5%琼脂糖凝胶电泳,目的片 段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收),并用BamHI和EcoRⅠ双 酶切pGEX-6P-1(酶切反应体系如表2所示,酶切反应在37℃条件下反 应10h,然后0.6%琼脂糖凝胶电泳,目的片段用DNA GEL EXTRACTIO N KIT纯化回收);再将本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rh Leptin融合蛋白的DAN片段(OGP/Obese’)与经过双酶切的载体pGEX -6P-1的连接(连接反应体系如表3所示)。
表1
表2
表3
融合蛋白的DAN片段与载体pGEX-6P-1 16℃放置连接过夜,得到载体 pGEX-OGP/Obese’;然后将载体pGEX-OGP/Obese’转化到大肠杆菌BL 21(DE3)中,选择阳性重组子命名为大肠杆菌BL21(DE3-OGP/Obese ’)。
载体pGEX-6P-1上不含有KpnⅠ酶切位点,本实施方式合成的pGEX-OGP /Obese’均能为KpnⅠ单酶切开,说明本实施方式用于治骨质疏松和肥 胖的OGP-rhLeptin融合蛋白基因成功导入质粒pGEX-6P-1中。
随机挑取大肠杆菌BL21(DE3-OGP/Obese’)菌落37℃过夜培养,提取 质DNA,用KpnⅠ进行单酶切,并用相应的空白质粒pGEX-6P-1作为对照 ,将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序。测序工作委托生物公司 进行,大肠杆菌BL21(DE3-OGP/Obese’)内含有SEQ ID NO:1所示 DNA。
将大肠杆菌BL21(DE3-OGP/Obese’)置于LB培养基30℃环境条件下培 养18h,然后采用GST标签融合蛋白法进行蛋白的分离纯化,本实施方 式用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的纯度为98%,融合 蛋白的表达量为38.7%。
本实施方式融合蛋白(OGP-rhLeptin融合蛋白)治疗骨质疏松实验:
取雌性SD大鼠在无菌条件下摘除双侧卵巢,12周后取存活健康大鼠40 只,随机分为5组(阳性对照组1、阳性对照组2、融合蛋白实验组和阴 性对照组),每组8只。另取雌性SD大鼠切除双侧一小块脂肪,12周后 随机取存活健康大鼠8只作为假手术对照组。共计6组,分别口服以下 药物:
假手术对照组:质量浓度为0.5% 的CMC-Na溶液,灌胃剂量为5ml/kg ;
阴性对照组:质量浓度为0.5% 的CMC-Na溶液,灌胃剂量为5ml/kg;
融合蛋白实验组:质量浓度为0.5%的OGP-rhLeptin融合蛋白溶液,灌 胃剂量为5ml/kg;(获得的用于治疗骨质疏松和血栓的OGP-rhLeptin 融合蛋白用无菌水溶解)
阳性对照组1:阿仑膦酸钠(Alen)5mg/kg;
阳性对照组2:质量浓度为0.5%的OGP蛋白溶液,灌胃剂量为5ml/kg。
阳性对照组3:质量浓度为0.5%的rhLeptin溶液,灌胃剂量为5ml/kg。
连续给药三个月,处死后取大鼠股骨头,浸入4%戊二醛中固定,用牙 科金刚石锯将股骨头矢面锯开,取其一片,经清洗,10%次氯酸钠浸泡 6h,超声清洗15min,乙醇梯度脱水,乙醚浸泡,干燥,离子溅射镀膜 ,SX-40扫描电镜观察,加速电压20kV。
观察骨质疏松治疗对比实验结果,实验结果见表4,结果表明融合蛋白 实验组、阳性对照组1和阳性对照组2都具有治疗骨质疏松的作用,且 融合蛋白实验组的效果最好。
表4 骨小梁宽度的比较和骨面积(X±SD)
本实施方式融合蛋白(OGP-rhLeptin)通过静脉注射给药治疗骨质疏 松效果更佳。
本实施方式融合蛋白(OGP-rhLeptin融合蛋白)体重调节实验:
将雌性ob/ob小鼠40只,以10只为一组,共分为4组。分别注射媒介物 (0.7%生理盐水)、rhLeptin、sCT-rhLeptin融合蛋白和L-肉碱,每 天1mg、持续28天,每天记录小鼠的体重,实验结果如表5所示。本实 施方式融合蛋白体重调节效果最为明显。
表5
本实施方式融合蛋白(OGP-rhLeptin融合蛋白)毒性实验:
哈尔滨医科大学实验动物中心提供 SPF 级昆明小鼠。取60只6周龄 、雌雄各半、体质量为18±2g的小鼠作为实验对象。采用最大耐药量 给药(根据临床干扰素用量50ug/kg)。实验组注射总剂量 1mg/kg, 一次性给药0.02mL。对照组小鼠注射同等剂量生理盐水。
给药过程中小鼠表现正常,进食、饮水正常、尿粪正常、毛色顺白而 有光泽、活动自如、反应性好、小鼠之间无相互撕咬现象。连续饲养 14天和30天,小鼠均未出现死亡。
OGP-rhLeptin融合蛋白给药14天、30天后,处死小鼠,摘眼球取血, 3000r/min,离心 5 min,吸取血清,用 Beckman 全自动生化分 析仪检测主要生化指标:天冬氨酸转氨酶( AST) 、丙氨酸转氨酶( ALT) 、肌酐( CREA) 、尿素氮( BUN) 、尿酸 ( URCA) 、 总胆红素( TBIL) 、 总胆汁酸( TBA) 。血生化指标如表6所示。
表6
OGP-rhLeptin融合蛋白给药14天、30天后处死小鼠,取心、肝、脾、 肺、肾,观察脏器颜色、形态,计算各脏器系数。根据统计学样本估 计,在每组中随机抽取7只小鼠,取心、肝、脾、肺、肾 HE 染色做 病理组织学检查;取骨髓组织瑞氏染色观察细胞有无水肿、变性、坏 死等。主要脏器的病理观察结果如表7所示。
表7
实验组与对照组主要脏器心、肝、脾、肺、肾的 HE 染色及骨髓 Wright 染色对比观察发现:各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和骨髓 均无水肿、变性、坏死等异常改变。
本实验对心、脾、肺、肾的病理切片和骨髓涂片进行了观察,均未见 明显的损伤性改变。对5种脏器的脏器系数统计学分析得出各组间差异 无显著性。均说明OGP-rhLeptin融合蛋白及其代谢产物未对脏器产生 器质性损害。血生化指标检测各组间差异性无显著说明OGP-rhLeptin 融合蛋白对肝脏、肾脏无功能性损害。表明OGP-rhLeptin融合蛋白较 好的生物相容性,对小鼠无急性毒性、长期毒性。
成骨生长肽(OGP)是一种由14个氨基酸组成的小肽,具有促进体外成 骨细胞增殖、体内成骨及刺激造血等功能,并且其氨基酸序列与组蛋 白H4的C末端完全一致,与小鼠T细 胞受体β链V区部分同源,OGP能增加细胞的Ⅰ型胶原mRNA表达,增加 碱性磷酸酶活性、胶原合成和钙盐沉积。对于骨折的愈合,骨质疏松 症,急、慢性贫血病的预防和治疗及其在肿瘤放、化疗过程中刺激骨 髓细胞造血的作用。
Leptin是obese基因编码的表达产物,由白色脂肪细胞和胎盘产生的由 167个氨基酸组成的分泌蛋白,此蛋白可作为影响能量平衡的传入信号 ,其功能主要是通过影响能量摄取和支出实现减低体重的作用。本实 施方式对obese基因进行了重新的设计获得Obese’基因。Obese’基因 由105个碱基组成,编码35个氨基酸的rhLeptin(Recombinant Huma n Leptin,人重组瘦素)。
本实施方式融合蛋白在OGP和rhLeptin之间插入GlyThr,改变了多肽的 二级结构,但不仅没有使OGP和rhLeptin丧失生物活性,反而提高了其 生物活性。本实施方式在融合基因C-端添加Arg,可以去除C-末端酰胺 化的基团。本实施方式融合蛋白在大肠杆菌内的表达量也比单一的OG P和rhLeptin表达量高。
本实施方式融合蛋白在治疗骨质疏松和肥胖方面的效果也超过单一的 OGP或Leptin。本实施方式融合蛋白可通过注射或者口服的方式进行给 药,不存在首过效应。
二级结构的改变没有产生体内毒性,本实施方式融合蛋白具有安全性 ;而且二级结构的改变不影响层析和纯化,本实施方式融合蛋白具有 分离纯化容易的特点。
采用基因工程方法生产发酵制备OGP-rhLeptin融合蛋白具有生产成本 低,生物活性高,免疫原性低,活性高,半衰期长的优点。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均购买获 得,若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。
具体实施方式二:本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin 融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序 列由生物工程公司合成。
本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序 中改变了天然瘦素(Leptin)的基因,而且在OGP和Obese’之间插入 KpnⅠ酶切位点,既可以提高所编码融合蛋白的稳定性,同时也改变融 合蛋白的二级结构,使其生物性能提高。
本实施方式在融合蛋白基因两侧分别加上BamHI和EcoRⅠ酶切位点,而 且根据大肠杆菌偏爱密码子的特点,重新设计了融合基因编码碱基序 列。
机译: 融合蛋白TACI-免疫球蛋白融合蛋白,编码融合蛋白的核酸分子的用途,药物组合物和生产该融合蛋白TACI-免疫球蛋白的方法
机译: 融合蛋白,由其组成的核酸,编码这类融合蛋白的核酸分子和包含所述核酸的矢量
机译: csf-1蛋白或其同源物的生物活性片段,核酸,融合蛋白,分离的核酸,载体,宿主细胞,本发明第一方面的融合蛋白的实施方式,组成,融合蛋白的用途,治疗方法用于患有肝癌且正在接受手术的个体,用于正在接受肝移植手术的个体的治疗方法以及试剂盒