一种鮸微卫星分子标记的筛选方法

摘要

本发明涉及一种鮸微卫星分子标记的筛选方法，包括：（1）鮸基因组DNA的提取并稀释备用；（2）设计5’锚定引物及PCR扩增；（3）扩增产物的克隆及测序；（4）序列分析及微卫星特异引物设计；（5）使用上述微卫星特异引物对鮸基因组DNA进行PCR扩增；（6）使用质量浓度6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤（5）得到的PCR扩增产物；根据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型，共获得9个多态性的微卫星标记，从而获得鮸遗传变异的多态性图谱。本发明操作简单、安全、阳性率高、结果真实可靠，可快速获得鮸遗传变异的多态性图谱，主要应用于鮸遗传变异及遗传多样性分析。

说明书

技术领域

本发明属于鮸的微卫星分子标记领域，特别涉及一种鮸微卫星分子标记的筛选方法。

背景技术

微卫星DNA(Microsatellite DNA)广泛存在于真核生物基因组中，由1-6个核苷酸组成 的简单序列重复(Simple Sequence Repeats，SSR)，微卫星具有数量多、随机分布、多态性 高、重复性强、呈共显性遗传及操作简单等优点，是近年发展起来的一种新型分子标记技 术，被广泛地应用于群体遗传多样性分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及QTL 定位等领域中。

国内外学者已在许多重要水产动物中开发了微卫星标记。如：ZHAN等开发了海参的 45个多态微卫星标记；Gen等开发了鲤鱼的36个多态微卫星标记；CRISPO等开发了杂 色褶唇丽鱼的18个微卫星标记；KOIZUMI等开发了短棘九刺鱼的25个多态微卫星标记； 这些多态微卫星标记已经被广泛地应用到群体遗传结构分析、亲缘关系鉴定、遗传连锁图 谱构建等研究中。

鮸(Miichthys miiuy)属脊索动物门（Chordata），硬骨鱼纲（Osteichthyes），鲈形目 （Perciformes），石首鱼科（Sciaenidae），鮸属（Miichthys），分布在西北太平洋区，包括 中国、日本、韩国、越南等国海域。在我国沿海均有分布，但以东、黄海较多。其肉味鲜 美，营养丰富，深受国内外消费者的喜爱。其鳔俗称“鱼肚”，为高级滋补品，具有较高的 食用和药用价值。由于其生长快、自然抗逆性强、市场潜力大等优点，近年来其人工繁殖 与养殖在我国南方沿海正蓬勃发展，有望成为深水网箱养殖的优良品种。为了弄清野生鮸 群体的遗传多样性和种质资源状况，从而促进鮸的资源保护和人工养殖的可持续发展,需对 其遗传背景及多样性状况进行研究。目前，可利用的鮸微卫星标记数量非常少，严重限制 了相关遗传学研究的发展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鮸微卫星分子标记的筛选方法，该方法操作安 全、简单、阳性率高、结果真实可靠，可快速获得鮸遗传变异的多态性图谱。

本发明的一种鮸微卫星分子标记的筛选方法，包括：

（1）鮸基因组DNA的提取并稀释备用；

（2）设计5’锚定引物及PCR扩增；

（3）扩增产物的克隆及测序；

（4）序列分析及微卫星特异引物设计；

（5）使用上述微卫星特异引物对鮸不同地理群体或群体内个体的基因组DNA进行PCR 扩增；

（6）使用质量浓度6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤（5）得到的PCR扩增产物； 根据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型，共获得9个多态性的微卫星标记， 从而获得鮸遗传变异的多态性图谱。

所述步骤（1）中的鮸基因组DNA的提取包括以下步骤：剪取鮸（采集于浙江舟山市 近海海域）少量肌肉组织100-150mg，置于500μL组织提取液的中剪碎，加入终浓度为 20mg/mL的蛋白酶K和终浓度为100μg/mL的RNase A，55℃消化2-3个小时；用体积比 为25：24：1的苯酚：氯仿：异戊醇混合液抽提两次；然后用900μL的无水乙醇沉淀DNA， 经70%乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μL，并保 存在-20℃备用。

所述步骤（2）中的设计5’锚定引物包括以下步骤：设计含有兼并碱基及重复碱基的 引物，其中兼并碱基部分具有锚定作用，防止引物与模板的结合发生滑动，重复碱基部分 为2个碱基6次重复，用于与基因组DNA中的重复碱基结合；采用的5’锚定引物有：

PAC6：5’-KKDBDBD(AC)₆-3’，

PAG6：5’-KKHBHBH(AG)₆-3’，

PCT6：5’-KKVRVRV(CT)₆-3’，

PGT6：5’-KKRVRVR(GT)₆-3’；

所述的PCR扩增包括以下步骤：每个5’锚定引物以鮸基因组DNA为模板进行PCR 扩增，反应体系为25μL，包括基因组DNA模板1μL、5’锚定引物终浓度为0.8μmol/L、 Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μL；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变 性30秒、引物特异的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸 7分钟；用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增产物，并回收大小在200-750bp之间的扩增 产物。

所述步骤（3）中的克隆及测序包括以下步骤：首先是将步骤（2）得到的回收的PCR 产物连接到pMD19-T载体(TaKaRa)中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，接种到 LB（Amp⁺）培养基中生长，再利用载体通用引物和PCR扩增法鉴定阳性克隆，挑取插入 片段大小在200-750bp的阳性克隆利用ABI3730自动测序仪进行测序。

所述步骤（4）中的序列分析及微卫星特异引物设计包括以下步骤：首先利用生物学 软件DNAMAN 4.0对所获得的所有序列进行比对分析，去掉相同的序列；然后利用生物 学软件SSRHUNTER 1.3查找含有微卫星核心重复的序列；再利用BLAST方法搜索上述 含有微卫星核心重复的序列在GenBank数据库中是否存在相同的序列，并去掉那些相同的 序列；最后利用生物学软件Primer Premier 5.0对含有完整侧翼区的微卫星序列进行引物设 计；

其中，所述的鮸微卫星分子标记及其对应的特异引物序列，如下所示：

Mim1

1CATCTAATCT  TCCCTTACCT  CTGCAGCTGC  GTGTGATATC  CTTTGGGACA

AAAAACGTAG

61TGGGGAGAAA  ACTTCAGCTT  CAACAGCACT  GCTACAGATC  CTCACTTTCT

AGCTCTTTCC

121AAGGTAACGT ATCTTTCAGC CCAAACACAC ACACGCACTT CAGTCCACTA

TGACAGCGCT

181CTGTCTACCT  GCGTGAGCTT  GTGTAAATGT ATCCTAGATG  GTGATGAATA

GTGGTGAGTG

241AAAGCAGAAT ACT

Mim1标记的特异引物序列:

F:CATCTAATCTTCCCTTACCTCTG

R:AGTATTCTGCTTTCACTCACCAC

Mim2

1AGAAAGAAGA GTCCGACCAC  CAACCGGGTT  TTGATCAGCT  GTTGTTGGAG

TTTGCGCCGG

61AGTGATGTTC CTGCGCTCTT AGCGAGAGGA GAAACAGACG  GAGAGAGAGA

GAGGGAGAGA

121GACAGAGAGA GAGAGGGAGA GAGAGGAGGT GAAGACGCCG GTTTGTTGTT

GTCGCCTTGT

181CCGCTGGACT GACATCGCAT GGGGACATGA ACAGTGTGGA TC

Mim2标记的特异引物序列:

F:AGAAAGAAGAGTCCGACCACCAACC

R:GATCCACACTGTTCATGTCCCCATG

Mim3

1GGAAGGACAG GGAGAAAGAA AATATGGAAG GAAGGAAGGA AGGAAGGAAG

GAAGGAAGGA

61AGGAAGGAGG GAGGGGAAGA GAGTCACGCT GTGTGGCATT AATCCGACTG

ACCCGGATTA

121TTTATATCTA ACAGTTATTA ACATTTTATG CCA

Mim3标记的特异引物序列:

F:GGAAGGACAGGGAGAAAGAAA

R:TGGCATAAAATGTTAATAACTGTT

Mim4

1GTTTGAAAAT  GGAGTTGGCT  GCGGTGTTTATATGAGCTGT  GGTTGCCTAT

GAGTGTGTGT

61GTCTGTGTGT  GTGTGCGGGT  GTTTGGCACC  AGACTGGAGG  GTTGCTGTGG

GTCCACGCTG

121GCGTAGTTGG GGCTGGAA

Mim4标记的特异引物序列:

F:GTTTGAAAATGGAGTTGGCTGCG

R:TTCCAGCCCCAACTACGCCAG

Mim5

1GCAAAGAGAA GAGCCAAAGA AAAAAAAAAA AGAAAGAAGA GTCCGACCAC

CAACCGGGTT

61TTGATCAGCT  GTTGTTGGAG  TTTGCGCCGG  AGTGATGTTC  CTGCGCTCTT

AGCGAGAGGA

121GAAACAGACG GAGAGAGAGA GAGGGAGAGA GACAGAGAGA GAGAGGGAGA

GAGAGGAGGT

181GAAGACGCCG  GTTTGTTGTT  GTCGCCTTGT  CCGCTGGACT  GACATCGCAT

GGGGACATGA

241ACAGTGTGGA TCCAGCCTCT AACAAACTGT TGACTTTCAA TCAGCGG

Mim5标记的特异引物序列:

F:GCAAAGAGAAGAGCCAAAGAAAA

R:CCGCTGATTGAAAGTCAACAGTT

Mim6

1CAGGTCAGAT  GAGTGCAGCG  ACGGGCGAGC  GAGCAACTGT  CTGCATTACA

GAGAGAGAGA

61AAAGAGAGCG AGCAATGGAG  CATGGAGATG  CGTGTGTGTG  TGTGTGTGTG

TGTGTGACCT

121TGTCTGGCTG TGTGTGCGTG AGCCAGAGAG AGAGACGGCG AGTGTAGCGG

GCGAGCGAGC

181GAATAGGAAA GGGGAGCCTT GAAACCGTCC TGACT

Mim6标记的特异引物序列:

F:CAGGTCAGATGAGTGCAGCGAC

R:AGTCAGGACGGTTTCAAGGCTC

Mim7

1TCTCGGCAGC  CCCTGAATGT  AAACAGATTA  TTAGATTAGT  GGCCATGAGA

AGGAGACGAC

61TGAAGAGAGG  ACTGTCACTC  TGTCTCCTTC  CCTCCGTCTC  TCTCTCTATC

TCTTTTTCTT

121TCTGTCAGTG  CTGATGGGGC  TGTGTCCTTT  TTCTTTGTGA  TTTAGCTGGT

GCTGGTGAAA

181CCGGAGAAAC TTCTCGCTGG ACCGAGGAGG AGATGGAGGT CGCCAA

Mim7标记的特异引物序列:

F:TCTCGGCAGCCCCTGAATGTAA

R:TTGGCGACCTCCATCTCCTCCT

Mim8

1GTGAGGGGAA TGGCACCAAA CGAGGAGGAG GGGGAGGTGA AGAAGCTGAA

ATAGGCAGTG

61TGAATCATTG  CTGTCCCGTT  TCCACATGCT  AATAAGAGCT  CTGTAACACG

GACACACGCA

121CACACACAGG  CGCTCACACA  CATTCTGACA  GCTAGAAAGC  CTTGCTGTAC

AAGCGTTGTC

181TCACTTTGGT  GAGAGGGACA  TTTATGCACA  GAGCTGTCAA TAGGAGGAGG

ACTTACTTAA

241TAAAGAACAC  AAAGAAATTA  GTGTAGCTCA  CTCTCACACA  CACACACACA

CACACATACA

301TGCACACACA AACACACACA AACAGCCCCC  AGCGTTGCTG CTTATTTGCTA

TTATTGTTTT

361GCCGTGTTGG TGGAG

Mim8标记的特异引物序列:

F:GTGAGGGGAATGGCACCAAACG

R:CTCCACCAACACGGCAAAACAA

Mim9

1TACAAGCGTT  TGTGCTATAT  GTAGTGTGTG  TGTGTGTGTG  CATATATGTG

TGGGAGGTGT

61AGAGGAGAGT TTTATCTGTA AAAGGGGGGA AAAAAGACCA CCCAGGAGAG

GTGACAGGAG

121AGTAATTCTT ATTCAGAGTA  AATTTCTTGA  GAGCACCACA  CACACCACTA

CTACCCCACC

181TTC

Mim9标记的特异引物序列:

F：TACAAGCGTTTGTGCTATATGTA

R：GAAGGTGGGGTAGTAGTGG

本发明的微卫星核苷酸序列和引物序列，其中Mim1为253个核苷酸、Mim2为222 个核苷酸、Mim3为153个核苷酸、Mim4为138个核苷酸、Mim5为287个核苷酸、Mim6 为215个核苷酸、Mim7为226个核苷酸、Mim8为375个核苷酸、Mim9为183个核苷酸。

所述步骤（5）中的使用引物对鮸不同地理群体或群体内个体的基因组DNA进行PCR 扩增的反应体系为25μL，包括基因组DNA模板1μL、上下游引物终浓度均为0.4μmol/L、 Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μL；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变 性30秒、引物特异的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，35个循环；最后于72℃延伸 7分钟。

所述步骤（6）中的使用质量浓度6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物： 将PCR产物95℃变性后，上样约3μL于质量浓度6%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳；经染 色、显色后获得了鮸的PCR产物电泳图像。

本发明包括锚定引物的设计，阳性克隆的鉴定及测序，序列分析及微卫星引物的设计， 最终获得9个扩增条带清晰的多态性的微卫星标记，将这9个多态性标记用于鮸不同地理 群体或群体内不同个体的遗传学分析，获得鮸的遗传变异的多态性图谱。

有益效果

（1）本发明的方法操作简单、快速、准确、灵敏，一周内可完成一个过程，大大提高了 筛选微卫星标记的效率；

（2）按照本发明的方法，一次可获得几百、甚至上千条微卫星序列，并且所获得的大多 数的微卫星序列均可设计引物，本发明的筛选方法主要应用于鮸遗传变异及遗传多样性分 析。

附图说明

图1筛选的引物Mim6对鮸30个个体的检测图谱，其中M是分子量标准，1-30为鮸个体。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。

实施例1

1、鮸基因组DNA的提取

剪取鮸少量肌肉组织(约100-150mg)，置于500μL组织提取液(10mmol/L Tris-Cl,pH 8.0; 100mmol/L EDTA,pH8.0;100mmol/L NaCl;0.5%SDS)的中剪碎，加入蛋白酶K（终浓度 为20mg/ml）和RNaseA(终浓度为100μg/mL)，充分混匀，55℃消化2-3个小时至澄清； 用苯酚：氯仿：异戊醇混合液(体积比为25:24:1)抽提两次；然后用900μL的无水乙醇沉淀 DNA，经70%乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于50μLTE(10mmol/L Tris-HCl,pH 8.0; 10mmol/L EDTA,pH 8.0)中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μL，并保存在-20℃备用。

2、设计5’锚定引物及PCR扩增

设计含有兼并碱基及重复碱基的引物，其中兼并碱基部分具有锚定作用，防止引物与 模板的结合发生滑动，重复碱基部分为2个碱基6次重复，用于与基因组DNA中的重复 碱基结合；采用的引物有PAC6：5’-KKDBDBD(AC)₆-3’，PAG6：5’-KKHBHBH(AG)₆-3’， PCT6：5’-KKVRVRV(CT)₆-3’，PGT6：5’-KKRVRVR(GT)₆-3’，由生物公司合成。

PCR扩增是每个5’锚定引物以鮸基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25μL， 包括基因组DNA模板1μL、5’锚定引物终浓度为0.8μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、 dNTP终浓度为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水 至总体积为25μL；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温 度退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟；用1.5%的琼脂糖凝 胶电泳检测预扩增产物，并回收大小在200-750bp之间的扩增产物。

3、T载体连接

将上述回收的PCR扩增产物连接到T载体中，连接体系为10μL,包括solution I 5.0μL、 pMD19-T载体(TaKaRa)1.0μL及PCR扩增产物4.0μL，4℃过夜。

4、克隆、测序

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，使用载体通用引物(M₁₃-47：5’–CG CCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC–3’；M₁₃-48：5’–AGCGGATAACAATTTCACACAGGA –3’)对克隆进行PCR鉴定。PCR反应体系为25μL，包括菌液1μL、上下游引物终浓度均 为0.4μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶1U、 1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μL；PCR反应程序为：94℃预变性5分 钟，94℃变性30秒、55℃退火50秒、72℃延伸50秒，25个循环；最后于72℃延伸7分 钟。最后，挑选插入片断长度在200-750bp之间的阳性克隆，用ABI3730测序仪进行测序。

5、微卫星引物设计。

首先使用软件SSRHUNTER 1.3查找含有微卫星核心重复的序列，查找标准为：2-5 个碱基重复单元、重复次数≥4次。然后利用生物学软件Primer Premier 5.0对含有完整侧翼 序列的微卫星序列进行引物设计。引物应符合以下标准：(1)引物长度在18-25bp之间；(2) GC含量在40-60%之间；(3)退火温度在50-60℃之间；(4)PCR产物的预期长度在100-400bp 之间。引物信息详见表1。

6、微卫星标记的PCR扩增

利用上述微卫星引物对鮸群体进行PCR扩增，其反应体系为25μL，包括基因组DNA 模板1μL、上、下游引物终浓度均为0.4μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度 为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶1U、1×PCRbuffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μL。 PCR反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温度(表1)退火50 秒、72℃延伸50秒，35个循环；最后于72℃延伸7分钟，4℃保存备用。

7、PCR产物的电泳检测

向PCR产物中加入约12.5μL的变性剂(98.0%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.25%溴酚蓝， 0.25%二甲苯氰)，于95℃变性5分钟，快速冷却；然后上样约3μl于质量浓度6%的变性 聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。分子量标准为pBR322/MspI,电泳液为1×TBE，恒压 35-40V/cm，电泳约1-1.5小时。

电泳完成后进行染色和显色，其操作过程为：首先用70%乙醇固定10分钟，蒸馏水 洗5分钟；然后用1.5‰硝酸银染色10分钟，蒸馏水洗8秒钟；最后用显色液(2%的 NaOH+4‰的甲醛)显色至带型清晰，再用蒸馏水将凝胶冲洗干净，便获得了鮸遗传变异的 多态性图谱。

表1本发明所筛选的鮸的9个微卫星标记