药品中盐酸可乐定的含量和含量均匀度的测定方法及其应用

摘要

本发明涉及一种药品中盐酸可乐定的含量和含量均匀度的测定方法及其应用。本发明的药品中盐酸可乐定的含量测定方法，包括下列步骤：将药品制备成供试品溶液；采用阳离子固相萃取小柱对样品进行纯化与富集；用高效液相色谱进行含量测定。采用本发明的方法检测盐酸可乐定的含量，具有理想的分离效果，专属性强、精密度、重复性和准确度良好，为含量和含量均匀度的测定提供了可靠的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种药品特定成分的测定方法及其应用，特别是涉及一种药品中盐酸可乐定 的含量和含量均匀度的测定方法及其应用。

背景技术

盐酸可乐定为α受体激动剂，具有中枢降压作用，是珍菊降压片中主要有效成分之一（分 子结构式和UV光谱见图1），但其每片含量仅30μg，含量极低，又受到到野菊花相关成分的 干扰，其测定非常困难。随着人们安全意识的不断强化，SFDA对药品监管力度逐年加大， 在标准增加盐酸可乐定的含量或含量均匀度控制指标已是大势所趋，因此建立专属、灵敏、 准确的含量和含量均匀度测定方法成为产品质量控制和工艺评价需要首先解决的技术难题。 由于盐酸可乐定含量极低，且只在紫外末端有吸收，再加上野菊花相关成分严重的阴性干扰， 使其定量检测异常困难。文献中报道的含量和含量均匀度测定方法基本都采用了复杂的溶剂 萃取和pH调节等操作进行样品前处理来去除干扰杂质，其操作步骤繁琐，方法准确度和可 操作性存在较大问题，不适用于日常检测，因此一直未能被纳入法定标准[。随着固相萃取 （SPE）技术在越来越多的应用于中药质量控制（陈雯，方宝霞，李鹏，等.固相萃取技术在 中成药质量控制中的应用[J].医药导报，2009，28(6):764-766），许谙等将C18固相萃取小柱 用于珍菊中盐酸可乐定的测定的样品前处理，但除杂效果仍不够理想。高苏亚（高苏亚，李 华，曹晓芹.区带毛细管电泳法测定珍菊降压片有效成分的含量[J].时珍国医国药，2008， 19(11):1656-2567）、Yun-qiu（Su,S.-m.，Yu,Y.-q.Simultaneous Determination of Clonidine  Hydrochloride,Hyrochlorothiazide,and Rutin in Zhenju Jiangya Tablet by Capillary  Electrophoresis[J].Journal ofChinese Pharmaceutical Sciences，2005，14(3):173-175.）、丁飞等 （丁飞，陈黎明.毛细管电泳-安培检测法同时测定中成药珍菊降压片中有效成分[J].理化检验 -化学分册，2008，44(5):430-432）采用毛细管电泳技术尝试同时测定珍菊降压片中的盐酸可 乐定、盐酸可乐定、芦丁，取得较好的效果，由于仪器的普及问题，该方法难以在日常检验 中推广。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的缺陷，提供一种药品中盐酸可乐定的测定方法及 其应用。

本发明首先提供了一种药品中盐酸可乐定的含量测定方法，包括下列步骤：

1）将药品制备成供试品溶液；

2）固相萃取：采用阳离子固相萃取（SPE）小柱对样品进行纯化与富集；

3）用高效液相色谱（HPLC）进行含量测定。

将药品制备成供试品溶液的方法包括下列步骤：将药品与提取溶剂混匀后，超声5-60分 钟，固液分离后获得供试品溶液。超声时间较佳为5-20分钟，最优选15分钟。

如所述药品为固体制剂，可在药品与提取溶剂混和前，先将药品粉碎，或者在药品与提 取溶剂混合后，采用加入玻璃珠，在震荡器上震荡破碎的方法进行样品前处理，

较佳的，所述提取溶剂可为水或酸水溶液，配置酸水溶液的酸可以是盐酸、磷酸、醋酸、 甲酸等常用酸，酸水溶液的pH值范围为1.0~7.0，优选0.1mol/L盐酸水溶液。

所述供试品溶液pH为1.0~7.0。

所述固相萃取依次包括下列步骤：固相萃取小柱的活化、平衡、上样、淋洗和洗脱。

优选的，所述阳离子固相萃取小柱为SCX（以苯磺酸键合硅胶为填充剂）固相萃取柱。

所述阳离子固相萃取小柱的填充剂重量为50-1000mg。

固相萃取小柱的活化方法可为常规，如用甲醇活化。

优选的，固相萃取小柱平衡采用水或pH为1.0~7.0的酸水溶液。最优选0.1mol/L盐酸水 溶液，该平衡液可确保目标成分的完全电离和充分交换。

淋洗可采用常规试剂。优选的，淋洗所用淋洗液为水和任意比例的甲醇水溶液，最优选 水和体积百分比50%的甲醇水溶液，此选择可在保证除去杂质的前提下减少有机溶剂的用量， 更加环保。

优选的，固相萃取的洗脱用洗脱液为氨水-甲醇水溶液，所述氨水-甲醇水溶液中，氨水 （分析纯，含量为25~28%）的体积百分比浓度为0.5~5%，甲醇的体积百分比浓度为50~99.5%。 最优的，氨水的体积百分比浓度为2%，甲醇的体积百分比浓度为50%，其可在保证脱附效 果的前提下，减少了其它低极性杂质的洗脱，有利缩短检测时间。

固相萃取的流速对萃取效果影响不大，可采用常规的流速：如0.5-3.0ml/min。

优选的，洗脱后收集的洗脱液用酸液定容。酸液定容可使游离的可乐定完全成盐，避免 测定时出现峰拖尾。所述酸液优选盐酸水溶液。

上样体积及各试剂使用的体积可根据小柱的规格确认。

采用反相高效液相色谱进行测定。

优选的，高效液相色谱时，采用的色谱柱为C18色谱柱。

优选的，高效液相色谱以乙腈-磷酸水溶液系统为流动相。

所述乙腈-磷酸水溶液系统中，乙腈的体积百分数为5-30%，所述磷酸水溶液中的磷酸重 量百分比浓度为0.01~0.5%。最优选的，所述乙腈-磷酸水溶液系统中，乙腈与磷酸水溶液的 体积比为10:90，磷酸水溶液中的磷酸重量百分比浓度为0.05%。

高效液相色谱法测定时，流动相的流速为常规流速。

高效液相色谱法测定时，柱温可为20-40℃，最优选为30℃。

高效液相色谱法测定时，检测波长可为200-230nm，最优选220nm。

所述药品中盐酸可乐定的含量测定方法中，可采用相同条件测定对照品溶液中盐酸可乐 定的含量，并按外标一点法计算供试品溶液中盐酸可乐定的含量。

对照品溶液的配制采用与供试品提取相同的溶剂。

在获知供试品溶液中盐酸可乐定的含量后，将很容易折算出药品中盐酸可乐定的含量。

本发明的盐酸可乐定的含量测定方法中，各项优选条件可以随意组合搭配。

本发明所述药品中盐酸可乐定的含量测定方法可用于药品的质量检测，尤其适用于珍菊 降压片中盐酸可乐定的含量测定或用于珍菊降压片中盐酸可乐定的含量均匀度测定。

本发明还进一步提供了一种珍菊降压片的质量检测方法，包括采用前述方法检测珍菊降 压片中盐酸可乐定的含量，以及检测珍菊降压片中的盐酸可乐定的含量均匀度。

本发明用于检测珍菊降压片中盐酸可乐定的含量均匀度时，可以珍菊降压片与提取溶剂 和玻璃珠共同置于提取容器中撞击破碎后，再进一步超声提取制备供试品溶液，玻璃珠的用 量可以根据提取容器的大小和提取溶剂的用量灵活调整，当采用100mL以下的提取容器、 25mL提取溶剂时，玻璃珠的最佳用量为15g。

由于盐酸可乐定在珍菊降压片中含量仅30μg/片，由于含量低，活性强，容易出现安全 性问题，易因含量均匀度不合格而影响临床疗效，因此本发明认为，有必要将其含量均匀度 考察作为一项质量检测指标引入质量检测方法中，必须严格控制其在制剂中的含量和含量均 匀度。

进一步的，在检测珍菊降压片中的盐酸可乐定的含量均匀度时，取数片供试品，按前述 方法分别检测每片供试品中盐酸可乐定的含量，按含量均匀度检查法计算含量均匀度。

本发明采用SPE-HPLC联用技术，有效消除了盐酸可乐定测定时的阴性干扰，解决了微 量有效成分盐酸可乐定的定量难题，并通过对方法的优化使操作过程更加简捷高效，显著改 善了传统测定方法的专属性、灵敏度、重现性和准确性，为珍菊降压片中盐酸可乐定的质量 控制提供了可靠的技术手段，让珍菊降压片中盐酸可乐定的含量和含量均匀度的日常检测成 为可能。

附图说明

图1盐酸可乐定的分子结构式和UV光谱。

图2实施例1中对照品溶液、供试品溶液以及上述阴性对照溶液的盐酸可乐定含量测定 HPLC图谱

图3实施例2盐酸可乐定含量均匀度测定图谱

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以 存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明。 而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方 法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技 术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1珍菊降压片中盐酸可乐定的含量测定

1.色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)

流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液（10：90）

流速：1mL/min

柱温：30℃

检测波长：220nm

2.溶液的制备

提取方法的考察：根据盐酸可乐定的溶解性质，选用0.1mol/L盐酸作为提取溶剂，选 用超声法进行提取。比较了0、5、10、15、20min等不同超声时间的提取效果，结果表明超 声5min基本就以提取完全，为保证提取效果，确定超声时间为15min。在超声时加入一定量 玻璃珠主要时避免提取过程中的样品团聚。

对照品溶液的制备：取盐酸可乐定对照品适量，用0.1mol/L的盐酸溶液溶解制成120 μg/mL的对照品储备液，精密量取对照品储备液1.0mL于100mL量瓶中，用0.1mol/L的盐 酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得1.2μg/mL的对照品溶液。

供试品溶液的制备：取SCX固相萃取柱（200mg/6mL），依次用甲醇、0.1mol/L盐酸各 5mL淋洗，备用；取20片珍菊降压片研成细粉，取细粉0.25g，精密称定，置三角烧瓶中， 加入Φ4~5mm玻璃珠15g，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25mL，密塞，超声提取15min，摇 匀，滤过，收集续滤液备用；精密量取续滤液5.0mL上于SCX固相萃取柱，待溶液流干后， 依次用水、50%甲醇各5mL淋洗（抽干），弃去淋洗液，再用含2%氨水的50%甲醇溶液5mL 洗脱（抽干），收集洗脱液于10mL量瓶中，加入3滴浓盐酸，再用0.1mol/L盐酸溶液定容， 摇匀，即得供试品溶液。

阴性对照溶液制备：取缺盐酸可乐定阴性对照颗粒适量，研成细粉，取细粉0.25g，按“供 试品溶液制备”方法操作，即得阴性对照溶液。

SPE小柱的选择：不同品牌、不同基质的固相萃取小柱对样品处理能力有一定的差异， 研究中对比了Cleanert SCX-SPE（200mg/6mL）、Cleanert PCX-SPE（60mg/3ml）、CNWBOND SCX（500mg/3ml）、CNW Poly-Sery MCX（60mg/3ml）、Plexa PCX（200mg/6ml）等5种小 柱，结果表明Cleanert SCX-SPE（200mg/6mL）吸附、解析性能最好，故选其用于样品的前 处理。

固相萃取方案的考察：固相萃取操作，通常包括小柱活化、平衡、上样、淋洗、洗脱等 过程，涉及到多个步骤和多种溶剂，本研究对每一步操作均进行优化，最终形成供试品溶液 制备中的萃取方案：上样前采用0.1mol/L盐酸平衡小柱，主要是确保目标成分的完全电离和 充分交换；采用水和50%甲醇淋洗在保证除杂效果的前提下，减少了有机溶剂的用量，更加 环保；采用含2%氨水的50%甲醇洗脱目标成分，在保证脱附效果的前提下，减少了其它低 极性杂质的洗脱，有利缩短检测时间；洗脱液加入酸液定容，主要是是游离的可乐定完全成 盐，避免测定时出现峰拖尾；各步溶剂用量选用5ml是根据小柱规格确定的最佳洗脱体积。 3.测定法

精密量取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法（中 国药典2010版附录VI D）测定，记录峰面积，按外标一点法计算供试品中盐酸可乐定的含量。

4.方法学验证

4.1专属性和系统适用性试验

取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20μL，注入液相色谱仪，依法测定，记录 色谱图和DAD光谱。阴性对照色谱中，盐酸可乐定峰对应保留时间处无干扰峰。供试品色 谱中，理论塔板数以盐酸可乐定峰计算，在8000以上，分离度不小于2.0，峰纯度不小于998。 表明该方法专属性和系统适用性满足含量测定要求。见图2。

4.2样品溶液稳定性

取同一份供试品溶液，分别在制备后0h、4h、8h、12h、24h进样检测，以测得的盐酸可 乐定峰面积计，RSD为0.14%。结果表明，供试品溶液在24h内稳定。见表1。

表1样品溶液稳定性考察结果

4.3线性关系考察

精密量取对照品溶液（浓度：1.234μg/mL）1μL、5μL、10μL、20μL、30μL、60μL、100μL， 注入液相色谱仪，依法测定。以对照品进样量（ng）为横坐标，以盐酸可乐定峰面积为纵坐 标，绘制标准曲线，回归方程为y=2.9662x+0.0485，r=0.99999。结果表明在1.234~123.4ng 的进样范围内，该方法线性关系良好。见表2。

表2线性关系考察结果

4.4仪器精密度考察

取对照品溶液20μL，重复进样6次，以测得的盐酸可乐定峰面积计，RSD值为0.08%。结 果表明，仪器精密度良好。见表3。

表3仪器精密度试验结果

4.5重复性实验

取同一批珍菊降压片供试品，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试液，依法测定， 以测得的供试品中盐酸可乐定含量计，RSD为0.71%。结果表明，该方法重复性良好。见表 4。

表4重复性试验结果

4.6中间精密度实验

取同一批珍菊降压片供试品，分别考察不同时间、不同人员、不同仪器三个变动因素下 的中间精密度。以测得的供试品中盐酸可乐定含量计，不同时间中间精密度RSD值为0.97%， 不同人员中间精密度RSD值为0.57%，不同仪器中间精密度RSD值为0.29%。结果表明，该 方法中间精密度良好。见表5。

表5中间精密度试验结果

4.7回收率实验

取盐酸可乐定对照品储备液（123.4μg/mL），用0.1mol/L的盐酸溶液分别稀释成浓度为 0.987μg/mL、1.234μg/mL、1.481μg/mL的对照品溶液；精密称取缺盐酸可乐定的阴性对照 细粉9份，每份0.25g，精密称定，分别置1~9#磨口三角烧瓶中；1~3#分别精密加入0.987μg/mL 对照品溶液25mL，4~6#分别精密加入1.234μg/mL对照品溶液25mL，7~9#分别精密加入1.481 μg/mL对照品溶液25mL，按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，依法测定，计算回 收率及其RSD值。见表6。

表6回收率试验结果

5.样品测定

取3批珍菊降压片大生产样品，按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，依法测定， 并计算含量。见表7。

表7三批珍菊降压片含量测定结果

实施例2珍菊降压片中盐酸可乐定的含量均匀度测定

1色谱条件

同实施例1。

2溶液的制备

对照品溶液的制备：同实施例1。

供试品溶液的制备：取SCX固相萃取小柱（200mg/6mL），依次用甲醇、0.1mol/L盐酸 各5mL淋洗，备用；取珍菊降压片1片，置磨口三角烧瓶中，加入Φ4~5mm玻璃珠15g，精 密加入0.1mol/L盐酸溶液25mL，密塞，振摇至片芯完全破碎后，超声提取15min，摇匀，滤 过，收集续滤液备用；精密量取续滤液5.0mL上于SCX固相萃取小柱中，待溶液流干后，依 次用水、50%甲醇各5mL淋洗（抽干），弃去淋洗液，再用含2%氨水的50%甲醇溶液5mL 洗脱（抽干），收集洗脱液于10mL量瓶中，加入3滴浓盐酸，再用0.1mol/L盐酸溶液定容， 摇匀，即得供试品溶液。

有文献在测定珍菊降压片含量均匀度时，采用玻璃棒捣碎的方法进行样品破碎，此方法 费时费力，可操作性差，研究中采用加入玻璃珠，在震荡器上震荡破碎的方法进行样品前处 理，大大提高了方法的可操作性，便于日常检测。

阴性对照溶液制备：取缺盐酸可乐定阴性对照颗粒适量，研成细粉，取细粉0.25g，按“供 试品溶液制备”方法操作，即得阴性对照溶液。

3测定法

取供试品10片，分别按“供试品溶液制备”制备供试品溶液；精密量取对照品溶液和供 试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法（中国药典2010版附录VI D）测定， 记录峰面积，按外标一点法计算每片供试品中盐酸可乐定的含量；按《中国药典》2010版二 部附录X E含量均匀度检查法计算含量均匀度。

4方法学验证

4.1专属性和系统适用性试验

取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20μL，注入液相色谱仪，依法测定，记录 色谱图和DAD光谱。阴性对照色谱中，盐酸可乐定峰对应保留时间处无干扰峰。供试品色谱 中，理论塔板数以盐酸可乐定峰计算，在8000以上，分离度不小于2.0，峰纯度不小于998。 表明该方法专属性和系统适用性满足含量测定要求。见图3。

4.2样品溶液稳定性

取同一份供试品溶液，分别在制备后0h、4h、8h、12h、24h进样检测，以测得的盐酸可 乐定峰面积计，RSD为0.14%。结果表明，供试品溶液在24h内稳定。(见表8)

表8样品溶液稳定性考察结果

4.3线性关系考察

同实施例1。

4.4仪器精密度实验

同实施例1。

4.5重复性实验

取同一批珍菊降压片供试品，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试液，依法测定， 以测得的供试品中盐酸可乐定含量计，RSD为0.44%。结果表明，该方法重复性良好。(见 表9)

表9重复性试验结果

4.6中间精密度实验

取同一批珍菊降压片供试品，分别考察不同时间、不同人员、不同仪器三个变动因素下 的中间精密度。以测得的供试品中盐酸可乐定含量计，不同时间中间精密度RSD值为0.40%， 不同人员中间精密度RSD值为1.27%，不同仪器中间精密度RSD值为0.44%。结果表明，该 方法中间精密度良好。(见表10)

表10中间精密度试验结果

4.7回收率实验

取盐酸可乐定对照品储备液（123.4μg/mL），用0.1mol/L的盐酸溶液分别稀释成浓度为 0.987μg/mL、1.234μg/mL、1.481μg/mL的对照品溶液；精密称取缺盐酸可乐定的阴性对照 细粉9份，每份0.25g，精密称定，分别置1~9#磨口三角烧瓶中；1~3#分别精密加入0.987μg/mL 对照品溶液25mL，4~6#分别精密加入1.234μg/mL对照品溶液25mL，7~9#分别精密加入1.481 μg/mL对照品溶液25mL，按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，依法测定，计算回 收率及其RSD值。(见表11)

表11回收率试验结果

5样品测定

取3批珍菊降压片大生产样品，按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，依法测定 含量均匀度。见表12。

表12三批珍菊降压片含量均匀度测定结果

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当 指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干 改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不 脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修 饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实 施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。